Summary
Her beskriver vi vår detaljert protokoll for utarbeidelse av enkelt-kohort Honeybee kolonier - et nyttig verktøy for å analysere rollen assosierte arbeidstaker fysiologi. Vi beskriver også detaljerte protokoller for behandling av arbeidstakere med juvenil hormon og -ekdyson å evaluere involvering av disse hormonene i reguleringen av arbeideren atferd og / eller fysiologi.
Introduction
Den europeiske honningbie, Apis mellifera, er en eusocial insekt med et organisert samfunn 1. Worker honningbier (arbeidskraft kaste) er engasjert i ulike oppgaver for å opprettholde koloni aktivitet, og disse oppgavene endres i henhold til arbeidstake honningbie alder etter eklosjonshormon, som er referert til som aldersrelatert arbeidsdeling 2-4. Unge arbeidstakere (<13 dager gamle) tar seg av stamfisk i bikuben ved å skille royal gelé (sykepleier bier), mens eldre arbeidstakere (> 15 dager gammel) samle nektar og pollen utenfor bikuben (nitter) 2-4. Fysiologi av arbeiderne endringer i forbindelse med denne rollen skift. For eksempel funksjonen til hypopharyngeal kjertler (HPGs), sammen eksokrine kjertler som ligger i hodet, endringer i forbindelse med rollen skifte fra sykehjem til beite 2,5. Sykepleier bee HPGs hovedsakelig syntetisere store kongelige gel proteiner, som er viktige komponenter i bee melk. På den annen side, nitter HPGs hovedsakeligsyntetisere karbohydrat-metaboliserende enzymer, slik som α-glukosidase III, for å behandle nektar til honning ved omdannelse av sukrose til glukose og fruktose. Våre tidligere undersøkelser avslørte at ekspresjonen av mrjp2, som koder for et stort Royal Jelly protein, og Hbg3, som koder for α-glukosidase III, forandringer i løpet av den rollen skift 6-9.
For å avgjøre om de fysiologiske endringer i arbeider vev, inkludert HPGs, er assosiert med rollen skift eller med en alder av arbeiderne, ville det være nyttig å manipulere befolkningen sammensetningen av en bie koloni, som for eksempel å forberede single-kohorten kolonier der arbeidstakerne på nesten samme alder utføre forskjellige oppgaver 10,11. Robinson et al. (1989) beskrives en fremgangsmåte for å etablere en enkelt-kohort koloni 10. Single-cohort kolonier i første omgang omfatte en dronning og 0-2 dag gamle arbeidere. Flere dager etter å etablere kolonier, arbeidere av almost på samme alder anta forskjellige oppgaver. Noen arbeidere utføre sykepleieroppgaver som i typiske kolonier, mens andre arbeidstakere utfører foraging oppgaver tidligere enn vanlig, og blir derfor kalt veslevoksen nitter. Genuttrykk sammenligninger mellom sykepleier bier og veslevoksen nitter vil gi nyttig informasjon om rollen assosierte fysiologi arbeidstaker vev 12-16. Her beskriver vi en detaljert protokoll for å forberede enkelt kohortstudier kolonier for analyse av rolle- og / eller alder-assosiert fysiologi HPGs 16. Vi har også kort beskrive hvordan man skal undersøke genekspresjon av mrjp2 og Hbg3 ved kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) for å evaluere HPG fysiologi.
I tillegg til analyse av arbeideren fysiologi i enkelt-kohort kolonier, er undersøkelse av det endokrine system viktig for å analysere de regulatoriske mekanismer rolle-assosierte arbeider fysiologi. Juvenilt hormon (JH), som er known som "status quo" hormon i insektlarver, akselererer skifte i rollen fra sykepleier til beite i arbeideren honningbier 11. Videre er ekdyson, som er kjent som molting hormon under metamorfose, kan være involvert i rollen skift som gener som koder for ekdyson signalmolekyler er uttrykt i soppen legemene, et høyere senter av arbeideren hjernen 17-19. Derfor har vi også beskrive detaljert protokoll som brukes i vår tidligere studie 16 for å behandle arbeidere med 20E, som er en aktiv form for ekdyson, og Methoprene, en JH-analog, for analyse av effekten av det endokrine systemet på HPG fysiologi (ekspresjon av mrjp2 og Hbg3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Single-kohorten Colonies
- Forbered tre Honeybee kolonier for å lage to single-kohorten kolonier og for å få et tilstrekkelig antall nylig oppståtte arbeidere.
