Abstract
Ekstrakromosomale sirkulære DNA-molekyler (eccDNAs) er vanlige genetiske elementer i Saccharomyces cerevisiae, og er rapportert i andre eukaryoter også. EccDNAs bidra til genetisk variasjon blant somatiske celler i flercellede organismer og til utviklingen av encellede eukaryoter. Følsomme metoder for å påvise eccDNA er nødvendig for å avklare hvordan disse elementene påvirker genom stabilitet og hvordan miljømessige og biologiske faktorer indusere dannelsen i eukaryote celler. Denne videoen presenterer en følsom eccDNA-rensing metode kalt Circle-sekv. Metoden omfatter kolonne rensing av sirkulært DNA, fjerning av gjenværende lineær kromosomalt DNA, rullende sirkel forsterkning av eccDNA, dyp sekvensering, og kartlegging. Omfattende eksonuklease-behandling var nødvendig for tilstrekkelig lineær kromosomalt DNA degradering. Den rullende sirkel forsterkning stegine-høyde. normal; "> φ 29 polymerase beriket for sirkulært DNA i løpet av lineære DNA Validering av Circle-Seq metoden på tre S. cerevisiae CEN.PK populasjoner av 10 10 celler oppdaget hundrevis av eccDNA profiler i størrelser større enn 1 kilobase . Gjentatte funn av ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 gener på sirkulært DNA i både S288C og CEN.PK antyder at DNA circularization er konservert mellom stammene ved disse loci. i sum har Circle-Seq metode bred anvendelse for genom-skala screening for eccDNA i eukaryoter så vel som for detektering av spesifikke eccDNA typer.
Introduction
Oppdager tidlig eller forbigående kromosom forsterkning er vanskelig fordi det krever å identifisere endringer i enkelt DNA-molekyler i store populasjoner av celler. Kromosomkopinummervariasjoner (CNVs) er vanligvis oppdaget godt etter sin etablering, slik at bare den endelige CNV struktur som bevis av mekanismen som genererte variasjon 1,2. Oppdager og utvinne ekstrakromosomalt sirkulært DNA (eccDNA) i tidligere stadier av CNV dannelse kan belyse pågående prosesser i genomisk rearrangements.
Tidligere har de novo oppdagelse av eccDNA var ved elektronmikroskopibilder 3, Giemsa-farging av metafase-kromosomer 4 eller to-dimensjonal gelelektroforese 5. Disse metodene gir liten eller ingen informasjon om sekvensen av det sirkulære DNA. Målrettede teknikker så som Southern blotting 6,7, invers PCR 8, eller fluorescens in situ hybridiseringn 9 dokumentere bare om bestemte eccDNA elementer. Ingen av disse metoder gir sekvensen av alle eksisterende eccDNA typer i en cellepopulasjon.
Genomisk divergens i en pool av celler kan være preget av genomsekvensering og / eller flislegging arrays 10,11. Detektere en delesjon eller forsterkning ved konvensjonelle DNA-rensemetoder krever vanligvis at en mutert allel representere minst 0,1-1% av cellepopulasjonen 12,13. Asentrisk eccDNAs er forventet å bli enda mer forbigående i en cellekultur på grunn av deres mangel på sentromerer og potensiell fravær av DNA-syntese ved replikasjon. Dermed, siden de fleste eccDNAs antagelig er i små mengder og deres sekvenser ligne genomet, er alternative DNA utvinning metoder for å påvise eccDNAs.
Flere sirkulære DNA renseteknikker utnytte de strukturelle forskjellene mellom kromosomer og sirkulært DNA. For eksempel, high-speed ultracentrifugasjon i cesium-klorid gradienter brukes til å isolere 350-3000 basepar (bp) store eccDNAs fra menneske HeLa kreftcellelinje 14. Imidlertid kan høy hastighet bryte eller kallenavn ryggrad supercoil sirkulære DNA-strukturer, endre sedimente hastighet 15 og eccDNA yield. Dutta og medarbeidere utviklet en metode for de novo, genom-skala identifisering av sirkulært DNA fra musevev så vel som fra kulturer av kylling og humane celler 16,17. Deres metode er utvinning av kjerner fra homogenisert vev av sukrose ultracentrifugation fulgt av plasmid rensing og flere runder med enzymatiske reaksjoner og DNA-ekstraksjon. Deres protokollen identifiserer primært 200-400 bp eccDNAs, kalt microDNAs. Dutta og kolleger også forsøkt rensing av microDNAs fra Saccharomyces cerevisiae, men var ikke i stand til å ta opp microDNA fra denne gjær arter 16.
