Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Preparación de colonias individuales-cohortes y tratamiento con hormona del trabajador abejas para analizar la fisiología asociada con clases, y / o Sistema Endocrino

doi: 10.3791/54240 Published: September 6, 2016

Summary

Aquí describimos nuestro protocolo detallado para la preparación de las colonias de abejas de un solo cohortes - una herramienta útil para analizar la fisiología trabajador función asociada. También describimos los protocolos detallados para el tratamiento de los trabajadores con la hormona juvenil y ecdisona para evaluar la participación de estas hormonas en la regulación del comportamiento de los trabajadores y / o fisiología.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La abeja europea, Apis mellifera, es un insecto eusocial con una sociedad altamente organizada 1. Abejas obreras (casta de trabajo) se dedican a diversas tareas para mantener la actividad de la colonia, y estas tareas cambian de acuerdo a la edad de la abeja obrera después de la eclosión, que se conoce como la división relacionada con la edad del trabajo 2-4. Los trabajadores jóvenes (<13 días de edad) cuidar de la cría de la colmena mediante la secreción de jalea real (abejas nodrizas), mientras que los trabajadores de más edad (> 15 días de edad) recogen el néctar y el polen exterior de la colmena (recolectores) 2-4. La fisiología de los trabajadores cambia en asociación con este cambio de función. Por ejemplo, la función de las glándulas hipofaringe (HPGs), emparejado glándulas exocrinas ubicadas en la cabeza, cambios en asociación con el cambio de rol de enfermería para forrajeo 2,5. HPGs enfermera abeja sintetizan principalmente proteínas principales de la jalea real, que son los principales componentes de la leche de abeja. Por otro lado, para cosechadoras de forraje, principalmente HPGssintetizar enzimas metabolizadoras de hidratos de carbono, tales como α-glucosidasa III, para procesar néctar en miel mediante la conversión de la sacarosa en glucosa y fructosa. Nuestros estudios previos revelaron que la expresión de mrjp2, que codifica una proteína principal de la jalea real y Hbg3, que codifica α-glucosidasa III, los cambios durante el turno de papel 6-9.

Para determinar si los cambios fisiológicos en los tejidos de los trabajadores, incluyendo los HPGs, se asocia con el cambio de papel o con la edad de los trabajadores, que sería útil para manipular la composición de la población de una colonia de abejas, como para preparar un solo cohorte colonias en las que los trabajadores de casi la misma edad realizan tareas diferentes 10,11. Robinson et al. (1989) describe un método para establecer una colonia de una sola cohorte 10. colonias de una sola cohorte comprenden inicialmente una reina y trabajadores de 0-2 días de edad. Varios días después de establecer las colonias, los trabajadores de almost la misma edad asumir diferentes tareas. Algunos trabajadores realizan tareas de enfermería como en las colonias típicas, mientras que otros trabajadores realizan tareas de búsqueda de alimento antes de lo habitual y por lo tanto son llamados recolectores precoces. Comparaciones de expresión génica entre las abejas nodrizas y recolectores precoces proporcionarían información útil acerca de la fisiología de rol asociado de tejidos trabajador 12-16. A continuación, describimos un protocolo detallado para la preparación de las colonias de una sola cohorte para el análisis de la fisiología de roles y / o asociado a la edad de 16 HPGs. También describimos brevemente cómo examinar la expresión de genes de mrjp2 y Hbg3 por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR) para evaluar la fisiología HPG.

Además del análisis de la fisiología de los trabajadores en colonias de una sola cohorte, el examen del sistema endocrino es importante para el análisis de los mecanismos de regulación de la fisiología trabajador función asociada. hormona juvenil (JH), que se KNOwn como la hormona del "status quo" en larvas de insectos, acelera el cambio en el papel de la enfermería a la búsqueda de alimento en las abejas obreras 11. Además, ecdisona, que se conoce como la hormona de la muda durante la metamorfosis, podría estar implicada en el cambio de papel como genes que codifican las moléculas de señalización de ecdisona se expresan en los órganos de hongos, un centro superior del cerebro trabajador 17-19. Por lo tanto, también se describe el protocolo detallado utilizado en nuestro estudio anterior 16 para tratar a los trabajadores con 20E, que es una forma activa de la ecdisona, y metopreno, un análogo de JH, para el análisis del efecto del sistema endocrino en HPG fisiología (expresión de mrjp2 y Hbg3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Preparación de colonias individuales-cohorte