- Sjekk at noen puppe i avkortet perifere cellene i Combs har brune øyne og en pigmentert hårstråene ved å åpne avkortet kammer med pinsett. Hvis disse puppe eksisterer i perifere kam celler, vil de fleste av puppe i hele kammer dukke opp i ca 1-3 dager.
- Deretter samle kammer inneholdende disse puppe etter at alle adherente voksne bier er blitt fjernet med en børste, og bland kammer fra de tre koloniene for å minimalisere variabiliteten mellom kolonier.
- Plasser de innsamlede kammer i en tom bikube boks og inkuberes ved 33 ° C under fuktige forhold (> 60% relativ fuktighet). Samle ca 6000 nylig oppståtte arbeidere over 3 dager (3000 arbeidere per koloni) fra de innsamlede Combs.
- Bestem mengden av workers basert på vekten av fem nylig oppståtte arbeidere tilfeldig samlet fra umanipulerte kolonier.
- Vei fem nylig oppståtte arbeidere tilfeldig samlet fra umanipulerte kolonier ved hjelp av veiing maskiner.
Merk: Vekten av fem nylig oppståtte arbeidere er vanligvis 500-600 mg. - Beregne mengden innsamlede arbeidere ved å dividere vekten av de oppsamlede arbeiderne av den gjennomsnittlige vekten av fem nylig oppståtte arbeidere.
- Vei fem nylig oppståtte arbeidere tilfeldig samlet fra umanipulerte kolonier ved hjelp av veiing maskiner.
- Påfør maling merkene til thoraces av ca 1800 arbeidstakere (900 arbeidere per koloni) ved hjelp av vannbaserte plakaten maling markører.
Merk: Kan vaskes markør som brukes til å påføre malingen er oppført i tabellen for materialteknologi. - Innføre en dronning og ca 3000 av 0-2 dager gamle arbeidere til en ny struktur boks som inneholder to kammer, en kam med honning og pollen som konservert mat og en annen tomt kam for egg-legging av dronningen. Samle kammen som inneholder honning og pollen from en annen umanipulerte kolonien etter alle heftende bier er fjernet.
Merk: Det anbefales bruk av atomstrukturen boks (liten størrelse hive boks). - Samle sykepleier bier og veslevoksen nitter med maling merkene 6 til 8 dager etter at du opprettet single-kohort kolonier.
- Å samle sykepleier bier, plukke opp arbeidere som setter hodet inn kam celler til å ta vare på stamfisk. Bruk pinsett til å samle sykepleier bier fra kammer som inneholder mange stamfisk og voksne arbeidstakere.
Merk: Hvis HPGs av innsamlede arbeidere er utviklet da dissekert som beskrevet i trinn 1.7, er disse arbeiderne definert som sykepleier bier. Holder thoraces av pinsett anbefales å plukke opp arbeidere fra kammer. - Å samle fôrhøstere, bruke en insektnett for å fange opp arbeidstakere som returnerer til sine elveblest med pollen belastninger på bakbeina.
Merk: Hvis HPGs av fanget arbeidere vises krympet når dissekert som beskrevet i trinn 1.7, blir de arbeiderne som definert nitter.
- Å samle sykepleier bier, plukke opp arbeidere som setter hodet inn kam celler til å ta vare på stamfisk. Bruk pinsett til å samle sykepleier bier fra kammer som inneholder mange stamfisk og voksne arbeidstakere.
- ClasSify HPG inn i tre grupper, "Developed", "middels" og "krympede" av disseksjon under et stereomikroskop.
- Anesthetize 10-15 bier i et insekt bur i et kjøleskap i 10-15 min før bier kan ikke fly eller gå. Deretter flytter bier på is og fullføre anestesi på is i 5 min.