Vi har utviklet en ny metode forde novo påvisning av eccDNA fra gjær kalt Circle-sekv. Denne metoden gjør det mulig genom-skala undersøkelser for sirkulære DNA-molekyler som er store nok til å bære hele gener og så store som 86 kilobase (kb) mitokondrie DNA (mtDNA). The Circle-Seq metoden ble utviklet fra en veletablert prokaryote plasmid rensing metode 18,19, optimalisert for eukaryote gjærceller og kombinert med dyp sekvensering. Bruke Circle-Seq tilnærming, 1756 forskjellige eccDNAs, alt større enn 1 kb, ble oppdaget fra ti S. cerevisiae S288C populasjoner 20. En størrelse cut-off ble valgt å fokusere på eccDNA som var store nok til å bære hele gener. Circle-Seq var svært følsom; det oppdaget et enkelt eccDNA innen tusenvis av celler 20. I denne studien ble Circle-Seq brukes til å isolere og identifisere 294 eccDNAs fra tre biologiske replikater av et annet S. cerevisiae gjærstamme, CEN.PK. Dataene viser at eccDNA er en felles genetisk element i S. cerevisiae stammer.
Protocol
MERK: En oversikt over den sirkulære DNA-rensing og sekvenseringsmetode (Circle-Seq) er vist i figur 1.
1. Dyrking, Cell Harvest og plasmamembran Forstyrrelse
- Inokuler gjærceller (for eksempel Saccharomyces cerevisiae) fra en O / N kultur i 50 ml komplett næringsmedium for gjær pepton dekstrose (YPD). Inokulere ved en lav initial celletetthet på 1-3 x 10 5 celler / ml eller en optisk tetthet på omtrent 0,01 OD600.
- Inkuber cellene ved 30 ° C med omrøring ved 150 runder pr minutt (rpm) helt til cellene når maksimal celletetthet på omtrent 1 x 10 10 celler, etter ca. 24 til 48 timers eller en optisk tetthet på OD 600> 10,0.
MERK: Dyrking tid er ikke avgjørende da lavere cellekonsentrasjoner kan anvendes.
- Inkuber cellene ved 30 ° C med omrøring ved 150 runder pr minutt (rpm) helt til cellene når maksimal celletetthet på omtrent 1 x 10 10 celler, etter ca. 24 til 48 timers eller en optisk tetthet på OD 600> 10,0.
- Overfør vokst ut av kulturen til et 50 ml konisk rør, pellet cellene ved sentrifugering ved800 xg i 3 min og kast supernatanten.
- Vask pelleten med 25 ml bufferløsning av 10 mM Tris-CI, 1 mM EDTA, pH 8,0, re-pellet cellene ved sentrifugering ved 800 x g i 3 min og kast supernatanten.
- Cellepelleten suspenderes i 1,2 ml buffer resuspensjon tilføres fra et plasmid kolonne-rensing kit.
- Valgfritt trinn: Legg svært fortynnede plasmider som kontroller for rensing av sirkulære DNA-elementer 20.
MERK: I dagens datasettet, ble en 7,7 pl plasmid blanding gjelder for hver prøve som inneholder 10 10 celler. Plasmidet lager blanding besto av tre plasmider i forskjellige konsentrasjoner; pBR322 ved 38 ng / prøve, pUC19 ved 0,5 ng / prøve, og pUG72 ved 0,01 ng / prøve. - Overfør cellesuspensjonen i to 2 ml mikro-sentrifugerør, hver supplert med 0,5 mm glasskuler i et 1: 3-forhold av den totale suspensjonsvolumet.
- Vortex hvert rør ved maksimal hastighet i 10 min for å forstyrre plasmacellemembraner. Pellet perlene ved sentrifugering ved 268 xg i 30 sek, og overføre 1,2 ml kombinerte supernatant fra de to mikrosentrifugerør i et nytt rør.
MERK: Alternativ til trinn 1.6 til 1.7, bruker zymolyase å forstyrre celler i 0,6 ml resuspensjon bufferløsning. Ti enheter av zymolyase kan forstyrre 5 x 10 7 celler i 1,5 timer ved 35 ° C.
2. EccDNA Enrichment ved kolonnekromatografi
- Følge protokollen fra et sett for kolonnerensing av plasmider. I korte trekk, behandle hver prøve med 1,2 ml alkalisk oppløsning, bland forsiktig og inkuber i 3 minutter ved RT.