  1. Preparar tres colonias de abejas para crear dos colonias de una sola cohorte y para la obtención de un número suficiente de trabajadores recién emergidas.
    1. Compruebe que algunas pupas en las células periféricas nevadas en los panales tienen ojos marrones y una cutícula pigmentada con la apertura de los peines cubrieron usando unas pinzas. Si existen estas pupas en las células periféricas de peine, la mayoría de las pupas en el conjunto de peines surgirá en aproximadamente 1-3 días.
    2. Posteriormente, recoger los panales que contienen estos pupas después de que todas las abejas adultas adherentes se han eliminado con un cepillo, y mezclar los peines de las tres colonias para minimizar la variabilidad entre las colonias.
  2. Coloque los panales recogidos en una caja colmena vacía y se incuba a 33 ° C en condiciones de humedad (> 60% de humedad relativa). Recoge aproximadamente 6.000 trabajadores recién surgido a lo largo de 3 días (3.000 trabajadores por colonia) de los panales recogidos.
  3. Determinar la cantidad de workers basado en el peso de cinco trabajadores recién emergidas recogieron al azar de colonias no manipulados.
    1. Pesar cinco trabajadores recién emergidas recogidos al azar de colonias no manipulados utilizando máquinas de pesar.
      Nota: El peso de cinco trabajadores recién emergidas es generalmente 500-600 mg.
    2. Estimar la cantidad de trabajadores recogidos dividiendo el peso de los trabajadores recogidos por el peso promedio de cinco trabajadores recién emergidas.
  4. Aplicar marcas de pintura a las Thoraces de aproximadamente 1.800 trabajadores (900 trabajadores por colonia) usando marcadores de la pintura del cartel a base de agua.
    Nota: marcador lavable que se utiliza para aplicar la pintura está en la lista en la Tabla de Materiales.
  5. Introducir una reina y aproximadamente 3.000 de los antiguos trabajadores 0-2 día para un nuevo cuadro de colmena que contiene dos peines, un panal de miel y polen como conservas y otro peine vacío para la puesta de huevos por la reina. Recoger el panal con la miel y el polen from otra colonia no manipulado después de que todas las abejas adherentes se eliminan.
    Nota: Se recomienda el uso de la caja de la colmena nuclear (cuadro de colmena de tamaño pequeño).
  6. Recoger las abejas nodrizas y recolectores precoces con marcas de pintura de 6 a 8 días después de la creación de colonias de una sola cohorte.
    1. Para recoger las abejas nodrizas, recoger a los trabajadores que ponen sus cabezas en las células de peine para cuidar de la prole. Use pinzas para recoger las abejas nodrizas de los panales que contienen muchos trabajadores de cría y adultos.
      Nota: Si se desarrollan HPGs de los trabajadores recogidos cuando diseccionado como se describe en el paso 1.7, estos trabajadores se definen como las abejas nodrizas. La celebración de los Thoraces por pinzas se recomienda para recoger a los trabajadores de los panales.
    2. Para recoger las recolectoras, utilice una red de insectos para capturar los trabajadores que regresan a sus colmenas con cargas de polen en sus patas traseras.
      Nota: Si HPGs de los trabajadores capturados aparece encogida cuando diseccionado como se describe en el paso 1.7, esos trabajadores se definen como recolectores.
  7. clasSIFY el HPG en tres grupos, "desarrollado", "intermedio", y "encogido" por la disección bajo un microscopio estereoscópico.
    1. 10-15 anestesiar a las abejas en una jaula de insectos en un refrigerador durante 10-15 minutos hasta que las abejas no pueden volar o caminar. A continuación, mueva abejas sobre hielo y completar la anestesia en hielo durante 5 min.
      Nota: Se tarda aproximadamente total de 15-20 minutos para conseguir una anestesia. Si necesita el tiempo de anestesia que se acorte, el número de abejas en una jaula debe reducirse a 1-3 abejas por jaula.
    2. Diseccionar la cabeza del cuerpo con unas tijeras y pinzas. Fijar la cabeza en cera dental colocado en una placa de Petri con alfileres. Inserte dos pernos en las bases de las antenas para fijar la cabeza. Remojar cabezas fijas en solución salina de insectos (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, 1 mM CaCl 2).
    3. Retire la cara anterior de la cutícula de la cabeza con unas pinzas finas y un cuchillo quirúrgico bajo un microscopio binocular.
      Nota: Los HPGs se pueden encontrar fácilmente en la cabeza después de la eliminación de cuticle. El HPG es un órgano botrioide que existe alrededor del cerebro en la cabeza.
    4. Eliminar el tejido traqueal que es un tejido membranoso blanco debajo de la cutícula. A continuación, diseccionar los HPGs de la cabeza por ellos tirando lentamente con unas pinzas.
    5. Clasificar a HPGs con acinos grande y circular, como "desarrollados". Clasificar a HPGs con acinos pequeña y distorsionada como 'encogido'. Clasificar HPGs que corresponde a ninguno "desarrollados" ni "encogido 'como' Intermedio '.
      Nota: las fotografías representativas que muestran estas tres clases de estados HPG se indican en la Figura 2.
    6. Asunto "desarrollados" y HPGs 'encogidos' a la extracción de RNA como 'abejas HPGs enfermera "y" HPGs cosechadoras de forraje', respectivamente, y comparar la expresión génica en las HPGs entre las abejas nodrizas y recolectores (sección 4).

