Summary
نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا لإعداد طوائف نحل العسل-فوج واحدة - أداة مفيدة لتحليل علم وظائف الأعضاء العامل المرتبط الدور. وصفنا أيضا بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لعلاج العاملين مع هرمون الشباب وإكديسون لتقييم مشاركة هذه الهرمونات في تنظيم السلوك عامل و / أو علم وظائف الأعضاء.
Introduction
نحل العسل الأوروبي، mellifera أبيس، هو حشرة eusocial مع مجتمع منظم للغاية 1. ويشارك نحل العسل عامل (الطبقة العاملة) في المهام المختلفة للحفاظ على النشاط مستعمرة، وتغيير هذه المهام وفقا لعمر النحل العامل بعد eclosion، والتي يشار اليها على انها تقسيم المرتبطة بالعمر العمل 2-4. العمال الشباب (<13 يوما) رعاية الحضنة في الخلية عن طريق إفراز غذاء ملكات النحل (النحل ممرضة)، في حين أن العمال كبار السن (> 15 يوما من العمر) جمع الرحيق وحبوب اللقاح خارج الخلية (علافات) 2-4. علم وظائف الأعضاء من العمال يتغير بالاشتراك مع هذا التحول الدور. على سبيل المثال، وظيفة الغدد البلعوم السفلي (HPGs)، إقران الغدد خارجية الإفراز تقع في الرأس، والتغيرات بالتعاون مع تحول الدور من التمريض لتستخدم علفا 2،5. HPGs ممرضة النحل أساسا توليف البروتين غذاء ملكات النحل الكبرى، والتي هي المكونات الرئيسية للحليب النحل. من ناحية أخرى، HPGs المؤن بشكل رئيسيتركيب إنزيمات استقلاب الكربوهيدرات، مثل α جلوكوزيد الثالث، لمعالجة الرحيق إلى عسل عن طريق تحويل السكروز إلى جلوكوز وفركتوز. كشفت دراساتنا السابقة أن التعبير عن mrjp2، الذي يشفر بروتين غذاء ملكات النحل كبير، وHbg3، الذي يشفر الفا جلوكوزيد الثالث، والتغيرات خلال تحويل دور 6-9.
لتحديد ما إذا كانت التغيرات الفسيولوجية في الأنسجة عامل، بما في ذلك HPGs، ويرتبط مع تحول دور أو مع سن العمال، سيكون من المفيد لمعالجة التركيبة السكانية من مستعمرة نحل العسل، مثل لإعداد وحيدة الفوج المستعمرات التي عمال تقريبا نفس الفئة العمرية تنفيذ مهام مختلفة 10،11. روبنسون وآخرون (1989) ووصف طريقة لإقامة مستعمرة نموذجية واحدة (10). وتضم المستعمرات واحد-فوج البداية ملكة والعمال القديم 0-2 يوم. بعد عدة أيام من إقامة المستعمرات، عمال ALMمعاهدة الفضاء الخارجي في نفس العمر تولي مهام مختلفة. بعض العمال على أداء مهام التمريض كما هو الحال في مستعمرات نموذجية، في حين أن غيرهم من العمال أداء المهام تستخدم علفا للوقت أبكر من المعتاد، وبالتالي فهي تسمى علافات قبل الاوان. سوف مقارنات التعبير الجيني بين النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان توفير معلومات مفيدة عن علم وظائف الأعضاء المرتبط دور الأنسجة عامل 12-16. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لإعداد المستعمرات فوج واحدة لتحليل علم وظائف الأعضاء role- و / أو المرتبط بالعمر من HPGs 16. نحن أيضا وصف موجز كيفية فحص التعبير الجيني من mrjp2 وHbg3 التي كتبها الكمي العكسي سلسلة من ردود الفعل النسخ-البلمرة (RT-PCR) لتقييم HPG علم وظائف الأعضاء.
بالإضافة إلى تحليل علم وظائف الأعضاء العاملين في المستعمرات فوج واحد، النظر في نظام الغدد الصماء مهم لتحليل الآليات التنظيمية المرتبطة دور علم وظائف الأعضاء عامل. هرمون الشباب (JH)، الذي كنوسفل مثل هرمون "الوضع الراهن" في يرقات الحشرات، ويسرع التحول في الدور من التمريض إلى البحث عن الطعام في نحل العسل عامل 11. وعلاوة على ذلك، إكديسون، والذي يعرف باسم هرمون طرح الريش أثناء التحول، قد يكون متورطا في تحويل دور للجينات التي ترميز إكديسون يشير الجزيئات التي أعرب عنها في الهيئات الفطر، مركزا أعلى من الدماغ عامل 17-19. ولذلك، فإننا أيضا وصف بروتوكول مفصلة تستخدم في دراستنا السابقة 16 لعلاج العاملين مع 20E، وهو شكل نشط من إكديسون، والميثوبرين، والتماثلية JH، لتحليل تأثير نظام الغدد الصماء في HPG علم وظائف الأعضاء (التعبير عن mrjp2 وHbg3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المستعمرات وحيد الفوج
- إعداد ثلاث مستعمرات نحل العسل لإنشاء اثنين من المستعمرات فوج واحد والحصول على عدد كاف من العمال ظهرت حديثا.