- Tilsett 1,2 ml buffer nøytralisering, bland forsiktig og sentrifuger ved 9650 xg i 5 min.
- Installering av oppløsningen på en kolonne ekvilibrert med 1 ml ekvilibrering oppløsning og tillate væsken å flyte gjennom kolonnen ved hjelp av tyngdekraften.
- Vask kolonnen med 4 ml vaskeløsning. Når oppløsningen har passert gjennom harpiksen, tilsett forsiktig 0,3 ml eluering såning for å erstatte det meste av 0,35 ml kolonne hulromsvolum.
- Eluere DNA inn i en ny samling rør med 1 ml eluering oppløsning og utfelling av DNA ved tilsetning av 0,8 ml nedbør blanding. Sentrifuger ved 9650 xg i 10 min.
- Vask den DNA-pellet med 0,5 ml 70% etanol, sentrifuger ved 9650 xg i 5 min, lufttørke i 5 til 15 min og oppløse det rensede DNA i 25 ul sterilt vann.
MERK: Bare korttidslagring av DNA i vann anbefales. Fortrinnsvis gå direkte til trinn 3.
3. Fordøyelse av Gjenværende Linear kromosomalt DNA
- Valgfritt trinn: For å lette bestemt fordøyelsen av lineære DNA ved eksonuklease, behandle den rensede DNA med en sjelden Kjære endonuklease som Noti. For 5 pg DNA ved å bruke en enhet NotI, 5 pl 10x fordøyelse buffer og sterilt vann til et totalvolum på 50 ul. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 16 timer og varme inaktivere endonuklease ved 80 ° C i 5 minutter.
- Legg 20enheter eksonuklease (2 ul), 4 ul ATP (25 mM), 34 pl sterilt vann, og 10 pl 10x reaksjonsbuffer direkte til 50 ul endonuklease-spaltet DNA for å oppnå en 1x reaksjonsvolum på 100 pl, ved hjelp av ATP-avhengige eksonuklease kit.
- Utføre hydrolyse av lineære enkelt-trådet og dobbelt-trådet DNA ved 37 ° C i 5 dager eller mer. Legge til en ytterligere 4 ul ATP (25 mM), 0,6 ul 10 x reaksjonsbuffer, og 20 enheter eksonuklease hver 24 time for å fortsette den enzymatisk DNA-spaltning ved en 1x reaksjonsvolum.
- Etter fjerning av lineært DNA, for å prøve 2 pl fra den eksonuklease behandlede oppløsning bekrefte eliminering av kromosomalt lineært DNA ved hjelp av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), ved hjelp av en kromosomal markør slik som aktin-genet ACT1 20.
- Hver 20 ul qPCR reaksjonsvolum inneholder 2 pl eksonuklease-behandlede prøve, 150 nM ACT1 primere 5'-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 'og 5'-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 ', 2% (vol / vol) dimetylsulfoksid, og 10 ul grønt fluorescent masterblanding.
- Bruke reaksjonsbetingelser; 3 min ved 95 ° C, etterfulgt av 45 sykluser på 15 sek ved 95 ° C og 30 sek ved 60 ° C.
MERK: ACT1 er en spesielt egnet markør for lineære DNA siden kopinummervariasjoner i dette genet er skadelig 21-23 så eccDNA bør ikke bære ACT1. - Alternativer til analyse av DNA-fordøyelse av qPCR er standard PCR (4,3) eller propidiumjodidfarging (4,4).
- Bruk 2 mL eksonuklease behandlede prøven som PCR mal med ACT1 primere 5'-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 'og 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3'. Som positiv ACT1 kontroll, bruker 50-100 ng genomisk S. cerevisiae DNA som mal. PCR-reaksjonsbetingelser; 3 min ved 95 ° C, etterfulgt av 35 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 sek ved 56 ° C og 1 min ved 72 ° C.
- Kjør PCR reaksjoner ved gel electrophoresis på 1% agarose med 0,5 ug / ml etidiumbromid. Se etter en 0,8 kb ACT1 band.
- Fravær eller nærvær av lineært DNA kan også bli undersøkt ved propidiumjodidfarging før og etter DNA-amplifikasjon.
- Bland hver DNA-prøve i en 1: 1 volum med en 1: 1 000 H 2 O-fortynnet oppløsning av 20 mM propidiumjodid lager. La løsningen i mørket i 10-20 min ved RT og analysere DNA-farging ved fluorescens mikroskopi ved 100x forstørrelse ved anvendelse av en rød fluorescens eksitasjon filter ved 663-738 nm og en eksponerings-tid på 5 til 30 sek. Som DNA-farging kontroll, bruk O29-amplifisert genomisk DNA fra gjær og / eller O29-amplifisert plasmid.