Merk: Det tar omtrent totalt 15-20 min å oppnå anestesi. Hvis anestesi tid må forkortes, bør antall bier i et bur bli redusert til 1-3 bier per bur. - Skjær hodet fra kroppen med saks og pinsett. Fest hodet på tann voks plassert på en petriskål med pinner. Sett inn to pinner i grunnlaget for antennene å fikse hodet. Sug faste hoder i insekt saltvann (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2).
- Fjern fremre del av skjellaget av hodet hjelp av gode pinsett og en kirurgisk kniv under et binokulært mikroskop.
Merk: HPGs lett kan finnes i hodet etter fjerning av cuticle. Den HPG er en botryoid organ som eksisterer rundt hjernen i hodet. - Fjern tracheal vev som er en hvit membran vev under skjellaget. Deretter dissekere HPGs fra hodet ved sakte å trekke dem med pinsett.
- Gi HPGs med stor og rund acini som "Utviklet". Gi HPGs med små og forvrengt acini som "Shrunken '. Gi HPGs tilsvarer hverken 'Utviklet' eller 'krympede "som" Intermediate ".
Merk: Representative fotografier som viser disse tre klasser av HPG stater er vist i figur 2. - Subject 'Utviklet' og 'krympet' HPGs til RNA ekstraksjon som "sykepleier bee HPGs" og "nitter HPGs ', henholdsvis, og sammenlign genuttrykk i HPGs mellom sykepleier bier og fôrhøstere (seksjon 4).
- Anesthetize 10-15 bier i et insekt bur i et kjøleskap i 10-15 min før bier kan ikke fly eller gå. Deretter flytter bier på is og fullføre anestesi på is i 5 min.
2. Injeksjon av 20E
- Samle sykepleier bier fra typiske kolonier som descrIbed i prosedyren 1.6.1.
Merk: HPGs kan ikke undersøkes i disse biene som biene vil bli oppdratt. - Bedøve biene ved 4 ° C i et kjøleskap (ikke på is).
Merk: Det tar ca 30 min å oppnå anestesi. Hvis anestesi tiden forkortes, bør antall bier i buret bli redusert til 1-3 bier per bur. - Ved hjelp av pinsett, immobilisere bier på dental voks plassert på en petriskål.
- Injiser 1 mL av 20E oppløsning inn i den fremre del av hodet ved hjelp av en sprøytespissen er laget av et kalibrert mikropipette kapillar ved hjelp av et glass nål avtrekker.
- Oppløs 20E i etanol-insekt saltoppløsning (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2) blanding (1: 4) ved 2,5 ug / ul.
- Kople injeksjons spissen til en gummislange, og koble til en gul mikropipette spissen til den motsatte side av røret.
- Plasser 1 ul 20E løsning på parafilm ved anvendelse av en mikropipette, holder den gule mikropipette spissen i munnen, end trekker oppløsningen inn injeksjonen spissen.
- Sett injeksjon spiss i bunnen av antennene, og injisere oppløsningen ved å blåse gjennom det gule mikropipette spissen.
Merk: Protokollen er vist i dette trinnet er den representative injeksjon metode, men bruken av det automatiske injeksjon maskin er anbefalt for sikkerhet som er nødvendig 20.
- Bak de injiserte bier i insekt merdene på 33-36 ° C (den ideelle temperaturen er 35 ° C) under mørke og fuktige forhold (> 60% relativ fuktighet) for 1 eller 3 dager. Tilførsel honning-vann-blanding (1: 1) for å biene. Hvis det er nødvendig, telle overlevende bier etter injeksjon.
3. Bruk av Methoprene
- Samle kammer som inneholder puppe fra typiske kolonier etter alle heft voksne bier fjernes med en børste. Inkuber kammer ved 33-36 ° C (den ideelle temperaturen er 35 ° C) i fuktige forhold (> 60% relativ fuktighet) i inntil en dag.
- Etter 6 dager, samle malt arbeidere (6 dagers gamle) fra koloniene. Plukk opp malt arbeidere fra kammene ved å holde sine thoraces med pinsett.