2. Inyección de 20E

  1. Recoger las abejas nodrizas de colonias típicas como described en el procedimiento 1.6.1.
    Nota: HPGs no pueden ser examinadas en estas abejas que se crían las abejas.
  2. Anestesiar a las abejas a 4 ° C en un refrigerador (no en el hielo).
    Nota: Se tarda unos 30 minutos para conseguir una anestesia. Si el tiempo de anestesia se acorta, el número de abejas en la jaula debe ser reducido a 1-3 abejas por jaula.
  3. Con unas pinzas, inmovilizar las abejas en moldes dentales colocados en una placa de Petri.
  4. Se inyecta 1 l de solución de 20E en el aspecto anterior de la cabeza utilizando una punta de inyección a partir de una micropipeta capilar calibrado utilizando un extractor de aguja de vidrio.
    1. Disolver 20E en solución salina etanol-insecto (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, 1 mM CaCl 2) mezcla (1: 4) a 2,5 g / l.
    2. Conectar la punta de inyección para un tubo de goma, y ​​conectar una punta de la micropipeta amarilla para el lado opuesto del tubo.
    3. Colocar 1 l de solución de 20E en parafina utilizando una micropipeta, sostenga la punta de la micropipeta amarilla en la boca, unad dibujar la solución en la punta de inyección.
    4. Inserte la punta de la inyección en la base de las antenas, e inyectar la solución soplando a través de la punta de la micropipeta amarilla.
      Nota: El protocolo se muestra en este paso es el método de inyección representativo, pero se recomienda el uso de la máquina de inyección automatizado para la seguridad como sea necesario 20.
  5. Posterior a las abejas inyectados en jaulas de insectos a 33-36 ° C (la temperatura ideal es de 35 ° C) en condiciones oscuras y húmedas (> 60% de humedad relativa) durante 1 ó 3 días. De suministro de mezcla de miel y agua (1: 1) a las abejas. Si es necesario, contar sobrevivir a las abejas después de la inyección.

3. Aplicación de Metopropeno

  1. Recoger los panales que contienen pupas de las colonias típicas después de que todas las abejas adultas adherentes se eliminan con un cepillo. Incubar los peines a 33-36 ° C (la temperatura ideal es de 35 ° C) en condiciones de humedad (> 60% de humedad relativa) durante un máximo de 1 día.
  2. Después de 6 días, recoger los trabajadores pintadas (de 6 días de edad) de las colonias. Recoge los trabajadores pintadas de los panales mediante la celebración de sus Thoraces con pinzas.
  3. Anestesiar a las abejas a 4 ° C en un refrigerador (no en el hielo) como en el procedimiento 2.2. Con unas pinzas, inmovilizar las abejas en moldes dentales colocados en una placa de Petri y aplicar 1-5 l de solución de metopreno (50-250 mg / l) disuelto en acetona a la cabeza utilizando una micropipeta. Utilice una punta de filtro que es resistente a la acetona.
    Nota: La acetona puede tener el efecto nocivo para las abejas que llevan a la muerte. Si se observa la alta mortalidad de las abejas, se recomienda la reducción del volumen de acetona a 1 l como mínimo.
  4. Posterior a las abejas en las jaulas de insectos a 33-36 ° C (la t idealesemperatura es de 35 ° C) durante 7 días en condiciones oscuras y húmedas (> 60% de humedad relativa). De suministro de mezcla de miel y agua (1: 1) a las abejas. Si es necesario, contar sobrevivir a las abejas después de la aplicación tópica.
    Nota: En este artículo, las abejas que sobreviven se cuentan 7 días después de la aplicación (Tabla 3).

4. Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa

  1. Anestesiar a las abejas y diseccionar HPGs como se describe en los pasos 1.7.1 a 1.7.4.
  2. Recoge los HPGs disecados en un tubo de microcentrífuga en hielo seco y almacenar a -80 ° C hasta su uso.
  3. Añadir 400 l de reactivo para la desnaturalización de la proteína.
    Nota: Este reactivo está disponible en el mercado (véase la Tabla de Materiales).
  4. Homogeneizar los tejidos HPG utilizando una batidora eléctrica de mano con una mano de mortero homogeneización que cabe dentro de un tubo de microcentrífuga. Homogeneizar a una velocidad de rotación de aproximadamente 300 rpm durante 1 min en hielo para romper y lisar las células del tejido.
    Tabla de Materiales).
  5. Añadir 80 l de cloroformo y mezclar bien. Incubar durante 5 min a TA.
  6. Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 14.170 xg durante 15 min a 4 ° C. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo. Añadir un volumen igual de isopropanol y 1 l de glucógeno (5 mg / ml). Se incuba a -20 ° C durante al menos 20 min.
  7. Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 14.170 xg durante 10 min a 4 ° C y separar el sobrenadante.
  8. Añadir 400 l de etanol al 75% al ​​sedimento y mezclar bien, centrifugar los tubos de microcentrífuga a 14.170 xg durante 15 min a 4 ° C, y se elimina el sobrenadante. Repita este procedimiento una vez más.
  9. El aire seco de la pastilla durante 5-10 minutos y luego se disuelven en 10 l de agua libre de RNasa.
    Nota: el secado completo de la pastilla puede causar la insolubilización del pellet de ARN en agua. Por lo tanto, el sedimento que es ligeramente húmedo es apropiado parade disolución.
  10. Medir la concentración de ARN usando un espectrofotómetro tal como NanoDrop o similar.
  11. Tratar 500 ng de ARN total con 2,0 U de DNasa I por incubación a 37 ° C durante 30 min para degradar cualquier ADN genómico contaminante.
  12. Reverse-transcribir 200 ng de ARN tratado con DNasa I y realizar PCR en tiempo real utilizando kits disponibles comercialmente (véase la lista en la Tabla de Materiales y Reactivos) y cebadores específicos del gen (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'y 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'y 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Realice la PCR como sigue: [95 ° C x 30 seg + (95 ° C x 5 seg + 60 ° C x 15 seg + 72 ° C x 20 seg) x 45-55 ciclos].
  13. Normalizar la cantidad de transcripción con la del factor de elongación 1α-F2 (EF1α˗F2) o la proteína ribosomal 49 (rp49) 9,16,21,22. Estos genes son el control fiable genes para el análisis de la expresión génica en las HPGs utilizando QRT-PCR.
  14. Realizar dos colas t-test para detectar las diferencias significativas entre los dos grupos experimentales (las abejas nodrizas vs. recolectores precoces, abejas 20E tratados vs abejas de control, y las abejas metopreno tratados vs abejas control) utilizando el software estadístico.
    Nota: Si F-prueba supone la homogeneidad de la varianza, prueba t de Student se puede utilizar. Si no, la prueba t de Welch se puede utilizar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Una visión general del protocolo para la preparación de las colonias de una sola cohorte se ilustra en la Figura 1A. El curso temporal de los experimentos de la preparación de las colonias de una sola cohorte para la recogida de muestras se muestra en la Figura 1B. Los trabajadores que cumplieron con los criterios de comportamiento para el comportamiento de enfermería o el comportamiento de alimentación se obtuvieron de colonias de una sola cohorte, y el desarrollo HPG se estimó en estos trabajadores Tabla 1 muestra la clasificación de desarrollo HPG en tres grupos.; "Desarrollados", "Intermedio" y "encogido", según el tamaño. Fotografías representativas que muestran estas tres clases de HPGs se indican en la Figura 2. Los resultados indican que tanto las abejas nodrizas y recolectores precoces, de acuerdo con los criterios descritos en el protocolo, se observaron también en las colonias de una sola cohorte. La expresión de mrjp2 y Hbg3 en los HPGs era enenriqueció en las abejas nodrizas y recolectores precoces, respectivamente, lo que indica que la función HPG se asocia con la función del trabajador (Figura 3) 16.