- Varme inaktivere exonuklease-løsning ved 70 ° C i 30 min.
4. DNA Amplification
- Forsterke den rensede og beriket eccDNA fra trinn 3.5) med O29 DNA polymerase 24-26 according til protokollen fra produsenten polymerase.
- I korte trekk, bland 5 mL beriket eccDNA med 5 pl denaturering buffer.
- Etter 3 min ved RT, tilsett 10 mL nøytralisering buffer. Bland forsiktig og tilsett 30 mL mester blanding inneholdende 29 mL reaksjon buffer og en mL O29 DNA polymerase. Inkuber reaksjonen ved 30 ° C i 16 timer eller mer (opp til 72 timer). Varme inaktivere O29 DNA-polymerase ved 65 ° C i 3 minutter.
5. Sekvensering og dataanalyse
- Skjær den forsterkede eccDNA med en fokusert ultrasonicator til et gjennomsnitt mål peak størrelse på 300 bp. Bruk følgende innstillinger for en 130 mL DNA-prøve: 450W peak intensitet makt, 60 sek behandling, 30% plikt faktor, 200 sykluser per burst, temperatur 7 ° C.
- Legg strekkode indeks etiketter og adaptere til fragmenterte leser for syntese av biblioteker for sekvensering, ved hjelp av en egnet metode for biblioteket forberedelse.
- Stikker dypt sekvensering, for eksempel som 141-nukleotid én ende står på en high-throughput-sekvensering-plattformen.
- Kart leser for gjær referansen genomet under etterforskning og tillate leser å kartlegge til flere regioner. For eksempel bruke en fritt tilgjengelig arbeidsflyt system 27,28 og kortlese aligner kartprogramvare 29.
- Identifisere leser fra områder av antatte eccDNAs ved hjelp av sammenhengende leser, for eksempel leser mer enn syv sammenhengende (> 1 kb) uten hull 20.
MERK: Programvaren er tilgjengelig 27,28 for å utforske kartlagt leser på genomiske regioner av interesse.
Representative Results
For å validere Circle-Seq metoden, tre S. cerevisiae CEN.PK populasjoner av 1 x 10 10 celler ble undersøkt etter at cellene ble dyrket separat i YPD i ti generasjoner. Kromosomalt lineære DNA eliminering ble bekreftet ved fravær av en qPCR ACT1 signal som beskrevet tidligere 20 (data ikke vist). Renset og beriket eccDNA ble sekvensert opptil 68 millioner leser (141-nukleotid single-end leser) og kartlagt til CEN.PK113-7D referansen genomet (versjon 19 juni 2012). Opptak av antatte eccDNAs fra de tre prøvene heter C1, C2 og C4 ble tildelt genomiske regioner kartlagt av sammenhengende leser lenger enn 1 kb. Basert på 10.000 Monte Carlo-simuleringer, leser betydningen av hver region kartlagt av sammenhengende lenger enn en kb ble anslått. Fra denne 79, 159 og 56 regioner ble kommentert som sannsynlig eccDNA sekvenser (p <0,1, Dataset 1). Antallet innspilte contiguooss leser> 1 kb økt som en funksjon av sekvens dybde som tyder på at enda flere eccDNA elementer ville ha blitt registrert hvis prøvene hadde blitt sekvensert ytterligere (figur 2). Som forventet, Circle-Seq metode hentet mange leser fra en rekke kjente sirkulære DNA-elementer, inkludert den 2μ plasmid, mitokondrie-DNA, ribosomale RNA gener på kromosom XII, og de tre interne kontroll plasmider pBR322, pUC19 og pUG72 som ble tilsatt i prøvene like før kolonnerensing (figur 3).
Videoen viser et eksempel på sammenhengende leser som tilordnes til HXT7 _ARS432_ HXT6 locus på kromosom IV. Tidligere ble [HXT6 / 7 sirkel] detektert av sirkel-Seq i ti S288C populasjoner (hver med 1 x 10 10 celler) og den sirkulære DNA-strukturen ble bekreftet ved invers PCR-analyse 20. Den [HXT6 / 7 cisirkel med] ble også registrert i hver av de tre CEN.PK populasjoner (Figur 4A). Videre har de fleste av de vanlige eccDNA genene blant duplikate prøver av CEN.PK lappes eccDNA gener fra de S288C datasettene (figur 4B).