- Bedøve biene ved 4 ° C i et kjøleskap (ikke på is) som i prosedyren 2,2. Ved hjelp av pinsett, immobilisere biene på tann voks som er plassert på en petriskål og anvende 1-5 ul av Methoprene oppløsning (50-250 ug / mL) løst i aceton til hodet ved hjelp av en mikropipette. Bruke en filtertupp som er motstandsdyktig mot aceton.
Merk: Aceton kan ha skadelige effekter på bier som fører til døden. Hvis den høye dødelighet av bier er observert, er reduksjonen av volumet av aceton til 1 pl ved laveste anbefalte. - Bakre biene i insekt merdene på 33-36 ° C (ideelt temperature er 35 ° C) i 7 dager under mørke og fuktige betingelser (> 60% relativ fuktighet). Tilførsel honning-vann-blanding (1: 1) for å biene. Hvis det er nødvendig, telle overlevende bier etter lokal applikasjon.
Merk: I denne artikkelen, er overlevende bier regnet 7 dager etter påføring (tabell 3).
4. RNA Utvinning og kvantitativ RT-PCR
- Anesthetize bier og dissekere HPGs som beskrevet i trinn 1.7.1 til 1.7.4.
- Samle dissekert HPGs i en mikrosentrifugerør på tørris og oppbevares ved -80 ° C inntil bruk.
- Tilsett 400 ul av reagens for proteindenaturering.
Merk: Denne reagensen er kommersielt tilgjengelig (se tabell for material). - Homogenisere HPG vev ved hjelp av en håndholdt elektrisk mikser med en homogenisering stampe som passer inni en mikro tube. Homogenisere ved en rotasjonshastighet på ca 300 opm i 1 min på is for å bryte og vev celler lyse.
tabell for material). - Legg 80 mL kloroform og bland godt. Inkuber i 5 min ved RT.
- Sentrifuger mikrosentrifugerør på 14 170 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Overfør den vandige fase til et nytt rør. Legge til et like stort volum av isopropanol og 1 ul glykogen (5 mg / ml). Inkuber ved -20 ° C i minst 20 min.
- Sentrifuger mikrosentrifugerør ved 14 170 xg i 10 min ved 4 ° C og fjern supernatanten.
- Tilsett 400 ul 75% etanol til pelleten og bland godt, sentrifuger mikrosentrifugerør ved 14 170 xg i 15 min ved 4 ° C, og fjern supernatanten. Gjenta disse prosedyrene igjen.
- Luft-tørke pellet i 5-10 min og deretter oppløse den i 10 ul RNase-fritt vann.
Merk: Fullstendig tørking av pellets kan føre uoppløseliggjøring av RNA pelleten i vann. Således, pelleten som er litt våt er passende foroppløsning. - Mål-RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer slik som Nanodrop eller lignende.
- Behandle 500 ng av total RNA med 2,0 U av DNase I ved inkubering ved 37 ° C i 30 minutter for å nedbryte eventuelt forurensende genomisk DNA.
- Omvendt-transkribere 200 ng av DNase-behandlet RNA og utføre real time PCR ved bruk av kommersielt tilgjengelige sett (se listen i tabellform Materialer og reagenser) og gen-spesifikke primere (mrjp2, 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', og 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3, 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'og 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Utføre PCR som følger: [95 ° C x 30 sekunder + (95 ° C x 5 sek + 60 ° C x 15 sekunder + 72 ° C x 20 sekunder) x 45-55 sykluser].
- Normalisere mengden av karakterutskrift med at av forlengelse faktor 1α-F2 (EF1α˗F2) eller ribosomalt protein 49 (rp49) 9,16,21,22. Disse genene er pålitelig kontroll gEnes for å analysere genuttrykk i HPGs bruker QRT-PCR.
- Utfør tosidige t-test for å oppdage de betydelige forskjellene mellom to eksperimentgruppene (sykepleier bier vs bråmoden fôrhøstere, 20E-behandlet bier vs. kontroll bier, og Methoprene behandlet bier vs. kontroll bier) ved hjelp av statistisk programvare.