El procedimiento para la inyección de 20E en las cabezas de los trabajadores se ilustra en la Figura 4. Abejas supervivientes se contaron 1, 5 y 7 días después de la inyección para examinar la supervivencia tasa de abejas inyectados con solución salina insecto o disolvente para 20E solución antes del experimento 20E. A los 7 días después de la inyección, aproximadamente el 60-80% de las abejas inyectados estaban vivos, y la tasa de supervivencia de las abejas inyectados con disolvente para solución 20E fue comparable a la de solución salina insecto (Tabla 2). El efecto de la inyección 20E disminución de la expresión de tanto mrjp2 y Hgb3 en los HPGs (Figura 5) 16. Además de 20E, el efecto de la aplicación tópica en metopreno mrjp2 y Hbg3 (Tabla 3). Por otro lado, sólo aproximadamente el 20% a 30% de las abejas inyecta con acetona / solución salina abeja (1: 4) solución sobrevivieron 7 días después de la inyección cuando las abejas supervivientes se contaron 1, 3, 5 y 7 días después de la inyección (Tabla 4) . Por lo tanto, se adoptó el método de aplicación para el tratamiento metopreno. Aplicación de metopreno inhibió la expresión de mrjp2 y aumentó la expresión de Hbg3 (Figura 6) 16.

Figura 1
Figura 1. Visión general del experimento de colonias sola cohorte. (A) Esquema para la preparación de las colonias de una sola cohorte. (B) El curso temporal del experimento a partir de preparing colonias de una sola cohorte para la recogida de las abejas nodrizas y recolectores precoz. flecha horizontal indica el curso de la vida de un trabajador en las colonias de una sola cohorte. Los números con líneas verticales indican la edad de los trabajadores. Se informa no sólo de forraje precoces, sino también a las abejas nodrizas de edad superior (28-32 días de edad) que se encuentran en colonias de una sola cohorte 15. Por lo tanto, la comparación de la fisiología entre las abejas nodrizas de edad superior y recolectores se puede realizar en las colonias de una sola cohorte, aunque esto no se hizo en este estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Fotografías que muestran las tres clases de estados HPG. Desarrollado (A), Intermedio (B) y (C encogida Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Papel asociada a la expresión de mrjp2 y Hbg3 en los HPGs de los trabajadores de las colonias de una sola cohorte. El gráfico muestra una comparación de los niveles de mRNA de mrjp2 (A) y Hbg3 (B) en los HPGs entre las abejas nodrizas (N) y recolectores precoces (PF) de dos co-sola cohortelonies. El nivel de ARNm de cada gen se normalizó con la de la proteína ribosomal 49 (rp49). El nivel de ARNm relativa de cada gen en los HPGs Enfermera de la abeja se definió como 1. El nivel de ARNm de mrjp2 en algunos recolectores precoces no se pudo cuantificar debido a la intensidad de la señal inferiores al umbral de detección. Por lo tanto, el número de muestras difiere entre genes. relativa niveles de mRNA se indican con el error estándar. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las abejas nodrizas y recolectores precoces (*, p <0,05; prueba t). Esta cifra se ha reproducido de Ueno et al., (2015) 16. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Esquema del protocolo para injec 20Eción. Los procedimientos 2.3 y 2.4 en la sección de protocolo se ilustran en esta figura. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Efecto de la inyección 20E en mrjp2 y expresión Hbg3 en el HPGs 16. El gráfico muestra una comparación de los niveles de mRNA de mrjp2 (A) y Hbg3 (B) en los HPGs entre las abejas tratadas 20E-20E (+) y las abejas de control (20E-). Las cifras debajo de la gráfica indican el día después del tratamiento 20E. El nivel de ARNm de cada gen se normalizó con la del factor de elongación 1α-F2 (EF1α-F2). mRNA nivel relativo decada gen en los HPGs abeja de control se definió como 1. Los niveles de ARNm relativas se indican con un error estándar. Un asterisco indica una diferencia significativa entre las abejas tratadas-20E y las abejas de control (*, p <0,05; prueba t). Esta cifra se ha reproducido de Ueno et al., (2015) 16. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Efecto de la aplicación metopreno en mrjp2 y expresión Hbg3 en los HPGs 16. El gráfico muestra la comparación de los niveles de mRNA de mrjp2 (A) y Hbg3 (B) en los HPGs entre abejas metopreno tratados y las abejas de control. losel nivel de ARNm de cada gen se normalizó con la de EF1α-F2. mRNA nivel relativo de cada gen en los HPGs abeja de control se definió como 1. Los niveles de ARNm relativas se indican con el error estándar. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las abejas tratadas con metopreno y las abejas de control (*, p <0,05; prueba t). Esta cifra se ha reproducido de Ueno et al., (2015) 16. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nº de colonias comportamiento observado Número de individuos en cada clase HPG
Desarrollado Intermedio Encogido Total
1 Enfermería 8 1 1 10
forrajeo 0 4 7 11
2 Enfermería 4 2 0 6
forrajeo 0 0 5 5