For å teste spesifisiteten av den sirkel-sekv protokoll for sirkulært DNA-rensing, to prøver, hver med 30 ug genomisk DNA, ble testet. En prøve ble supplert med 100 ng plasmid-DNA og eccDNA fra begge prøvene ble renset ved Circle-Seq protokollen. Etter kolonneseparering, DNA-utbyttet var 1,27% (380 ng) for prøven uten plasmid (GD) og 1,60% (480 ng) for prøven med plasmid (GD + P). Effektiviteten av eksonuklease-behandling ble testet for lineære DNA-innhold etter 29 timer og 72 timer ved anvendelse av PCR mot ACT1. Ingen prøver inneholdt forsterket ACT1 (data ikke vist). En fraksjon av hver eksonuklease-behandlede prøve ble ytterligere enmplified av O29 polymerase og produkter av enzymatiske reaksjoner ble analysert ved propidiumjodidfarging (figur 5A-F) og agarosegelelektroforese (Figur 5G). Prøver etter eksonuklease behandling viste minimal propidium jod-flekken (figur 5A-B). Den O29 - amplifiserte prøven med bare genomisk DNA viste trådliknende strukturer (figur 5C) i likhet med kontrollprøven (figur 5E). Den O29 - forsterket prøve som hadde lagt plasmid avslørt foci (figur 5D) ligner plasmidet kontroll (figur 5F). Bildene viste at O29 polymerase beriket for sirkulært DNA i løpet av lineære DNA. Mest lineær kromosomalt DNA ble fjernet fra prøver etter 29 timer eksonuklease-behandling (figur 5A-B, G). Men omfattende eksonuklease behandling for mer enn 100 t og bruker mer enn 100 enheter var nødvendig for å fjerne alle kromosomalt lineære DNA, som O29 - amplifiserte prøver likevel viste en bakgrunn av trådliknende strukturer etter 72 timer eksonuklease-behandling (Figur 5C-D).
Fig. 1. Oversikt over den sirkel-sekv metode Protokollen har 5 trinn: 1) celledyrking, 2) rensning og anrikning av eccDNA ved kolonnekromatografi, 3) spaltning av gjenværende lineære kromosomale DNA i eluatet fraksjon, 4) forsterkning av DNA ved O29 DNA-polymerase, og 5) sekvensering av høyanriket eccDNA og kartlegging av leser til S. cerevisiae referanse genom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg "/>
Figur 2. Sammenhengende leser> 1 kb som funksjon av dybde sekvens. EccDNA fra 1 x 10 10 celler øker som en funksjon av dybde sekvens (millioner kartlagt leser). Vist: biologiske triplicates fra haploid CEN.PK S. cerevisiae populasjoner (C1, C2, C4) adskilt med 10 10 celledelinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Påvisning av kjente sirkulære DNA-elementer. (AB) spredningsplott av lese dekning (les tetthet) i prosent for plasmider i CEN.PK biologisk replikerer C1, C2 og C4. (A) tilordnet leser til de endogene gjærplasmider var: 2μ; [RDNA sirkel] (ribosomalt RNA gener fra kromosom XII); og mtDNA (mitokondrie-DNA). (B) Unikt leser kartlagt til å kontrollere plasmider. Kontroll plasmider ble tilsatt i prøvene før kolonne rensing. Plasmid forholdstall per celle var: pBR322 (plusstegn) 1: 1, pUC19 (sirkler) 01:50, og pUG72 (trekanter) 1: 2500.
Figur 4. Common eccDNA elementer i CEN.PK og S288C. (A) Venn-diagram som viser overlapping mellom 476 gener på 294 eccDNA elementer i de tre CEN.PK prøver (C1, C2, C4). De 16 vanligste overlapp eccDNA gener / plasmider er annotert (alle gen navnene er i datasett 1). (B) Venn-diagram over alle registrerte gener på antatte eccDNAs fra de tre CEN.PK prøver (C1, C2, C4), sammenlignet med alle registrerte gener på antatte eccDNAs fra 10 S288C prøver: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (se henvisning 20). Vist er 13 biologiske replikat (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) med gener / plasmider og antatte eccDNA regioner som overlappet minimum 2 belastningsskader bakgrunn og enten 3 eller flere forsøksoppsett. C prøver, CEN.PK; R og Z prøver, S288C BY4741; S prøver, S288C M3750. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Visualisering av DNA-prøver etter eksonuklease og ø 2 9 behandling. (AF) propidiumjodidfarging av DNA. Scale bar, 10 mikrometer. (A, C og E) Prøver med genomisk DNA (GD); (B og D) prøver med GD pluss plasmid (GD + P). (
Aset en "src =" / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/>
Datasett 1. Potensielle DNA circularization regioner i CEN.PK. Klikk her for å laste ned denne filen.