Merk: Hvis F-testen går ut i homogeniteten av varians, kan t-test anvendes. Hvis ikke, kan Welch t-test anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversikt av protokollen for fremstilling av enkelt-kohort kolonier er vist i figur 1A. Tids løpet av forsøkene fra forbereder single-kohorten kolonier prøvetakingen er vist i figur 1B. Arbeidere som tilfredsstilte atferdskriteriene for sykepleie atferd eller beite atferd ble samlet inn fra enkelt-kohort kolonier, og HPG utvikling ble anslått i disse arbeiderne Tabell 1 viser klassifisering av HPG utvikling inn i tre grupper.; 'Utviklet', 'Intermediate "og" krympede "i henhold til størrelsen. Representative fotografier som viser disse tre klasser av HPGs er angitt i figur 2. Resultatene tyder på at både sykepleier bier og veslevoksen fôrhøstere, i henhold til de kriterier som er beskrevet i protokollen, ble også observert i single-kohort kolonier. Uttrykk for mrjp2 og Hbg3 i HPGs var enriched i sykepleier bier og veslevoksen fôrhøstere, henholdsvis, noe som indikerer at HPG funksjon er knyttet til arbeidstakerens rolle (figur 3) 16.
Fremgangsmåten for å injisere 20E til arbeide hoder er vist i figur 4. Overlevende bier ble talt opp 1, 5 og 7 dager etter injeksjonen for å undersøke overlevelse hastighet på bier injisert med saltvann eller insekt løsningsmiddel for 20E 20E oppløsningen før forsøket. Ved 7 dager etter injeksjon, omtrent 60-80% av injiserte bier var i live, og overlevelse av bier injisert med oppløsningsmiddel for 20E løsning var sammenlignbar med insekt saltløsning (tabell 2). Effekten av injeksjons 20E redusert ekspresjon av både mrjp2 og Hgb3 i HPGs (figur 5) 16. I tillegg til 20E, er effekten av topisk applikasjon på Methoprene mrjp2 og Hbg3 (Tabell 3). På den annen side er bare ca 20% til 30% av bier injisert med aceton / bie saltvann (1: 4) løsning overlevde 7 dager etter injeksjon da overlevende bier ble telt 1, 3, 5 og 7 dager etter injeksjon (tabell 4) . Dermed ble søknaden metode for Methoprene behandling vedtatt. Anvendelse av Methoprene inhiberte ekspresjon av mrjp2 og forbedret ekspresjon av Hbg3 (figur 6) 16.
Figur 1. Oversikt over single-kohorten koloni eksperimentet. (A) Scheme for å forberede enkelt kohort kolonier. (B) Time-retters eksperiment fra preparing single-kohort koloniene til å samle sykepleier bier og veslevoksen nitter. Horisontal pilen indikerer løpet av en arbeidstaker levetid på single-kohort kolonier. Tall med vertikale linjene indikerer arbeidstaker alder. Ikke bare veslevoksen nitter, men også overaged sykepleier bier (28-32 dager gamle) er rapportert å bli funnet i single-kohort kolonier 15. Dermed kan sammenligning av fysiologi mellom overaged sykepleier bier og fôrhøstere utføres i single-kohort kolonier, selv om dette ikke ble gjort i denne studien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fotografier som viser de tre klasser av HPG stater. Utviklet (A), Intermediate (B), og Shrunken (C Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Role-forbundet uttrykk for mrjp2 og Hbg3 i HPGs av arbeidere fra single-kohort kolonier. Grafen viser en sammenligning av mRNA nivåer av mrjp2 (A) og Hbg3 (B) i de HPGs mellom sykepleier bier (N) og veslevoksen nitter (PF) fra to single-kohorten colonies. MRNA nivået av hvert gen ble normalisert med den for ribosomalt protein 49 (rp49). Den relative mRNA nivået av hvert gen i sykepleier bee HPGs ble definert som 1. mRNA nivået av mrjp2 i noen bråmoden nitter kan ikke kvantifiseres på grunn av signal intensiteter lavere enn deteksjonsgrensen. Derfor er forskjellig antall prøver mellom gener. Relative mRNA-nivåer er angitt med standard feil. Stjernene viser betydelige forskjeller mellom sykepleier bier og veslevoksen nitter (*, p <0,05; t-test). Dette tallet er gjengitt fra Ueno et al., (2015) 16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Scheme av protokollen for 20E injecsjon. Prosedyrer 2.3 og 2.4 i protokollen delen er illustrert i denne figuren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Effekt av 20E injeksjon på mrjp2 og Hbg3 uttrykk i HPGs 16. Grafen viser en sammenligning av mRNA-nivåer av mrjp2 (A) og Hbg3 (B) i de HPGs mellom 20E-behandlede bier (20E +) og kontroll bier (20E-). Tall under grafen viser dagen etter 20E behandling. MRNA nivået av hvert gen ble normalisert med den av elongeringsfaktor 1α-F2 (EF1α-F2). Relativ mRNA nivå avhvert gen i kontroll bie HPGs ble definert som 1. Relative mRNA-nivåer, er angitt med en standardfeil. En stjerne indikerer en signifikant forskjell mellom 20E-behandlede bier og kontroll bier (*, p <0,05; t-test). Dette tallet er gjengitt fra Ueno et al., (2015) 16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Effekt av Methoprene program på mrjp2 og Hbg3 uttrykk i HPGs 16. Grafen viser sammenligningen av mRNA nivåer av mrjp2 (A) og Hbg3 (B) i de HPGs mellom Methoprene behandlet bier og kontroll bier. DemRNA nivået for hvert gen ble normalisert med den for EF1α-F2. Relative mRNA-nivå av hvert gen i kontroll bie HPGs ble definert som 1. Relative mRNA-nivåer er angitt med standard feil. Stjernene viser signifikante forskjeller mellom Methoprene behandlet bier og kontroll bier (*, p <0,05; t-test). Dette tallet er gjengitt fra Ueno et al., (2015) 16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Colony No. | observerte atferd | Antall personer i hver HPG klasse | |||
| Utviklet | Mellom | krympet | Total | ||
| 1 | Sykepleie | 8 | 1 | 1 | 10 |
| beite | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | Sykepleie | 4 | 2 | 0 | 6 |
| beite | 0 | 0 | 5 | 5 | |
Tabell 1: Klassifisering av HPGs av arbeidstakere som sykepleier eller beite atferd ble observert i single-kohort kolonier. HPG størrelse i arbeidere fra to single-kohort kolonier (koloni nos 1 og 2.) Ble gruppert i tre klasser; 'Utviklet', 'Intermediate "og" Shrunken' etter størrelse.
| Dager etter injeksjon | Ingen injeksjon | Insect saltvann | Væske til 20E soln | |
| trial 1 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| Dag 1 | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| Day5 | 14/15 | 13/15 | 11/15 | |
| day7 | 14/15 | 12/15 | 9/15 | |
| trial 2 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| Dag 1 | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| Day5 | 15/15 | 11/15 | 12/15 | |
| day7 | 14/15 | 10/15 | 12/15 |
Tabell 2: Overlevelse av bier injisert med væske til 20E løsning. Femten arbeidere ble utarbeidet i hver forsøksgruppe.
| Dager etter påføring | aceton | Methoprene | |
| trial 1 | dag 0 | 7/7 | 8/8 |
| dag 7 | 7/7 | 6/8 | |
| trial 2 | dag 0 | 7/7 | 8/8 |
| dag 7 | 7/7 | 8/8 |
Tabell 3: Overlevelse av bier behandlet med Methoprene Sju til åtte arbeidere ble utarbeidet i hver forsøksgruppe..
| Dager etter injeksjon | Ingen injeksjon | Aceton / Bee saltvann (1: 4) |
| dag 0 | 15/15 | 15/15 |
| Dag 1 | 15/15 | 6/15 |
| dag 3 | 15/15 | 5/15 |
| dag 5 | 15/15 | 4/15 |
| dag 7 | 15/15 | 4/15 |
Tabell 4: Overlevelse av bier injisert med aceton / bie saltvann (1: 4). Løsning Femten arbeidere ble utarbeidet for hver forsøksgruppe. Aceton / bie saltvann (1: 4) ble injisert inn i abdomen arbeideren. Sammensetningen av bie saltvann er 130 mM NaCl, 6 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 160 mM sukrose, 25 mM glukose og 10 mM HEPES (pH 7,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utarbeidelse av single-kohort kolonier
Her beskrev vi protokollen som brukes i vår forrige undersøkelse 16 for å forberede enkelt kohortstudier kolonier for analyse av HPG fysiologi knyttet til skift i rollen som arbeidende biene. Sykepleier bier og veslevoksen nitter som tilfredsstilte kriteriene som er beskrevet i prosedyrer 1,6-1,7 og figur 2 ble observert i enkelt-kohort kolonier (tabell 1). Fotografiene i figur 2 vil være nyttig i klassifiseringen av HPG heter som en referanse. Kriterier basert på både arbeidstaker adferd og HPG utvikling er gyldige for å definere sykepleier bier eller nitter i typiske kolonier. Rolle skifte fra sykehjem til beite gradvis går i disse koloniene: mengden av tid brukt i sykepleie atferd gradvis avtar mens det i foraging atferd øker gradvis i løpet av rollen skift 2. Det ville således være vanskelig å samle arbeidere som utelukkendeutføre sykepleie eller beite av bare atferdskriterier. Resultatet som uttrykk for mrjp2 og Hbg3 i HPGs er knyttet til rollen som arbeidstakere indikerer klart at protokollen er beskrevet her kan bli vedtatt å undersøke HPG fysiologi sykepleier bier og veslevoksen nitter fra enkelt-kohort kolonier (figur 3). Kriterier basert på både arbeidstaker atferd og HPG utvikling kan også være aktuelt å definere sykepleier bier og veslevoksen nitter fra single-kohort kolonier. I tillegg til de HPGs, andre eksokrine kjertler i hodet gjennomgår fysiologiske endringer i assosiasjon med rollen skift. For eksempel, hvis funksjon kjeve kjertel endres fra syntesen av fettsyrer for kyllinger mat til syntese av alarm feromon 2-heptanon 2. Protokollen er beskrevet her, kan således være innrettet til å undersøke rollen assosierte fysiologi fra andre enn de HPGs eksokrine kjertler.
Vellykket samling av nUrse bier og veslevoksen nitter fra enkelt-kohort kolonier avhengig av innsamling av et tilstrekkelig antall nylig oppståtte arbeidere når koloniene er forberedt. Hvis et lavt antall nylig oppståtte arbeidere er samlet inn, ville det være vanskelig å samle nok sykepleier bier og veslevoksen nitter. Dessuten er tilstanden på dronninger et annet viktig punkt for vellykket prøvetaking. Queens med en stor mage er bra for å legge egg fordi disse dronningene vanligvis har utviklet eggstokkene. Dermed er arbeid av arbeidere antas å være effektivt delt selv i single-kohort kolonier fordi stamfisk er stadig levert av dronningen. Hvis ingen stamfisk er levert, vil det være vanskelig å samle sykepleier bier fra single-kohort kolonier. Til slutt, for å markere arbeidernes hjelp plakat maling er nødvendig for å sikre at arbeidstakere blir samlet inn fra enkelt-kohort kolonier, fordi nitter tidvis tilbake til feil kolonien. Å samle bråmoden nitter effektivt, bør maling merkene værebrukes på så mange arbeidere som mulig (mer enn 900 nylig oppståtte arbeidere per enkelt-kohorten koloni). Anvendelsen av vann-basert blekk for merking kan være anbefalt, fordi et oljebasert blekk, som vanligvis inneholder flyktige organiske forbindelser, kan forstyrre kjemisk kommunikasjon mellom bier. De vannbaserte blekkmerker ikke falmer veldig mye i løpet av eksperimentet.
hormonbehandling
Vi beskrev også protokoll for injisering 20E i hodene på arbeiderne for å undersøke effekten av -ekdyson på HPG fysiologi (mrjp2 og Hbg3 uttrykk). Overlevelsesraten av bier injisert med insekt saltvann eller oppløsningsmidlet for 20E oppløsningen var tilstrekkelig for den etterfølgende analyse, hvilket indikerer at den protokoll som er beskrevet her for injeksjon ved hjelp av en sprøytespissen og væske 20E løsning kan tas i bruk for 20E injeksjons forsøket (tabell 2 ). Videre sammenligning av genekspresjon i HPGsmellom 20E-behandlede bier og kontroll bier indikerte at det injiserte 20E endret ekspresjon av mrjp2 og Hbg3, som begge er relatert til HPG funksjon (figur 5). Dette resultatet tyder på at den protokoll som er beskrevet her vil være nyttig for undersøkelse av virkningene av ekdyson på HPG fysiologi, og kan tas i bruk for å undersøke andre eksokrine kjertler i hodet, slik som underkjevens kjertler. Videre kan injeksjonsmetoden tas i bruk for injisering av andre kjemikalier. For eksempel vil den protokoll som er beskrevet her være hensiktsmessig for injisering av dobbelt-trådet RNA-løsninger i hodene for genet knockdown eksperimenter.
I tillegg til 20E, beskrev vi en protokoll for påføring Methoprene, som er en analog JH. Methoprene er vanligvis brukt til magen. På den annen side ble Methoprene påført på hodet av arbeidere, her. Nesten alle bier med lokal applikasjon av Methoprene eller aceton levde 7 dager etter behandling, Hvilket antyder at anvendelse av 5 ul Methoprene eller acetonoppløsning til lederne har liten effekt på arbeideren overlevelsesrate (tabell 3). Videre sammenligning av mrjp2 og Hbg3 ekspresjon i HPGs mellom methoprene- og acetonbehandlede bier indikerer at Methoprene søknad inhiberer mrjp2 ekspresjon og forbedrer Hbg3 uttrykket (figur 6). Disse resultater antyder at den protokoll som er beskrevet her er egnet for å analysere virkningene av Methoprene på fysiologi av eksokrine kjertler som for eksempel HPGs i hodet.
Vellykket hormonbehandling avhenger overlevelse av behandlede bier. Lav temperatur eksponering i kjøleskap kan være hensiktsmessig for bedøvelse bier. Anestesi på is er ikke anbefalt fordi bier blir våt på isen, som fører til en lav overlevelse. Videre kan injeksjon metode være et annet viktig punkt for å holde bier i live. Det er viktig å make injeksjons spissen lang og tynn, og for å forme den til en skarp spiss ved hjelp av kutteren for å minimere skade på biene ved injeksjon. Men kanskje injeksjon metoden ikke være hensiktsmessig for å undersøke effekten av Methoprene på HPG fysiologi, fordi aceton løsemiddel for Methoprene virker negativt bee overlevelse (tabell 4). I tillegg kan injeksjon metode som er beskrevet her ikke være hensiktsmessig for atferdsanalyse i kolonier som injiserte bier ville bli ekskludert fra sine kolonier når de blir gjeninnført etter injeksjon. Arbeidere med små skader kan utelukkes fra koloniene. Andre metoder, slik som påføring eller oral administrasjon av hormon kan være hensiktsmessig for atferdsanalyse.
Singelen-kohorten koloni har blitt brukt til å undersøke regulering av arbeidsdeling av arbeideren honningbier 10,11. I tillegg har behandlingen med juvenil hormon blitt brukt til undersøkelse av atferd og hjerne funksjonellepå knyttet til arbeidsdelingen 11. Imidlertid detaljerte protokoller for både fremstilling av enkelt-kohort kolonier og behandlingen med JH har ikke tidligere vært tilgjengelig i slike detaljer. Nylig er betydningen av -ekdyson i arbeidsdelingen blir stadig mer anerkjent, og reguleringen av arbeidsdeling både JH og -ekdyson er foreslått 23. De detaljerte protokoller for vellykket utarbeidelse av enkelt-kohort kolonier og hormonbehandling som JH og -ekdyson beskrevet i denne artikkelen kan bidra til å fremme i studiet av arbeideren fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. The insect societies. , Harvard university press. (1971).
- Winston, M. L. The biology of the honey bee. , Harvard university press. (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