Tabla 1: Clasificación de HPGs de los trabajadores cuya enfermería o el comportamiento de alimentación se observó en las colonias de una sola cohorte. tamaño de HPG en los trabajadores de dos colonias de una sola cohorte (nos 1 y 2 de la colonia.) se agrupan en tres clases; "Desarrollados", "Intermedio" y "encogido" por tamaño.

Días después de la inyección sin inyección solución salina insectos Disolvente para soln 20E
Prueba 1 Day0 15/15 15/15 14/15
Día 1 15/15 14/15 13/15
day5 14/15 13/15 11/15
day7 14/15 12/15 9/15
ensayo 2 Day0 15/15 15/15 15/15
Día 1 15/15 13/15 15/15
day5 15/15 11/15 12/15
day7 14/15 10/15 12/15

Tabla 2: Tasa de supervivencia de las abejas inyectados con disolvente para solución 20E. Quince trabajadores se prepararon en cada grupo experimental.

Días después de la aplicación Acetona metopreno
Prueba 1 día 0 7/7 8/8
Día 7 7/7 6/8
ensayo 2 día 0 7/7 8/8
Día 7 7/7 8/8

Tabla 3: Tasa de supervivencia de las abejas tratadas con metopreno siete a ocho trabajadores fueron preparados de cada grupo experimental..

Días después de la inyección sin inyección La acetona / solución salina Bee (1: 4)
día 0 15/15 15/15
Día 1 15/15 6/15
Día 3 15/15 5/15
día 5 15/15 4/15
Día 7 15/15 4/15

Tabla 4: Tasa de supervivencia de las abejas inyectados con solución salina acetona / abeja (1: 4). Quince trabajadores solución se prepararon para cada grupo experimental. solución salina Acetona / abeja (1: 4) la solución se inyectó en el abdomen de los trabajadores. La composición de la solución salina de abeja es NaCl 130 mM, KCl 6, 4 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, sacarosa 160 mM, glucosa 25 mM, y HEPES 10 mM (pH 7,0).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Preparación de colonias de una sola cohorte