- تأكد من أن بعض الشرانق في الخلايا الطرفية توج في أمشاط يكون بني العينين وبشرة المصطبغة عن طريق فتح أمشاط توج باستخدام الملقط. في حالة وجود هذه الشرانق في الخلايا مشط الطرفية، والأكثر من الشرانق في أمشاط كلها تظهر في حوالي 1-3 أيام.
- وفي وقت لاحق، وجمع أمشاط التي تحتوي على هذه الشرانق بعد أن يتم نقل جميع النحل الكبار ملتصقة مع فرشاة، ومزيج أمشاط من المستعمرات الثلاث لتقليل التباين بين المستعمرات.
- وضع أمشاط التي تم جمعها في مربع خلية فارغة واحتضان عند 33 درجة مئوية تحت الظروف الرطبة (> 60٪ الرطوبة النسبية). جمع ما يقرب من 6000 عامل ظهرت حديثا على مدى 3 أيام (3،000 العمال في مستعمرة) من أمشاط التي تم جمعها.
- تحديد كمية المصنوعالتمرير على أساس الوزن من خمسة عمال ظهرت حديثا جمعها عشوائيا من المستعمرات unmanipulated.
- تزن خمسة عمال ظهرت حديثا جمعها عشوائيا من المستعمرات unmanipulated باستخدام آلات وزنها.
ملاحظة: وزن خمسة عمال ظهرت حديثا عموما 500-600 ملغ. - تقدير كمية من عمال جمع بقسمة الوزن من العمال التي جمعتها متوسط وزن خمسة عمال ظهرت حديثا.
- تزن خمسة عمال ظهرت حديثا جمعها عشوائيا من المستعمرات unmanipulated باستخدام آلات وزنها.
- تطبيق علامات الطلاء على thoraces ما يقرب من 1800 عامل (900 عمال في مستعمرة) باستخدام علامات الطلاء ملصق المياه القائمة.
ملاحظة: علامة قابل للغسل والذي يستخدم لتطبيق الطلاء وهي مدرجة في جدول المواد. - إدخال ملكة وحوالي 3000 من العمال القديم 0-2 يوم إلى مربع خلية الجديد الذي يحتوي على اثنين من أمشاط، ومشط واحدة تحتوي على العسل وغبار الطلع كما الأطعمة المحفوظة ومشط فارغة آخر لوضع البيض من قبل الملكة. جمع المشط التي تحتوي على العسل وحبوب اللقاح الابام تتم إزالة مستعمرة unmanipulated أخرى بعد كل النحل ملتصقة.
ملاحظة: من المستحسن استخدام مربع خلية النووي (صغير الحجم مربع خلية). - جمع النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان مع علامات الطلاء 6-8 أيام بعد إنشاء المستعمرات فوج واحدة.
- إلى جمع النحل ممرضة، والتقاط العمال أن يضعوا رؤوسهم في خلايا مشط لرعاية الحضنة. استخدام ملاقط لجمع النحل ممرضة من أمشاط التي تحتوي على العديد من الحضنة والكبار العمال.
ملاحظة: إذا وضعت HPGs العمال جمعها عند تشريح كما هو موضح في الخطوة 1.7، يتم تعريف هؤلاء العمال كما النحل ممرضة. عقد thoraces بواسطة ملاقط ينصح لالتقاط العمال من أمشاط. - لجمع علافات، استخدام صافي الحشرات للقبض على العمال أن العودة الى خلاياه مع الأحمال حبوب اللقاح على أرجلها الخلفية.
ملاحظة: إذا HPGs العمال القبض تظهر تقلصت عند تشريح كما هو موضح في الخطوة 1.7، يتم تعريف هؤلاء العمال كما علافات.
- إلى جمع النحل ممرضة، والتقاط العمال أن يضعوا رؤوسهم في خلايا مشط لرعاية الحضنة. استخدام ملاقط لجمع النحل ممرضة من أمشاط التي تحتوي على العديد من الحضنة والكبار العمال.
- كلاسسيفي في HPG إلى ثلاث مجموعات، 'تطوير'، 'المتوسط'، و 'منكمش من خلال تشريح تحت مجهر تشريحي.