Vist er sekvensdata og analyser for 348 regioner. Kolonner er AD, eccDNA kartlegging. A (første kolonne fra venstre), prøve der antatte eccDNA ble identifisert; B, kromosom; CD, start og slutt koordinerer av antatte eccDNAs. EH, eccDNA innhold. E, autonomt replikerende sekvens (ARS) i regionen; F, komplett gen i regionen; G, en del av genet som inngår i regionen; H, BLASTN-identifisert genet. IO, EccDNA dekning og p-verdier. Jeg, lengste region med et unikt kommenterte sekvens i bp; J, antall alt kartlagt leser; K, dekning av alle kartlagte leser av fragmenter per kb fra en million kartlagt leser (FPKM); L, p-verdi for antatte eccDNA forhold til forekomsten ved en tilfeldighet fra Monte Carlo-simuleringer; M, antall uniquely kartlagt leser; NEI; som K og L ved hjelp av bare entydig kartlagt leser (UFPKM). Parametere for kartlegging av leser og Monte Carlo-simuleringer var som beskrevet 20.
Discussion
The Circle-Seq metoden gjør genom-skala påvisning av eccDNA fra gjærceller med sekvens-nivå oppløsning. Fremgangsmåten er en mild eccDNA rensning som ikke krever intensiv virvel eller pipettering og bruker kolonneseparering av tyngdekraften for å begrense eccDNA brudd som ville føre til eksonuklease fordøyelse i det etterfølgende trinn. Disse trekk ved fremgangsmåten kan være avgjørende for å detektere store eccDNAs som inneholder gensekvenser. Circle-Seq oppdaget mange eccDNAs inkludert fullt gener (Datasett 1). Det er også oppdaget 86-kb gjær mitokondrie-DNA. Dermed letter denne protokollen rensing av store sirkulære DNA-elementer. Slik at antallet av DNA-ekstraksjonstrinn til et minimum reduserer risikoen for tap eccDNA og maksimerer utbyttet. Basert på resultater for kontroll, piggete-in plasmider, er Circle-Seq svært følsom, oppdager en enkelt sirkulært DNA fra 2500 celler. Videre fjerner rikelig endogene plasmider som 2μ; plasmid eller mitokondrie-DNA kan betydelig forbedre følsomheten. Herding av 2μ fra gjærkulturer har blitt beskrevet 30. Alternativt 2μ og mitokondrie-DNA fjerning kan oppnås med en sjelden skjæring endonuklease, for eksempel Swai. Imidlertid kan restriksjonsenzymtrinnet målrette andre eccDNAs av interesse og begrense den totale eccDNA utbytte.
Kritiske trinn for eccDNA påvisning var fjerning av lineært DNA (trinn 3) og DNA-sekvensering (trinn 5) til en passende dybde. For å ta opp de fleste eccDNAs fra en cellepopulasjon, kanskje dypt sekvense kreves 20. Parvise end sekvensering bør gi enda større tillit eccDNA gjenkjenning, som sirkulære DNA veikryss forventes å gi parvise end leser det kartet discordantly. Disse avvik støtter oppdagelsen av sirkulære DNA-konstruksjoner, og kan potensielt brukes som en ekstra eccDNA-deteksjon filter.
The Circle-Seq Metoden ble validert ved hjelp av tre uavhengige S. cerevisiae CEN.PK populasjoner. Oppdages sekvenser inkludert tidligere rapportert eccDNAs, endogene plasmider og piggete-in plasmider og hundrevis av antatte eccDNAs (Datasett 1). Disse funnene støtter tidligere Circle-Seq datasett fra S. cerevisiae S288C 20. Oppdagelsen av flere eccDNAs felles for CEN.PK og S288C populasjoner indikerer at disse loci har en tilbøyelighet til å eksistere som sirkulære elementene (figur 4). Vi har tidligere vist at [GAP1 sirkel] er anriket under nitrogen begrensede betingelser i CEN.PK bakgrunnen 8, men bevis for [GAP1 sirkel] i andre strekk bakgrunn har ikke blitt funnet. Funn av eccDNA fra CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111, og HXT6 HXT7 loci i både S288C og CEN.PK antyder at en predisposisjon for DNA circularization er conserveres mellom gjærstammer. Det gjenstår å vise om [HXT6 / 7 sirkel], [ASP3-1 sirkel], [COS111 sirkel] og [CUP1-1 RSC30 sirkel] konferere selektive fordeler til celler eller om deres eksistens er bare en effekt av høy forekomst av DNA circularization.
Til sammen tyder resultatene på at Circle-Seq er godt egnet for å påvise kilobase store eccDNAs og har fordeler for å identifisere eccDNAs med komplett gener. Circle-Seq er en svært følsom metode som gjør det mulig for hele genom-skala skjermer av eccDNAs fra gjær. The Circle-Seq metoden kunne åpne et nytt forskningsfelt som tar sikte på å belyse hvilken rolle eccDNA i å generere genet slettinger og presiseringer. Gitt at DNA arkitektur og struktur er i stor grad bevart fra eukaryote gjær til høyere eukaryoter, Circle-Seq metoden bør i prinsippet være kan påførese til alle eukaryote celler, med små modifikasjoner. I dag gjør metoden ikke synes å ha noen begrensninger, selv om dens evne til å rense megabase størrelse eccDNAs har ennå ikke vist. I tillegg er bruken av O29 DNA-polymerase, som bruker en rullende sirkel-amplifikasjonsmetoden 31, skaper en forspenning mot mindre eccDNAs gjør eccDNA kvantifisering vanskeligere. Circle-Seq oppdager eccDNAs store nok til å bære fulle gener, noe som gjør den egnet for studier av dobbel minutter-sirkulære DNA fra humane somatiske celler. Doble minutter kan bidra til kreft når proto-onkogener blir forsterket på disse elementene 32-37. Studier av eccDNAs i germline celler kan brukes til å måle germline mutasjon priser og vurdere sædkvalitet, for eksempel i husdyr. Således har Circle-Seq potensiale til å gi innsikt i den hastighet med hvilken genetisk variasjon oppstår i form av kopitallet variasjon, og føre til en ny forståelse av sykdommer som involverer gen ko-nummer variasjon 38-40.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
| Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
| Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
| Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
| Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used. |
| NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
| Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
| pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. |
| QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
| REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase. |
| Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
| Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
| Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
| Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 genexxx::KanMX. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
| Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
| Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
| Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
| Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methods | |||
| 2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
| Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
| Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: 29. | |
| Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
| Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: 27-28. |
References
- Kugelberg, E., Kofoid, E., et al. The Tandem Inversion Duplication in Salmonella enterica.: Selection Drives Unstable Precursors to Final Mutation Types. Genetics. 185 (1), 65-80 (2010).
- Reams, A. B., Kofoid, E., Savageau, M., Roth, J. R. Duplication Frequency in a Population of Salmonella enterica. Rapidly Approaches Steady State With or Without Recombination. Genetics. 184 (4), 1077-1094 (2010).
- Smith, C. A., Vinograd, J. Small polydisperse circular DNA of HeLa cells. Journal of Molecular Biology. 69 (2), 163-178 (1972).
- Carroll, S. M., DeRose, M. L., et al. Double Minute Chromosomes Can Be Produced from Precursors Derived from a Chromosomal Deletion. Molecular and cellular biology. 8 (4), 1525-1533 (1988).
- Cohen, S., Yacobi, K., Segal, D. Extrachromosomal Circular DNA of Tandemly Repeated Genomic Sequences in Drosophila. Genome research. 13 (6A), 1133-1145 (2003).
- Horowitz, H., Haber, J. E. Identification of Autonomously Replicating Circular Subtelomeric Y' Elements in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 5 (9), 2369-2380 (1985).
- Moore, I. K., Martin, M. P., Dorsey, M. J., Paquin, C. E. Formation of Circular Amplifications in Saccharomyces cerevisiae by a Breakage-Fusion-Bridge Mechanism. Environmental and molecular mutagenesis. 36 (2), 113-120 (2000).
- Gresham, D., Usaite, R., Germann, S. M., Lisby, M., Botstein, D., Regenberg, B. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18551-18556 (2010).
- Windle, B., Draper, B. W., Yin, Y. X., O'Gorman, S., Wahl, G. M. A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation, and amplicon integration. Genes & development. 5 (2), 160-174 (1991).
- Gresham, D., Ruderfer, D. M., et al. Genome-Wide Detection of Polymorphisms at Nucleotide Resolution with a Single DNA Microarray. Science. 311 (5769), 1932-1936 (2006).
- Kidd, J. M., Cooper, G. M., et al. Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes. Nature. 453 (7191), 56-64 (2008).
- Gresham, D., Desai, M. M., Botstein, D., Dunham, M. J. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genetics. 4 (12), 1-19 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic Variation and the Fate of Beneficial Mutations in Asexual Populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- van Loon, N., Miller, D., Murnane, J. P. Formation of extrachromosomal circular DNA in HeLa cells by nonhomologous recombination. Nucleic Acids Research. 22 (13), 2447-2452 (1994).
- Vinograd, J., Lebowitz, J. Physical and Topological Properties of Circular Dna. Journal of General Physiology. 49 (6P2), 103 (1966).
- Shibata, Y., Kumar, P., et al. Extrachromosomal MicroDNAs and Chromosomal Microdeletions in Normal Tissues. Science. 336 (6077), 82-86 (2012).
- Dillon, L. W., Kumar, P., et al. Production of Extrachromosomal MicroDNAs Is Linked to Mismatch Repair Pathways and Transcriptional Activity. Cell Reports. 11 (11), 1749-1759 (2015).
- Li, L. L., Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Metamobilomics - our knowledge on the pool of plasmid encoded traits in natural environments using high-throughput sequencing. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 18, 5-7 (2012).
- Brown Kav, A., Sasson, G., Jami, E., Doron-Faigenboim, A., Benhar, I., Mizrahi, I. Insights into the bovine rumen plasmidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5452-5457 (2012).
- Møller, H. D., Parsons, L., Jørgensen, T. S., Botstein, D., Regenberg, B. Extrachromosomal circular DNA is common in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 201508825 (2015).
- Drubin, D. G., Miller, K. G., Botstein, D. Yeast Actin-Binding Proteins - Evidence for a Role in Morphogenesis. The Journal of cell biology. 107 (6), 2551-2561 (1988).
- Magdolen, V., Drubin, D. G., Mages, G., Bandlow, W. High levels of profilin suppress the lethality caused by overproduction of actin in yeast cells. FEBS letters. 316 (1), 41-47 (1993).
- Sandrock, T. M., Brower, S. M., Toenjes, K. A., Adams, A. Suppressor analysis of fimbrin (Sac6p) overexpression in yeast. Genetics. 151 (4), 1287-1297 (1999).
- Blanco, L., Bernad, A., Lázaro, J. M., Martìn, G., Garmendia, C., Salas, M. Highly Efficient DNA Synthesis by the Phage ø29 DNA Polymerase. The Journal of biological chemistry. 264 (15), 8935-8940 (1989).
- Dean, F. B. Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification. Genome research. 11 (6), 1095-1099 (2001).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using ø29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17332-17336 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy Team, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biology. 11 (8), 86 (2010).
- Giardine, B., Riemer, C., et al. Galaxy: A platform for interactive large-scale genome analysis. Genome research. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357 (2012).
- Tsalik, E. L., Gartenberg, M. R. Curing Saccharomyces cerevisiae of the 2 micron plasmid by targeted DNA damage. Yeast. 14 (9), Chichester, England 847-852 (1998).
- Norman, A., Riber, L., Luo, W., Li, L. L., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. An Improved Method for Including Upper Size Range Plasmids in Metamobilomes. PLoS ONE. 9 (8), e104405 (2014).
- Storlazzi, C. T., Lonoce, A., et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome research. 20 (9), 1198-1206 (2010).
- Von Hoff, D. D., Needham-VanDevanter, D. R., Yucel, J., Windle, B. E., Wahl, G. M. Amplified human MYC localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (13), 4804-4808 (1988).
- Raymond, E., Faivre, S., et al. Effects of hydroxyurea on extrachromosomal DNA in patients with advanced ovarian carcinomas. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 7 (5), 1171-1180 (2001).
- Shimizu, N. Extrachromosomal Double Minutes and Chromosomal Homogeneously Staining Regions as Probes for Chromosome Research. Cytogenetic and genome research. 124 (3-4), 3-4 (2009).
- Eckhardt, S. G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).
- Vogt, N., Lefèvre, S. -H., et al. Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11368-11373 (2004).
- Ahn, K., Gotay, N., et al. High rate of disease-related copy number variations in childhood onset schizophrenia. Molecular psychiatry. 19 (5), 568-572 (2013).
- Girirajan, S., Johnson, R. L., et al. Global increases in both common and rare copy number load associated with autism. Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).
- Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma. Nucleic Acids Research. , (2014).