Aquí describimos el protocolo utilizado en nuestro estudio anterior 16 para preparar colonias de una sola cohorte para el análisis de HPG fisiología asociada con el cambio en el papel de las abejas obreras. Se observaron las abejas nodrizas y recolectores precoces que cumplieran los criterios descritos en los procedimientos de 1.6-1.7 y Figura 2 en las colonias de una sola cohorte (Tabla 1). Las fotografías de la Figura 2 serían útiles en la clasificación de HPG establece como referencia. Criterios basados ​​en el comportamiento tanto de los trabajadores y el desarrollo HPG son válidas para la definición de las abejas nodrizas o de forraje en las colonias típicas. Cambio de rol de la enfermería a la búsqueda de alimento gradualmente avanza en esas colonias: la cantidad de tiempo invertido en el comportamiento de enfermería disminuye gradualmente mientras que en el comportamiento de alimentación aumenta gradualmente durante el cambio de papel 2. Por lo tanto, sería difícil recoger los trabajadores que exclusivamenterealizar la lactancia o forrajeo por único criterio de comportamiento. El resultado que la expresión de mrjp2 y Hbg3 en los HPGs se asocia con el papel de los trabajadores indica claramente que el protocolo descrito aquí puede ser adoptado para examinar HPG la fisiología en las abejas nodrizas y recolectores precoces de colonias de una sola cohorte (Figura 3). Criterios basados ​​en el comportamiento tanto de los trabajadores y el desarrollo HPG también podrían ser aplicables en la definición de las abejas nodrizas y recolectores precoces de las colonias de una sola cohorte. Además de los HPGs, otras glándulas exocrinas en la cabeza se someten a cambios fisiológicos en asociación con el desplazamiento de papel. Por ejemplo, la función de los cambios de las glándulas mandibulares de la síntesis de ácidos grasos para la alimentación de cría a la síntesis de alarma feromona 2-heptanona 2. El protocolo se describe aquí puede, pues, ser adaptado para examinar la fisiología de rol asociado de las glándulas exocrinas que no sean los HPGs.

colección exitosa de nURSE abejas recolectoras y precoces de colonias de una sola cohorte depende de la colección de un número suficiente de trabajadores recién emergidas cuando se preparan las colonias. Si se recoge un gran número de trabajadores recién emergidas, sería difícil reunir suficiente abejas nodrizas y recolectores precoces. Además, la condición de las reinas es otro punto clave para la recogida de muestras éxito. Queens con un gran abdomen son buenos para la puesta de huevos debido a que estas reinas por lo general han desarrollado ovarios. Por lo tanto, se cree que el trabajo de los trabajadores que se divide con eficacia incluso en colonias de una sola cohorte porque la prole se suministra constantemente por la reina. Si no se proporciona la cría, sería difícil recoger las abejas nodrizas de las colonias de una sola cohorte. Por último, el marcado de los trabajadores que utilizan la pintura de carteles es necesario para garantizar que los trabajadores se recogen de colonias de una sola cohorte, debido a las recolectoras de vez en cuando vuelven a la colonia equivocada. Para recoger las recolectoras precoces de manera efectiva, las marcas de pintura se debeaplicado a la mayor cantidad posible de trabajadores (más de 900 trabajadores recién emergidas por colonia de una sola cohorte). El uso de la tinta a base de agua para el marcado puede ser recomendable, debido a que una tinta a base de aceite, que por lo general contiene compuestos orgánicos volátiles, puede interrumpir la comunicación química entre las abejas. Las marcas de tinta a base de agua no se desvaneció muy mucho durante el curso del experimento.

El tratamiento hormonal

También describimos el protocolo para la inyección de 20E en las cabezas de los trabajadores para examinar el efecto de la ecdisona en la fisiología HPG (mrjp2 y expresión Hbg3). La tasa de supervivencia de las abejas inyectado con solución salina de insectos o el disolvente para 20E solución era suficiente para el análisis posterior, lo que indica que el protocolo descrito aquí para la inyección usando una punta de inyección y disolvente para 20E solución puede ser adoptada para el experimento de inyección 20E (Tabla 2 ). Además, la comparación de la expresión génica en las HPGsentre las abejas tratadas-20E y las abejas de control indicó que la 20E inyectado cambió la expresión de mrjp2 y Hbg3, ambos de los cuales están relacionados con la función de HPG (Figura 5). Este resultado sugiere que el protocolo descrito aquí sería útil para examinar los efectos de la ecdisona en HPG fisiología, y puede ser adoptado para el examen de otras glándulas exocrinas en la cabeza, como las glándulas mandibulares. Además, el método de inyección puede ser adoptado para la inyección de otras sustancias químicas. Por ejemplo, el protocolo descrito aquí sería apropiado para la inyección de soluciones de doble cadena de ARN en las cabezas de los experimentos de genes desmontables.