- تخدير 10-15 النحل في قفص الحشرات في الثلاجة لمدة 10-15 دقيقة حتى النحل لا يمكن أن تطير أو المشي. بعد ذلك، نقل النحل على الجليد وإكمال التخدير على الجليد لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يستغرق حوالي 15-20 دقيقة الكلي لتحقيق التخدير. إذا كان الوقت التخدير يحتاج إلى تقصير، ينبغي خفض عدد النحل في قفص 1-3 النحل في قفص. - تشريح الرأس عن الجسم مع مقص وملاقط. إصلاح الرأس على الشمع الأسنان وضعها على طبق بيتري مع دبابيس. إدراج اثنين من المسامير في الأسس التي قامت عليها هوائيات لإصلاح الرأس. نقع رؤساء الثابتة في المياه المالحة الحشرات (130 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 1 ملم CaCl 2).
- إزالة الجانب الأمامي للبشرة الرأس باستخدام الملقط غرامة وسكين الجراحية تحت المجهر مجهر.
ملاحظة: HPGs يمكن العثور عليها بسهولة في الرأس بعد إزالة جuticle. وHPG هي هيئة عنقودي موجود في جميع أنحاء الدماغ في الرأس. - إزالة الأنسجة القصبة الهوائية وهو نسيج غشائي بيضاء تحت بشرة. ثم، تشريح HPGs من الرأس عن طريق سحب ببطء لهم مع ملاقط.
- تصنيف HPGs مع عنيبات كبير ودائري باسم 'المتقدمة'. تصنيف HPGs مع عنيبات صغيرة ومشوهة باسم 'منكمش. تصنيف HPGs المقابلة لولا "تطوير" ولا "منكمش" على أنه "المتوسطة".
ملاحظة: الصور التمثيلية التي تظهر يشار إلى هذه الفئات الثلاث من الدول HPG في الشكل 2. - الموضوع 'المتقدمة' وHPGs "منكمش" لاستخراج الحمض النووي الريبي باسم 'ممرضة HPGs النحل "و" HPGs المؤن، على التوالي، والمقارنة بين التعبير الجيني في HPGs بين النحل ممرضة وعلافات (القسم 4).
- تخدير 10-15 النحل في قفص الحشرات في الثلاجة لمدة 10-15 دقيقة حتى النحل لا يمكن أن تطير أو المشي. بعد ذلك، نقل النحل على الجليد وإكمال التخدير على الجليد لمدة 5 دقائق.
2. حقن 20E
- جمع النحل ممرضة من المستعمرات النموذجية كما أن described في الإجراء 1.6.1.
ملاحظة: لا يمكن فحص HPGs في هذه النحل كما سيتم تربيتها النحل. - تخدير النحل في 4 درجات مئوية في الثلاجة (وليس على الجليد).
ملاحظة: يستغرق حوالي 30 دقيقة لتحقيق التخدير. إذا تم تقصير الوقت التخدير، ينبغي خفض عدد النحل في قفص 1-3 النحل في قفص. - باستخدام الملقط، لشل حركة النحل على الشمع الأسنان وضعها على طبق بيتري.
- حقن 1 ميكرولتر من حل 20E في الجانب الأمامي من الرأس باستخدام طرف حقن مصنوعة من micropipette الشعرية معايرة باستخدام مجتذب الزجاج إبرة.
- حل 20E في المياه المالحة الإيثانول الحشرات (130 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 1 ملم CaCl 2) خليط (1: 4) عند 2.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
- قم بتوصيل طرف الحقن لأنبوب المطاط، وربط طرف micropipette الأصفر إلى الجانب الآخر من الأنبوب.
- وضع 1 ميكرولتر من حل 20E على بارافيلم باستخدام micropipette، أمسك طرف micropipette الأصفر في الفم، وهود رسم الحل في غيض الحقن.
- إدراج غيض الحقن في قاعدة هوائيات، وحقن محلول التي تهب من خلال طرف micropipette الأصفر.
ملاحظة: بروتوكول هو مبين في هذه الخطوة هو طريقة الحقن تمثيلا، ولكن ينصح باستخدام آلة الحقن الآلي للسلامة عند الضرورة 20.
- الخلفي النحل حقن في أقفاص الحشرات في 33-36 درجة مئوية (درجة الحرارة المثالية هي 35 درجة مئوية) تحت الظروف المظلمة والرطبة (> 60٪ الرطوبة النسبية) لمدة 1 أو 3 أيام. العرض خليط الماء والعسل (1: 1) النحل. إذا لزم الأمر، الاعتماد على قيد الحياة النحل بعد الحقن.
3. تطبيق ميثوبرين
- جمع أمشاط التي تحتوي على الشرانق من المستعمرات نموذجية بعد أن يتم إزالة جميع النحل الكبار ملتصقة مع فرشاة. احتضان أمشاط في 33-36 درجة مئوية (درجة الحرارة المثالية هي 35 درجة مئوية) في الظروف الرطبة (> 60٪ الرطوبة النسبية) لمدة تصل إلى 1 يوم.
- بعد 6 أيام، وجمع العمال رسمت (عمره 6 أيام) من المستعمرات. التقاط العمال رسمت من أمشاط من خلال عقد thoraces مع ملاقط.
- تخدير النحل في 4 درجات مئوية في الثلاجة (وليس على الجليد) كما في الإجراء 2.2. باستخدام الملقط، لشل حركة النحل على الشمع الأسنان وضعها على طبق بيتري وتطبيق 1-5 ميكرولتر من محلول الميثوبرين (50-250 ميكروغرام / ميكرولتر) المذاب في الاسيتون على رؤوسهم باستخدام micropipette. استخدام الفلتر التي هي مقاومة للالأسيتون.
ملاحظة: الأسيتون قد يكون لها آثار ضارة على النحل يؤدي إلى الموت. إذا لوحظ ارتفاع معدل الوفيات من النحل، فمن المستحسن الحد من حجم الأسيتون إلى 1 ميكرولتر في الحد الأدنى. - الخلفي النحل في أقفاص الحشرات في 33-36 درجة مئوية (ر المثاليemperature هو 35 درجة مئوية) لمدة 7 أيام تحت الظروف المظلمة والرطبة (> 60٪ الرطوبة النسبية). العرض خليط الماء والعسل (1: 1) النحل. إذا لزم الأمر، الاعتماد على قيد الحياة النحل بعد التطبيق الموضعي.
ملاحظة: في هذه المقالة، تحسب النحل على قيد الحياة بعد 7 أيام التطبيق (الجدول 3).
4. استخراج الحمض النووي الريبي والكمية RT-PCR
- تخدير النحل وتشريح HPGs كما هو موضح في الخطوات 1.7.1 إلى 1.7.4.
- جمع HPGs تشريح في أنبوب microcentrifuge على الثلج الجاف ومخزن في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إضافة 400 ميكرولتر من كاشف لتمسخ البروتين.
ملاحظة: هذا كاشف متاح تجاريا (انظر جدول المواد). - تجانس الأنسجة HPG باستخدام باليد خلاط كهربائي مع مدقة التجانس الذي يناسب داخل أنبوب microcentrifuge. التجانس في سرعة دوران ما يقرب من 300 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة على الجليد لكسر وخلايا الأنسجة ليز.
جدول المواد). - إضافة 80 ميكرولتر الكلوروفورم وتخلط جيدا. احتضان لمدة 5 دقائق على RT.
- أنابيب الطرد المركزي microcentrifuge في 14170 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد. إضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول و1 الجليكوجين ميكرولتر (5 ملغ / مل). احتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
- أنابيب الطرد المركزي microcentrifuge في 14170 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
- إضافة 400 ميكرولتر من الايثانول 75٪ لبيليه وتخلط جيدا، الطرد المركزي أنابيب microcentrifuge في 14170 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف. كرر هذه الإجراءات مرة أخرى.
- الهواء الجاف وبيليه لمدة 5-10 دقائق ثم حله في 10 المياه خالية من ريبونوكلياز ميكرولتر.
ملاحظة: تجفيف كاملة من بيليه قد يسبب بإينسولبيلايزيشين من بيليه RNA في الماء. وهكذا، فإن بيليه الذي هو الرطب قليلا مناسب لتذويب. - قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام معمل مثل معمل NanoDrop أو ما شابه ذلك.
- علاج 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع مع 2.0 U من الدناز أنا التي يحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للحط من أي الحمض النووي الجيني تلوث.
- عكس نسخ 200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي تعامل I-الدناز وتنفيذ الوقت الحقيقي PCR باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا (انظر القائمة في جدول المواد والكواشف) والاشعال الجينات المحددة (mrjp2، 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3، و 5 "-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3"، Hbg3، 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 "و 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3 '). أداء PCR على النحو التالي: [95 ° C × 30 ثانية + (95 ° C × 5 ثانية + 60 ° C × 15 ثانية + 72 ° C × 20 ثانية) × 45-55 دورات].
- تطبيع كمية من نسخة مع أن عامل استطالة 1α-F2 (EF1α˗F2) أو الريباسي بروتين 49 (rp49) 9،16،21،22. هذه الجينات هي السيطرة موثوق زأنيس لتحليل التعبير الجيني في HPGs باستخدام QRT-PCR.
- إجراء عمليتين الذيل اختبار t للكشف عن اختلافات كبيرة بين مجموعتين التجربة (النحل ممرضة مقابل علافات قبل الاوان، النحل المعالجة 20E مقابل النحل السيطرة، والنحل المعالجة الميثوبرين مقابل النحل السيطرة) باستخدام البرامج الإحصائية.
ملاحظة: إذا كان يفترض F-اختبار تجانس التباين، تي الطالب اختبار يمكن استخدامها. إذا لم يكن كذلك، اختبار t ولش يمكن استخدامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتضح لمحة عامة عن بروتوكول لإعداد المستعمرات فوج واحد في الشكل 1A. يظهر الوقت طبعا التجارب من إعداد المستعمرات فوج واحد لأخذ عينات جمع في الشكل 1B. تم جمع العمال التي استوفت المعايير السلوكية للسلوك التمريض أو السلوك تستخدم علفا من المستعمرات فوج واحد، وقدر تنمية HPG في هؤلاء العمال ويبين الجدول 1 تصنيف للتنمية HPG إلى ثلاث مجموعات؛ 'تطوير'، 'المتوسط'، و 'منكمش "وفقا لحجم. يشار إلى الصور التمثيلية تظهر هذه الفئات الثلاث من HPGs في الشكل (2). وتشير النتائج إلى أن كلا من النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان، وفقا لمعايير موضح في البروتوكول، كما لوحظ في المستعمرات فوج واحدة. التعبير عن mrjp2 وHbg3 في HPGs كان ENriched في النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان، على التوالي، مشيرا إلى أن وظيفة HPG يرتبط دور العامل (الشكل 3) 16.
ويتضح هذا الإجراء لحقن 20E إلى رؤساء عامل في الشكل (4). احصي النحل على قيد الحياة 1، وبعد 5 و 7 أيام حقن للنظر في البقاء على قيد الحياة معدل النحل حقن مع المياه المالحة الحشرات أو مذيبة لل20E حل قبل التجربة 20E. في 7 أيام بعد الحقن، وكانت حوالي 60-80٪ من النحل حقن على قيد الحياة، وكان معدل البقاء على قيد الحياة من النحل حقن مذيب للحل 20E مشابه لذلك مع المياه المالحة الحشرات (الجدول 2). تأثير حقن 20E انخفض التعبير من كلا mrjp2 وHgb3 في HPGs (الشكل 5) 16. بالإضافة إلى 20E، وأثر تطبيق الميثوبرين موضعي على mrjp2 وHbg3 (الجدول 3). من ناحية أخرى، فقط ما يقرب من 20٪ إلى 30٪ من النحل حقن مع الأسيتون / النحل المالحة (1: 4) نجا حل بعد 7 أيام حقن عند فرز النحل على قيد الحياة 1، 3، بعد 5 و 7 أيام حقن (الجدول 4) . وهكذا، تم اعتماد طريقة التطبيق لتلقي العلاج الميثوبرين. تطبيق الميثوبرين تحول دون التعبير عن mrjp2 وتعزيز التعبير عن Hbg3 (الشكل 6) (16).
الشكل 1. نظرة عامة-فوج واحد تجربة مستعمرة. (A) خطة لإعداد المستعمرات فوج واحدة. (ب) الوقت لمسار التجربة من preparinز المستعمرات فوج واحدة لجمع النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان. يشير السهم الأفقي مجرى حياة كل عامل في المستعمرات فوج واحدة. الأرقام مع خطوط عمودية تشير سن العامل. وتفيد التقارير ليس فقط علافات قبل الاوان ولكن أيضا النحل ممرضة overaged (28-32 يوما) التي يمكن العثور عليها في المستعمرات فوج واحد (15). وبالتالي، مقارنة فسيولوجيا بين النحل ممرضة overaged وعلافات لا يمكن أن يؤديها في المستعمرات فوج واحد، على الرغم من أن هذا لم يحدث في هذه الدراسة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صور تبين فئات ثلاث من الدول HPG. المتقدمة (A) والمتوسط (B)، ومنكمش (C الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التعبير عن mrjp2 وHbg3 في HPGs العمال من المستعمرات فوج واحد المصاحب دور. يعرض الرسم البياني مقارنة مستويات مرنا من mrjp2 (A) وHbg3 (ب) في HPGs بين النحل ممرضة (N) وعلافات قبل الاوان (PF) من يومين فوج واحد شاركlonies. تم تطبيع مستوى مرنا من كل جين مع أن من البروتين الريباسي 49 (rp49). تم تعريف مستوى مرنا نسبيا من كل جين في HPGs النحل ممرضة ك 1. لا يمكن قياسها على مستوى مرنا من mrjp2 في بعض علافات قبل الاوان بسبب شدة إشارة أقل من عتبة الكشف. ولذلك، فإن عدد العينات يختلف بين الجينات. يشار إلى مستويات مرنا النسبية مع الخطأ المعياري. النجمة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان (*، ف <0.05، اختبار t). وقد تم استنساخ هذا الرقم من أوينو وآخرون، (2015) 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. مخطط للبروتوكول للinjec 20Eنشوئها. إجراءات 2.3 و 2.4 في قسم البروتوكول موضحة في هذا الرقم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تأثير حقن 20E على mrjp2 والتعبير Hbg3 في HPGs 16. ويوضح الرسم البياني مقارنة مستويات مرنا من mrjp2 (A) وHbg3 (ب) في HPGs بين النحل يعالج 20E (20E +) والنحل التحكم (20E-). الأرقام تحت الرسم البياني تشير إلى اليوم بعد العلاج 20E. تم تطبيع مستوى مرنا من كل جين مع أن عامل استطالة 1α-F2 (EF1α-F2). مستوى مرنا النسبي للوقد تم تعريف كل جين في HPGs النحل السيطرة كما يشار إلى 1. مستويات مرنا النسبية مع الخطأ المعياري. نجمية يشير إلى وجود فرق كبير بين النحل يعالج 20E-والنحل التحكم (*، ف <0.05، اختبار t). وقد تم استنساخ هذا الرقم من أوينو وآخرون، (2015) 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. تأثير تطبيق الميثوبرين على mrjp2 والتعبير Hbg3 في HPGs 16. ويوضح الرسم البياني مقارنة مستويات مرنا من mrjp2 (A) وHbg3 (ب) في HPGs بين النحل المعالجة الميثوبرين والنحل السيطرة. التم تطبيع مستوى مرنا من كل جين مع أن من EF1α-F2. وقد عرفت مستوى مرنا نسبيا من كل جين في HPGs النحل السيطرة كما يشار إلى 1. مستويات مرنا النسبية مع الخطأ المعياري. النجمة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين النحل المعالجة الميثوبرين والنحل التحكم (*، ف <0.05، اختبار t). وقد تم استنساخ هذا الرقم من أوينو وآخرون، (2015) 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مستعمرة رقم | السلوك الملاحظ | عدد الأفراد في كل فئة HPG | |||
| المتقدمة | متوسط | منكمش | مجموع | ||
| 1 | تمريض | 8 | 1 | 1 | 10 |
| بحث عن للمؤن | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | تمريض | 4 | 2 | 0 | 6 |
| بحث عن للمؤن | 0 | 0 | 5 | 5 | |
الجدول 1: تصنيف HPGs من العمال الذين التمريض أو البحث عن الطعام السلوك لوحظ في المستعمرات فوج واحدة. حجم HPG في العمال من اثنين من المستعمرات فوج واحد (غ مستعمرة 1 و 2). وقد صنفت إلى ثلاث فئات. 'تطوير'، 'الوسيط' و 'منكمش "حسب الحجم.
| أيام بعد الحقن | لا حقن | المالحة الحشرات | مذيب للsoln 20E | |
| محاكمة 1 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| اليوم 1 | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| Day5 | 14/15 | 13/15 | 11/15 | |
| Day7 | 14/15 | 12/15 | 15/09 | |
| محاكمة 2 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| اليوم 1 | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| Day5 | 15/15 | 11/15 | 12/15 | |
| Day7 | 14/15 | 10/15 | 12/15 |
الجدول 2: معدل البقاء على قيد الحياة من النحل حقن مذيب لل20E حل. وقد أعدت خمسة عشر العمال في كل مجموعة التجريبية.
| يوما بعد التطبيق | الأسيتون | الميثوبرين | |
| محاكمة 1 | اليوم 0 | 7/7 | 8/8 |
| اليوم 7 | 7/7 | 6/8 | |
| محاكمة 2 | اليوم 0 | 7/7 | 8/8 |
| اليوم 7 | 7/7 | 8/8 |
الجدول 3: معدل البقاء على قيد الحياة من النحل تعامل مع الميثوبرين تم إعداد سبعة إلى ثمانية عمال في كل مجموعة التجريبية.
| أيام بعد الحقن | لا حقن | الأسيتون / النحل المالحة (1: 4) |
| اليوم 0 | 15/15 | 15/15 |
| اليوم 1 | 15/15 | 15/06 |
| يوم 3 | 15/15 | 15/05 |
| يوم 5 | 15/15 | 4/15 |
| اليوم 7 | 15/15 | 4/15 |
الجدول 4: معدل البقاء على قيد الحياة من النحل حقن مع المياه المالحة الأسيتون / النحل (1: 4). الحل تم إعداد خمسة عشر العمال لكل مجموعة التجريبية. الأسيتون / النحل المالحة (1: 4) تم حقن المحلول في البطن عامل. تكوين المالحة النحل هو 130 مم كلوريد الصوديوم، 6 ملي بوكل، 4MM MgCl 2، 2.5 ملي CaCl 2، 160 ملم السكروز، 25 ملي الجلوكوز، و 10 ملي HEPES (7.0 درجة الحموضة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعداد المستعمرات فوج واحدة
نحن هنا وصف البروتوكول المستخدم في دراستنا السابقة 16 إلى إعداد المستعمرات فوج واحدة لتحليل HPG علم وظائف الأعضاء المرتبطة التحول في دور الشغالات. وقد لوحظت النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان أن استوفت المعايير المحددة في إجراءات 1،6-1،7 والشكل 2 في المستعمرات فوج واحد (الجدول 1). أن الصور في الشكل 2 أن تكون مفيدة في تصنيف HPG ينص كمرجع. معايير تستند إلى كل من السلوك عامل والتنمية HPG صالحة لتحديد النحل ممرضة أو علافات في المستعمرات النموذجية. تحول دور من التمريض لتستخدم علفا تدريجيا العائدات في تلك المستعمرات: كمية الوقت الذي يقضيه في سلوك التمريض ينخفض تدريجيا في حين أنه في السلوك تستخدم علفا يزيد تدريجيا خلال دور التحول 2. وهكذا، فإنه سيكون من الصعب جمع العمال التي حصراأداء التمريض أو البحث عن الطعام وفقا لمعايير سلوكية فقط. ونتيجة لذلك تعبير عن mrjp2 وHbg3 في HPGs يرتبط دور العمال يشير بوضوح إلى أن بروتوكول الموصوفة هنا يمكن اعتمادها لدراسة علم وظائف الأعضاء HPG في النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان من المستعمرات فوج واحد (الشكل 3). يمكن أن معايير تستند إلى كل من السلوك عامل والتنمية HPG أن تنطبق أيضا في تحديد النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان من المستعمرات فوج واحدة. بالإضافة إلى HPGs والغدد خارجية الإفراز أخرى في الرأس تخضع التغيرات الفسيولوجية في تكوين الجمعيات مع تحول الدور. على سبيل المثال، وظيفة التغييرات الغدة الفك السفلي من تركيب الأحماض الدهنية للغذاء الحضنة لتركيب فرمون منبه 2-heptanone 2. وبالتالي يمكن تكييفها بروتوكول صفها هنا لدراسة علم وظائف الأعضاء المرتبط دور الغدد خارجية الإفراز غير HPGs.
مجموعة ناجحة من نالنحل urse وعلافات قبل الاوان من المستعمرات فوج واحد يعتمد على جمع عدد كاف من العمال ظهرت حديثا عند إعداد المستعمرات. إذا تم جمعها عدد قليل من العمال ظهرت حديثا، فإنه سيكون من الصعب جمع النحل ممرضة وعلافات قبل الاوان بما فيه الكفاية. وعلاوة على ذلك، فإن حالة من الملكات هي نقطة رئيسية أخرى لجمع العينات ناجحة. كوينز مع كبير البطن جيدة لوضع البيض لأن هذه الملكات عادة قد وضعت المبايض. وبالتالي، يعتقد أن العمل من العمال تقسم على نحو فعال حتى في المستعمرات فوج واحد ليتم تزويد الحضنة باستمرار من قبل الملكة. إذا تم توفير أي الحضنة، فإنه سيكون من الصعب جمع النحل ممرضة من المستعمرات فوج واحدة. وأخيرا، بمناسبة العمال الذين يستخدمون الطلاء ملصق هو مطلوب لضمان أن يتم جمع العمال من المستعمرات فوج واحد، لأن علافات تعود أحيانا إلى مستعمرة خاطئة. لجمع علافات قبل الاوان على نحو فعال، يجب أن تكون علامات الطلاءتطبيق لأكبر عدد من العمال وقت ممكن (أكثر من 900 عامل ظهرت حديثا في مستعمرة نموذجية واحدة). قد يوصى استخدام المياه القائمة على الحبر لوسم، لأن الحبر التي تعتمد على النفط، والتي عادة ما تحتوي على المركبات العضوية المتطايرة، قد يعرقل التواصل الكيميائي بين النحل. لم علامات المياه القائمة على الحبر لا تتلاشى كثيرا أثناء التجربة.
العلاج الهرموني
وصفنا على بروتوكول لحقن 20E إلى رؤساء العمال لدراسة تأثير إكديسون على HPG علم وظائف الأعضاء (mrjp2 والتعبير Hbg3). وكان معدل البقاء على قيد الحياة من النحل حقن مع المياه المالحة الحشرات أو مذيبة لل20E حلا كافيا لتحليلها لاحقا، مشيرا إلى أن بروتوكول وصف هنا للحقن باستخدام طرف الحقن ومذيب لل20E حل يمكن اعتمادها للتجربة حقن 20E (الجدول 2 ). وعلاوة على ذلك، مقارنة في التعبير الجيني في HPGsبين النحل يعالج 20E-والنحل السيطرة أشار إلى أن 20E حقن تغير التعبير عن mrjp2 وHbg3، وكلاهما ترتبط وظيفة HPG (الشكل 5). هذه النتيجة تشير إلى أن البروتوكول الموصوفة هنا سيكون مفيدا لدراسة آثار إكديسون على HPG علم وظائف الأعضاء، ويمكن اعتماد لفحص الغدد خارجية الإفراز أخرى في الرأس، مثل الغدد الفك السفلي. وعلاوة على ذلك، يمكن اعتماد طريقة الحقن لحقن المواد الكيميائية الأخرى. على سبيل المثال، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يكون مناسبا لحقن حلول RNA المزدوج تقطعت بهم السبل في رؤساء لتجارب إسقاط الموروثة.
بالإضافة إلى 20E، وصفنا بروتوكول لتطبيق الميثوبرين، وهو التناظرية JH. عادة يتم تطبيق الميثوبرين في البطن. من ناحية أخرى، تم تطبيق الميثوبرين لرئيس العمال، هنا. تقريبا كل النحل مع التطبيق الموضعي للالميثوبرين أو الأسيتون نجا بعد 7 أيام العلاج، مما يشير إلى أن تطبيق الميثوبرين 5 ميكرولتر أو حل الأسيتون لرؤساء له تأثير يذكر على معدل البقاء على قيد الحياة عامل (الجدول 3). وعلاوة على ذلك، مقارنة mrjp2 والتعبير Hbg3 في HPGs بين methoprene- والنحل المعالجة الأسيتون إلى أن تطبيق الميثوبرين يمنع التعبير mrjp2 ويعزز Hbg3 التعبير (الشكل 6). وتشير هذه النتائج إلى أن بروتوكول الموصوفة هنا هو المناسب لتحليل آثار الميثوبرين على فسيولوجيا الغدد خارجية الإفراز مثل HPGs في الرأس.
العلاج الهرموني الناجحة تعتمد على معدل البقاء على قيد الحياة من النحل المعالجة. التعرض درجات الحرارة المنخفضة في الثلاجة قد يكون مناسبا لالتخدير النحل. لا ينصح التخدير على الجليد لأن النحل سوف الحصول على الرطب على الجليد، مما يؤدي إلى بقاء معدل منخفض. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون طريقة الحقن نقطة رئيسية أخرى للحفاظ على النحل على قيد الحياة. ومن المهم أن مأك طرف حقن طويلة ورقيقة، وتشكيل لطرف حاد باستخدام القاطع للحد من الأضرار التي لحقت النحل عن طريق الحقن. ومع ذلك، قد لا تكون طريقة الحقن المناسب لدراسة آثار الميثوبرين على HPG علم وظائف الأعضاء، لأن الأسيتون مذيب للالميثوبرين يؤثر سلبا على بقاء النحل (الجدول 4). بالإضافة إلى ذلك، طريقة الحقن وصفها هنا قد لا يكون مناسبا للالتحليل السلوكي في المستعمرات كما ستستبعد النحل حقن من مستعمراتها عندما يعاد عرضه بعد الحقن. يمكن استبعاد العمال مع اصابة طفيفة من المستعمرات. أساليب أخرى، مثل تطبيق أو تناوله عن طريق الفم من هرمون قد يكون مناسبا لتحليل السلوك.
وقد استخدم مستعمرة فوج واحد لدراسة تنظيم وتقسيم العمل من النحل العامل 10،11. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام العلاج بهرمون الأحداث لدراسة السلوك والمخ functiعلى ذات الصلة لتقسيم العمل 11. ومع ذلك، بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لكل من إعداد المستعمرات فوج واحد والعلاج مع JH لم تقدم من قبل في مثل هذه التفاصيل. في الآونة الأخيرة، وأصبح الاعتراف بأهمية إكديسون في تقسيم العمل على نحو متزايد، واقترح تنظيم تقسيم العمل من قبل كل من JH وإكديسون 23. بروتوكولات مفصلة لنجاح إعداد المستعمرات فوج واحد والعلاج الهرموني مثل JH وإكديسون الموضحة في هذه المقالة قد تسهم في التقدم في دراسة علم وظائف الأعضاء عامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. The insect societies. , Harvard university press. (1971).
- Winston, M. L. The biology of the honey bee. , Harvard university press. (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