Además de 20E, se describe un protocolo para la aplicación de metopreno, que es un análogo de JH. Metopreno se aplica generalmente en el abdomen. Por otro lado, metopreno se aplica a la cabeza de los trabajadores, aquí. Casi todas las abejas con la aplicación tópica de metopreno o acetona sobrevivieron 7 días después del tratamiento, Lo que sugiere que la aplicación de metopreno 5 l o solución de acetona a las cabezas tiene poco efecto sobre la tasa de supervivencia trabajador (Tabla 3). Además, la comparación de mrjp2 y expresión Hbg3 en los HPGs entre methoprene- y abejas tratado con acetona indica que la aplicación metopreno inhibe la expresión mrjp2 y aumenta la expresión Hbg3 (Figura 6). Estos resultados sugieren que el protocolo descrito aquí es apropiado para el análisis de los efectos de metopreno en la fisiología de las glándulas exocrinas tales como las HPGs en la cabeza.

tratamiento hormonal éxito depende de la tasa de supervivencia de las abejas tratadas. la exposición a baja temperatura en un refrigerador puede ser apropiado para anestesiar a las abejas. Anestesia en el hielo no se recomienda porque las abejas se mojará en el hielo, lo que lleva a una baja tasa de supervivencia. Por otra parte, el método de inyección podría ser otro punto clave para mantener abejas vivo. Es importante mome la punta de inyección largas y delgadas, y para darle forma a una punta afilada con el cortador para minimizar el daño a las abejas por inyección. Sin embargo, el método de inyección podría no ser apropiado para examinar los efectos de metopreno en HPG fisiología, porque la acetona disolvente para metopreno afecta negativamente a la supervivencia de las abejas (Tabla 4). Además, el método de inyección descrito aquí puede no ser apropiado para el análisis del comportamiento en las colonias de abejas inyectados serían excluidos de sus colonias cuando se reintroducen después de la inyección. Los trabajadores con lesiones leves pueden ser excluidos de las colonias. Otros métodos, tales como la aplicación o administración oral de hormona pueden ser apropiados para el análisis del comportamiento.

La colonia de una sola cohorte se ha utilizado para examinar la regulación de la división del trabajo de las abejas obreras 10,11. Además, el tratamiento con hormona juvenil se ha utilizado para el estudio de la conducta y del cerebro functien relación con la división del trabajo 11. Sin embargo, los protocolos detallados para la preparación de las colonias de una sola cohorte y el tratamiento con JH no ha sido proporcionado previamente en tal detalle. Recientemente, la importancia de la ecdisona en la división del trabajo son cada vez más reconocido, y la regulación de la división del trabajo por tanto JH y ecdisona se sugiere 23. Los protocolos detallados para la preparación con éxito de las colonias de una sola cohorte y el tratamiento hormonal como JH y ecdisona se describe en este artículo podrían contribuir al avance en el estudio de la fisiología de los trabajadores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UNIPOSCA Mitsubishi pencil PC-5M Marker pen for the application of marks to bees  
20-hydroxyecdysone Sigma Aldrich H5142
Methoprene Sigma Aldrich 33375
Breeding case insect IRIS OHYAMA CP-SS
Electromotion mixier  ISO 23M-R25 homogenization of tissue
TRIZol Reagent Invitrogen 15596-026 the reagent for total RNA extraction
DNase I  Takara 2270A
PrimeScript RT reagent kit Takara RR037A the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II Takara RR820A the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument Roche 12011468001 the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl) Roche 4929292001 the material for real-time PCR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, E. O. The insect societies. Harvard university press. (1971).
  2. Winston, M. L. The biology of the honey bee. Harvard university press. (1987).
  3. Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34, (4), 299-345 (1952).
  4. Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
  5. Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119, (2), 291-295 (1996).
  6. Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249, (3), 797-802 (1997).
  7. Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265, (1), 127-133 (1999).
  8. Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221, (2), 380-385 (1996).
  9. Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26, (8), 557-563 (2009).
  10. Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246, (4926), 109-112 (1989).
  11. Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37, (1), 1-14 (2000).
  12. Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296, (5568), 741-744 (2002).
  13. Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209, (Pt 14), 2774-2784 (2006).
  14. Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6, (7), e22195 (2011).
  15. Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302, (5643), 296-299 (2003).
  16. Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10, (6), e0130206 (2015).
  17. Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14, (1), 9-15 (2005).
  18. Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10, (5), 487-494 (2001).
  19. Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24, (6), 596-603 (2007).
  20. Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56, (3), 271-276 (2010).
  21. Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206, (Pt 14), 2507-2515 (2003).
  22. Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15, (3), 225-235 (1998).
  23. Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
Preparación de colonias individuales-cohortes y tratamiento con hormona del trabajador abejas para analizar la fisiología asociada con clases, y / o Sistema Endocrino
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).More

Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter