Summary
Her beskriver vi vores detaljerede protokol for forberedelse af single-kohorte honningbikolonier - et nyttigt redskab til at analysere den rolle-associerede arbejdstager fysiologi. Vi beskriver også detaljerede protokoller til behandling af arbejdstagere med juvenile hormon og ecdyson at vurdere inddragelsen af disse hormoner i reguleringen af arbejdstager adfærd og / eller fysiologi.
Introduction
Den europæiske honningbi, Apis mellifera, er en eusocial insekt med en velorganiseret samfund 1. Worker honningbier (arbejdskraft kaste) er engageret i forskellige opgaver for at sikre koloni aktivitet, og disse opgaver ændres i henhold til arbejdstageren honningbien alder efter eclosion, der omtales som aldersrelateret arbejdsdeling 2-4. Unge arbejdstagere (<13 dage gamle) tager sig af yngel i bikuben ved at udskille gelé royal (sygeplejerske bier), mens ældre arbejdstagere (> 15 dage gamle) indsamle nektar og pollen uden for bikuben (finsnittere) 2-4. Fysiologi arbejderne ændringer i forbindelse med denne rolle skift. For eksempel funktionen af de hypopharyngeal kirtler (HPGs), parret eksokrine kirtler placeret i hovedet, ændringer i forbindelse med rollen skift fra sygepleje til fouragering 2,5. Sygeplejerske bi HPGs hovedsageligt syntetisere store Gelée royale proteiner, som er vigtige bestanddele af bi mælk. På den anden side, finsnittere HPGs hovedsageligtsyntetisere kulhydrat-metaboliserende enzymer, såsom α-glucosidase III, til at behandle nektar til honning ved at omdanne saccharose til glucose og fructose. Vores tidligere undersøgelser viste, at ekspressionen af mrjp2, som koder for et større gelée royale protein og Hbg3, som koder α-glucosidase III, ændringer i den rolle skift 6-9.
For at bestemme om de fysiologiske ændringer i worker væv, herunder HPGs, er forbundet med den rolle skift eller med en alder af arbejderne, ville det være nyttigt at manipulere befolkningen ifølge en honningbi koloni, såsom at fremstille enkelt-kohorten kolonier, hvor arbejdstagerne på næsten samme alder udføre forskellige opgaver 10,11. Robinson et al. (1989) beskrevet en metode til indførelse af et enkelt-kohorte koloni 10. Single-kohorte kolonier omfatter indledningsvis en dronning og 0-2 dage gamle arbejdere. Flere dage efter oprettelse kolonierne, arbejderne i almost på samme alder antager forskellige opgaver. Nogle arbejdere udfører sygepleje opgaver som i typiske kolonier, mens andre arbejdstagere udfører fouragering opgaver tidligere end normalt og derfor kaldes fremmelige finsnittere. Genekspression sammenligninger mellem sygeplejerske bier og fremmelige finsnittere vil give nyttige oplysninger om den rolle-associerede fysiologi arbejdstager væv 12-16. Her beskriver vi en detaljeret protokol til at forberede enkelt kohorte kolonier til analyse af rolle- og / eller alder-associeret fysiologi HPGs 16. Vi har også kort beskrive, hvordan at undersøge genekspression af mrjp2 og Hbg3 ved kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) for at evaluere HPG fysiologi.
Ud over analysen af arbejdstager fysiologi i single-kohorte kolonier, undersøgelse af det endokrine system er vigtigt for at analysere de regulatoriske mekanismer rolle-associeret arbejdstager fysiologi. Juvenil hormon (JH), som er known som "status quo" hormon i insektlarver, accelererer skiftet i rollen fra sygepleje til fouragere i arbejdsbier 11. Endvidere ecdyson, der er kendt som den molting hormon under metamorfose, kan være involveret i rollen skift som gener, der koder ecdyson signalmolekyler udtrykkes i svampen organer, et højere center af arbejderen hjerne 17-19. Derfor beskriver vi også den detaljerede protokol, der anvendes i vores tidligere undersøgelse 16 til behandling af arbejdere med 20E, som er en aktiv form for ecdyson og methopren, en JH-analog, til analyse af virkningen af det endokrine system på HPG fysiologi (ekspression af mrjp2 og Hbg3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Single-kohorte Kolonier
- Forbered tre honningbikolonier at oprette to single-kohorte kolonier og at opnå et tilstrækkeligt antal nyligt dukket arbejdstagere.
- Kontroller, at nogle pupper i udjævningen perifere celler i kamme har brune øjne og en pigmenteret neglebånd ved at åbne udjævnede kamme med en pincet. Hvis der disse pupper i perifere kam celler, vil de fleste af pupper i hele kamme dukke op i cirka 1-3 dage.
- Efterfølgende indsamle kamme indeholder disse pupper efter alt vedhængende voksne bier er blevet fjernet med en børste, og bland kamme fra de tre kolonier for at minimere variabilitet blandt kolonier.
- Placer de indsamlede kamme i et tomt bistade kasse og inkuberes ved 33 ° C under fugtige betingelser (> 60% relativ fugtighed). Saml ca 6000 nyligt opstået arbejdstagere over 3 dage (3.000 arbejdstagere pr koloni) fra de indsamlede kamme.
- Bestem mængden af workers baseret på vægten af fem nyligt opstået arbejdere indsamlet tilfældigt fra umanipulerede kolonier.
- Afvej fem nyligt opstået arbejdstagere tilfældigt indsamlet fra umanipulerede kolonier ved hjælp af vægte.
Bemærk: Vægten af fem nyligt opstået arbejdstagere er generelt 500-600 mg. - Anslå størrelsen af indsamlede arbejdstagere ved at dividere vægten af de indsamlede arbejdstagere den gennemsnitlige vægt af fem nyligt dukket arbejdstagere.
- Afvej fem nyligt opstået arbejdstagere tilfældigt indsamlet fra umanipulerede kolonier ved hjælp af vægte.
- Påfør maling mærker til thoraces på ca. 1.800 medarbejdere (900 arbejdstagere pr koloni) ved hjælp af vandbaserede plakat maling markører.
Bemærk: Vaskbart markør, der bruges til at anvende maling er angivet i tabellen i Materials. - Indførelse af en dronning og ca. 3.000 af de 0-2 daggamle arbejdere til en ny hive boks, der indeholder to kamme, en kam, der indeholder honning og pollen som konserves og anden tom kam til æglægning af dronningen. Saml kam indeholder honning og pollen frabout anden umanipulerede koloni efter alt vedhængende bier fjernes.
Bemærk: Det anbefales at bruge af nuklear hive boks (lille størrelse hive boks). - Saml sygeplejerske bier og fremmelige finsnittere med maling mærker 6 til 8 dage efter oprettelse single-kohorte kolonier.
- At indsamle sygeplejerske bier, afhente arbejdere, der satte deres hoveder ind i kam celler til at tage sig af yngel. Brug en pincet til at indsamle sygeplejerske bier fra kamme, der indeholder mange yngel og voksne arbejdere.
Bemærk: Hvis der udviklet HPGs af indsamlede arbejdstagere, når dissekeret som beskrevet i trin 1.7, er disse arbejdstagere defineres som sygeplejerske bier. Hold de thoraces ved pincet anbefales at afhente arbejdstagerne mod kamme. - At indsamle finsnittere, bruge et insektnet til at indfange arbejdstagere, der vender tilbage til deres bistader med pollen belastninger på bagbenene.
Bemærk: Hvis HPGs af tilfangetagne arbejdere synes indskrumpet når dissekeret som beskrevet i trin 1.7, er disse arbejdstagere defineres som finsnittere.
- At indsamle sygeplejerske bier, afhente arbejdere, der satte deres hoveder ind i kam celler til at tage sig af yngel. Brug en pincet til at indsamle sygeplejerske bier fra kamme, der indeholder mange yngel og voksne arbejdere.
- ClasSify den HPG i tre grupper, "Udviklet ',' Intermediate 'og' Indskrumpet 'ved dissektion under et stereomikroskop.
- Bedøver 10-15 bier i et insekt bur i et køleskab i 10-15 min, indtil bierne kan ikke flyve eller gå. Derefter flytte bier på is og fuldføre anæstesi på is i 5 min.
Bemærk: Det tager omkring alt 15-20 min for at opnå anæstesi. Hvis anæstesi tid skal afkortes, bør antallet af bier i et bur reduceres til 1-3 bier pr bur. - Skær hovedet fra kroppen med en saks og pincet. Fastgør hoved på dental voks placeret på en petriskål med stifter. Sæt to nåle ind grundlaget for antennerne til at fastsætte hovedet. Soak faste hoveder i insekt saltvand (130 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM CaCl2).
- Fjern den forreste del af kutikula af hovedet under anvendelse af fine pincetter og en kirurgisk kniv under et binokulært mikroskop.
Bemærk: De HPGs let kan findes i hovedet efter fjernelse af cuticle. Den HPG er en botryoid organ, der eksisterer omkring hjernen i hovedet. - Fjern trakeale væv, der er en hvid membranøs væv under kutikula. Derefter dissekere de HPGs fra hovedet ved langsomt at trække dem med en pincet.
- Klassificere HPGs med stor og rund acini som "Udviklet«. Klassificere HPGs med små og forvrænget acini som "Indskrumpet«. Klassificere HPGs svarende til hverken "Udviklet« eller »Indskrumpet« som »Intermediate«.
Bemærk: Repræsentative fotografier, der viser disse tre klasser af HPg stater er angivet i figur 2. - Emne 'Udviklet "og" indskrumpet' HPGs til RNA ekstraktion som 'sygeplejerske bi HPGs «og» finsnittere HPGs «, henholdsvis og sammenlign genekspression i HPGs mellem sygeplejerske bier og finsnittere (afsnit 4).
- Bedøver 10-15 bier i et insekt bur i et køleskab i 10-15 min, indtil bierne kan ikke flyve eller gå. Derefter flytte bier på is og fuldføre anæstesi på is i 5 min.
2. Injektion af 20E
- Saml sygeplejerske bier fra typiske kolonier som descrIBED i proceduren 1.6.1.
Bemærk: HPGs kan ikke undersøges i disse bier som bierne bliver opdrættet. - Bedøver bierne ved 4 ° C i køleskab (ikke på is).
Bemærk: Det tager omkring 30 minutter for at opnå anæstesi. Hvis anæstesi forkortes, bør antallet af bier i buret reduceres til 1-3 bier pr bur. - Ved hjælp af en pincet, immobilisere bierne på dental voks placeret på en petriskål.
- Injicer 1 pi 20E opløsning ind i det forreste aspekt af hovedet under anvendelse af en injektion spids fremstillet af et kalibreret kapillar mikropipette under anvendelse af en glas nål aftrækker.
- Opløs 20E i ethanol-insekt saltvand (130 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM CaCl2) blanding (1: 4) ved 2,5 pg / pl.
- Slut injektion spids til en gummislange, og forbinde et gult mikropipettespids til den modsatte side af røret.
- Placer 1 pi 20E løsning på parafilm under anvendelse af en mikropipette, hold den gule mikropipettespidsen i munden, end trække opløsningen i injektion spids.
- Sæt indsprøjtning spidsen ind i bunden af antenner, og injicere opløsningen ved at blæse gennem den gule mikropipettespidsen.
Bemærk: Den viste i dette trin protokollen er den repræsentativ injektion metode, men det anbefales at bruge den automatiske injektion maskine for sikkerhed som nødvendigt 20.
- Rear de injicerede bier i insekt bure ved 33-36 ° C (den ideelle temperatur er 35 ° C) under mørke og fugtige forhold (> 60% relativ luftfugtighed) for 1 eller 3 dage. Supply honning-vand-blanding (1: 1) til bierne. Hvis det er nødvendigt, tælle overlevende bier efter injektion.
3. Anvendelse af Methopren
- Saml kamme, der indeholder pupper fra typiske kolonier efter alt vedhængende voksne bier fjernes med en børste. Inkubér kamme ved 33-36 ° C (den ideelle temperatur er 35 ° C) under fugtige forhold (> 60% relativ fugtighed) i op til 1 dag.
- Efter 6 dage, indsamle malede arbejdere (6 dage gamle) fra kolonierne. Pick up malede arbejdstagere fra de kamme ved at holde deres thoraces med en pincet.
- Bedøver bierne ved 4 ° C i køleskab (ikke på is) som i proceduren 2.2. Ved hjælp af en pincet, immobilisere bierne på dental voks placeret på en petriskål og anvende 1-5 pi methopren løsning (50-250 pg / pl) opløst i acetone til deres hoveder ved hjælp af en mikropipette. Bruge et filter tip der er resistent over acetone.
Bemærk: Acetone kan have skadelige virkninger på bier, der fører til døden. Hvis der observeres den høje dødelighed blandt bierne, anbefales reduktion af volumen acetone til 1 pi på et minimum. - Rear bierne i insekt bure ved 33-36 ° C (den ideelle temperatur er 35 ° C) i 7 dage i mørke og under fugtige forhold (> 60% relativ fugtighed). Supply honning-vand-blanding (1: 1) til bierne. Hvis det er nødvendigt, tælle overlevende bier efter lokal applikation.
Bemærk: I denne artikel, der overlevende bier tælles 7 dage efter påføring (tabel 3).
4. RNA-ekstraktion og kvantitativ RT-PCR
- Bedøver bier og dissekere HPGs som beskrevet i trin 1.7.1 til 1.7.4.
- Indsamle de dissekerede HPGs i et mikrocentrifugerør på tøris og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse.
- Der tilsættes 400 pi af reagens til proteindenaturering.
Bemærk: Dette reagens er kommercielt tilgængelige (se Table of Materials). - Homogenisere HPg væv under anvendelse af en håndholdt elektrisk mixer med en homogenisering pistil, der passer inde i et mikrocentrifugerør. Homogenisere ved en rotationshastighed på ca. 300 rpm i 1 min på is for at bryde og lysere vævsceller.
Table of Materials). - Tilføj 80 pi chloroform og bland godt. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifuger mikrocentrifugerør ved 14.170 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Overfør den vandige fase til et nyt rør. Tilsættes samme mængde af isopropanol og 1 pi glycogen (5 mg / ml). Inkuber ved -20 ° C i mindst 20 min.
- Centrifuger mikrocentrifugerør ved 14.170 xg i 10 min ved 4 ° C og supernatanten fjernes.
- Der tilsættes 400 pi 75% ethanol til pelleten og bland godt, centrifugere mikrocentrifugerør ved 14.170 xg i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanten fjernes. Gentag disse procedurer en gang mere.
- Lufttørres pelleten i 5-10 minutter og derefter opløse den i 10 pi RNase-frit vand.
Bemærk: fuldstændig tørring af pelleten kan forårsage uopløseliggørelse af RNA pellet i vand. , Pelleten som er lidt våd er således passende foropløsende. - Mål RNA-koncentrationen ved anvendelse af et spektrofotometer, såsom NanoDrop eller lignende.
- Behandl 500 ng af total RNA med 2,0 U DNase I ved inkubering ved 37 ° C i 30 minutter for at nedbryde enhver kontaminerende genomisk DNA.
- Revers-transskribere 200 ng DNase I-behandlet RNA og udføre real time PCR under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits (se listen i tabellen i Materialer og reagenser) og gen-specifikke primere (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'og 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'og 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Udfør PCR som følger: [95 ° C x 30 sek + (95 ° C x 5 sek + 60 ° C x 15 sek + 72 ° C x 20 sek) x 45-55 cyklusser].
- Normalisere mængden af udskrift med den for forlængelse faktor 1α-F2 (EF1α˗F2) eller ribosomale protein 49 (rp49) 9,16,21,22. Disse gener er pålidelige kontrol gener til analyse af genekspression i de HPGs vha QRT-PCR.
- Udfør to-halet t-test til påvisning af de betydelige forskelle mellem to eksperiment grupper (sygeplejerske bier vs tidligt udviklede finsnittere, 20E-behandlede bier vs. kontrol bier og methopren behandlede bier vs. kontrol bier) ved hjælp af statistisk software.
Bemærk: Hvis F-test forudsætter varianshomogenitet, kan t-test anvendes. Hvis ikke, kan Welch t-test anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversigt over protokollen for at forberede enkelt kohorte kolonier er illustreret i figur 1A. Tidsforløbet for eksperimenter fra fremstilling single-kohorte kolonier prøve samling er vist i figur 1B. Arbejdstagere, der opfyldte de adfærdsmæssige kriterier for sygepleje adfærd eller fourageringsadfærd blev indsamlet fra single-kohorte kolonier, og HPG udvikling blev anslået i disse arbejdere Tabel 1 viser klassifikationen af HPG udvikling i tre grupper.; "Udviklet ',' Intermediate 'og' Indskrumpet" efter størrelsen. Repræsentative fotografier, der viser disse tre klasser af HPGs er angivet i figur 2. Resultaterne indikerer, at både sygeplejerske bier og tidligt udviklede finsnittere, ifølge kriterierne beskrevet i protokollen, blev også observeret i de enkelt-kohorte kolonier. Angivelse af mrjp2 og Hbg3 i HPGs var enriched i sygeplejerske bier og fremmelige finsnittere henholdsvis, hvilket indikerer, at HPG funktion er forbundet med arbejdstagerens rolle (figur 3) 16.
Proceduren til indsprøjtning 20E i worker hoveder er illustreret i figur 4. Overlevende bier blev talt 1, 5 og 7 dage efter injektion for at undersøge overlevelsen hastighed på bier injiceret med insekt saltvand eller solvens til 20E opløsning før 20E eksperimentet. 7 dage efter injektion, ca. 60-80% af injicerede bier var i live, og overlevelsesraten for bier injiceret med solvens til 20E opløsning var sammenlignelig med insekt saltvand (tabel 2). Virkningen af 20E injektion reduceret ekspression af både mrjp2 og Hgb3 i HPGs (figur 5) 16. Foruden 20E, virkningen af topisk methopren applikation på mrjp2 og Hbg3 (tabel 3). På den anden side, kun cirka 20% til 30% af bier injiceret med acetone / bi saltvand (1: 4) opløsning overlevede 7 dage efter injektion, når overlevende bier blev talt 1, 3, 5 og 7 dage efter injektion (tabel 4) . Således blev vedtaget ansøgningen metode til methopren behandling. Anvendelse af methopren inhiberede ekspressionen af mrjp2 og øget ekspression af Hbg3 (figur 6) 16.
Figur 1. Oversigt over single-kohorte koloni eksperiment. (A) Ordning for udarbejdelse single-kohorte kolonier. (B) Time-retters eksperiment fra preparing single-kohorte kolonier til at indsamle sygeplejerske bier og fremmelige finsnittere. Vandret pil angiver forløbet af en arbejdstagers levetid i single-kohorte kolonier. Tal med lodrette linjer angiver arbejdstager alder. Ikke kun fremmelige finsnittere men også overaged sygeplejerske bier (28-32 dage gamle) rapporteres findes i single-kohorte kolonier 15. Således kan sammenligning af fysiologi mellem overaged sygeplejerske bier og grøntmaskiner udføres i single-kohorte kolonier, selv om dette ikke blev gjort i denne undersøgelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fotografier, der viser de tre klasser af HPG stater. Udviklet (A), Intermediate (B), og Indskrumpet (C Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Rolle-associeret udtryk for mrjp2 og Hbg3 i HPGs af arbejdstagere fra single-kohorte kolonier. Grafen viser en sammenligning af mRNA-niveauer af mrjp2 (A) og Hbg3 (B) i HPGs mellem sygeplejerske bier (N) og tidligt udviklede finsnittere (PF) fra to single-kohorte colonies. MRNA-niveauet af hvert gen blev normaliseret med den for ribosomprotein 49 (rp49). Den relative mRNA niveau af hvert gen i sygeplejerske bi HPGs blev defineret som 1. mRNA niveau af mrjp2 i nogle fremmelige finsnittere kunne ikke kvantificeres på grund af signalintensiteter lavere end detektionsgrænsen. Derfor er antallet af prøver varierer mellem gener. Relative mRNA-niveauer er angivet med standardfejl. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem sygeplejerske bier og tidligt udviklede finsnittere (*, p <0,05; t-test). Dette tal er gengivet fra Ueno et al., (2015) 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ordningen af protokollen for 20E injection. Procedurer 2.3 og 2.4 i protokollen sektion er illustreret i denne figur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Effekt af 20E indsprøjtning på mrjp2 og Hbg3 udtryk i HPGs 16. Grafen viser en sammenligning af mRNA-niveauer af mrjp2 (A) og Hbg3 (B) i HPGs mellem 20E-behandlede bier (20E +) og kontrol bier (20E-). Tal under grafen angiver dagen efter 20E behandling. MRNA-niveauet af hvert gen blev normaliseret med den af forlængelsesfaktor 1α-F2 (EF1α-F2). Relativ mRNA niveau afhvert gen i kontrolgrupperne bi HPGs blev defineret som 1. Relative mRNA-niveauer er angivet med en standardafvigelse. En stjerne angiver en signifikant forskel mellem 20E-behandlede bier og kontrol bier (*, p <0,05; t-test). Dette tal er gengivet fra Ueno et al., (2015) 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Effekt af methopren ansøgning på mrjp2 og Hbg3 udtryk i HPGs 16. Grafen viser sammenligningen af mRNA-niveauer af mrjp2 (A) og Hbg3 (B) i HPGs mellem methopren-behandlede bier og kontrol bier. DetmRNA-niveauet af hvert gen blev normaliseret med den for EF1α-F2. Relativ mRNA-niveauet af hvert gen i kontrolgrupperne bi HPGs blev defineret som 1. Relative mRNA-niveauer er angivet med standardfejl. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem methopren-behandlede bier og kontrol bier (*, p <0,05; t-test). Dette tal er gengivet fra Ueno et al., (2015) 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Colony No. | Observeret adfærd | Antal personer i hver HPG klasse | |||
| Udviklede sig | Intermediate | indskrumpet | Total | ||
| 1 | Ammende | 8 | 1 | 1 | 10 |
| fouragering | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | Ammende | 4 | 2 | 0 | 6 |
| fouragering | 0 | 0 | 5 | 5 | |
Tabel 1: Klassificering af HPGs af arbejdstagere, hvis sygepleje eller fourageringsadfærd blev observeret i single-kohorte kolonier. HPG størrelse i arbejdstagere fra to single-kohorte kolonier (koloni 1 og 2.) Blev inddelt i tre klasser; "Udviklet ',' Intermediate" og "Indskrumpet« efter størrelse.
| Dage efter injektion | ingen injektion | Insekt saltvand | Solvens til 20E soln | |
| Forsøg 1 | Dag 0 | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| day1 | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| Day5 | 14/15 | 13/15 | 11/15 | |
| Dag 7 | 14/15 | 12/15 | 9/15 | |
| forsøg 2 | Dag 0 | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| day1 | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| Day5 | 15/15 | 11/15 | 12/15 | |
| Dag 7 | 14/15 | 10/15 | 12/15 |
Tabel 2: Survival rate af bier injiceret med solvens til 20E løsning. Femten arbejdere blev udarbejdet i hver forsøgsgruppe.
| Dage efter påføring | Acetone | methopren | |
| Forsøg 1 | dag 0 | 7/7 | 8/8 |
| Dag 7 | 7/7 | 6/8 | |
| forsøg 2 | dag 0 | 7/7 | 8/8 |
| Dag 7 | 7/7 | 8/8 |
Tabel 3: Survival rate af bier behandlet med methopren Syv til otte arbejdere blev udarbejdet i hver forsøgsgruppe..
| Dage efter injektion | ingen injektion | Acetone / Bee saltvand (1: 4) |
| dag 0 | 15/15 | 15/15 |
| dag 1 | 15/15 | 6/15 |
| Dag 3 | 15/15 | 5/15 |
| Dag 5 | 15/15 | 4/15 |
| Dag 7 | 15/15 | 4/15 |
Tabel 4: Survival rate af bier injiceret med acetone / bi saltvand (1: 4). Løsning Femten arbejdere blev udarbejdet for hver forsøgsgruppe. Acetone / bi saltvand (1: 4) opløsning blev injiceret i arbejderen abdomen. Sammensætningen af bi saltvand er 130 mM NaCl, 6 mM KCI, 4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 160 mM saccharose, 25 mM glucose og 10 mM HEPES (pH 7,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udarbejdelse af single-kohorte kolonier
Her beskrev vi den anvendte protokol i vores tidligere undersøgelse 16 til fremstilling single-kohorte kolonier til analyse af HPG fysiologi forbundet med skiftet i rollen som bier. Sygeplejerske bier og fremmelige finsnittere der opfyldte kriterierne i procedurerne 1,6-1,7 og figur 2 blev observeret i de enkelt-kohorte kolonier (tabel 1). Fotografierne i figur 2 ville være nyttig i klassificering af HPG hedder som reference. Kriterier baseret på både arbejdstager adfærd og HPG udvikling er gyldige til at definere sygeplejerske bier eller finsnittere i typiske kolonier. Rolle skift fra sygepleje til fouragere gradvist fortsætter i disse kolonier: mængden af tid brugt i sygepleje adfærd gradvist falder, mens der i fourageringsadfærd gradvist i løbet rollen shift 2. Det ville således være vanskeligt at indsamle arbejdere, der udelukkendeudføre sygepleje eller fouragering af kun adfærdsmæssige kriterier. Det resultat, at ekspressionen af mrjp2 og Hbg3 i HPGs er forbundet med rollen som arbejdernes viser klart, at protokollen beskrevet her, kan vedtages at undersøge HPG fysiologi i sygeplejerske bier og fremmelige finsnittere fra single-kohorte kolonier (figur 3). Kriterier baseret på både arbejdstager adfærd og HPG udvikling kunne også være gældende i definitionen sygeplejerske bier og fremmelige finsnittere fra single-kohorte kolonier. Foruden de HPGs, andre eksokrine kirtler i hovedet undergå fysiologiske ændringer i forbindelse med den rolle skift. For eksempel funktionen af de mandibulære kirtel ændringer fra syntesen af fedtsyrer til yngel fødevarer til syntesen af alarm feromon 2-heptanon 2. Den her beskrevne protokol kan således tilpasses til at undersøge, hvilken rolle-associerede fysiologi andre end de HPGs eksokrine kirtler.
Vellykket samling af nUrse bier og fremmelige finsnittere fra single-kohorte kolonier afhænger om indsamling af et tilstrækkeligt antal nyligt dukket arbejdstagere, når kolonierne er forberedt. Hvis et lavt antal nyligt opstået arbejdstagere indsamles, vil det være vanskeligt at indsamle nok sygeplejerske bier og fremmelige finsnittere. Desuden tilstand dronninger er et andet centralt punkt for en vellykket prøveindsamling. Queens med en stor mave er gode til at lægge æg, fordi disse dronninger regel har udviklet æggestokke. Således er arbejdskraft af arbejdstagere menes at være effektivt deles selv i single-kohorte kolonier fordi kuld konstant leveret af dronningen. Hvis der ikke yngel leveres, ville det være vanskeligt at indsamle sygeplejerske bier fra single-kohorte kolonier. Endelig markerer arbejderne bruger plakat maling er påkrævet for at sikre, at arbejdstagere er indsamlet fra single-kohorte kolonier, fordi finsnittere lejlighedsvis tilbage til den forkerte koloni. At indsamle tidligt udviklede finsnittere effektivt, bør maling mærker væreanvendt på så mange arbejdstagere som muligt (mere end 900 nyligt opstået arbejdstagere pr single-kohorte koloni). Anvendelsen af vandbaserede blæk til mærkning kan anbefales, fordi en oliebaseret trykfarve, som normalt indeholder flygtige organiske forbindelser, kan afbryde kemisk kommunikation mellem bierne. De vandbaserede blækmærker ikke falmer meget i løbet af forsøget.
hormonbehandling
Vi beskrev også protokollen for indsprøjtning 20E ind i hovedet på arbejderne at undersøge effekten af ecdyson på HPG fysiologi (mrjp2 og Hbg3 udtryk). Overlevelsesraten for bier injiceret med insekt saltvand eller solvens til 20E løsning var tilstrækkeligt for den efterfølgende analyse, hvilket indikerer, at protokollen beskrevet her til injektion ved hjælp af en indsprøjtning tip og solvens til 20E løsning kan vedtages for 20E injektion eksperimentet (tabel 2 ). Endvidere sammenligning af genekspression i HPGsmellem 20E-behandlede bier og kontrol bier indikerede, at den injicerede 20E ændret ekspression af mrjp2 og Hbg3, som begge er relateret til HPG funktion (figur 5). Dette resultat tyder på, at den her beskrevne protokol ville være nyttige for behandlingen af virkningerne af ecdyson på HPG fysiologi, og kan vedtages for at undersøge andre eksokrine kirtler i hovedet, såsom mandibulære kirtler. Desuden kan vedtages injektion metode til indsprøjtning andre kemikalier. For eksempel ville den her beskrevne protokol være passende til injektion af dobbeltstrengede RNA-løsninger ind i hovedet for gen Knockdown eksperimenter.
Foruden 20E, beskrev vi en protokol til påføring methopren, som er en JH-analog. Methopren påføres sædvanligvis til abdomen. På den anden side, blev methopren anvendt til lederen af arbejdstagere, her. Næsten alle bier med topisk anvendelse af methopren eller acetone overlevede 7 dage efter behandling, Hvilket antyder, at anvendelsen af 5 pi methopren eller acetoneopløsning til lederne har ringe effekt på arbejdstager overlevelsesrate (tabel 3). Endvidere sammenligning af mrjp2 og Hbg3 ekspression i de HPGs mellem methoprene- og acetone-behandlede bier indikerer, at methopren ansøgning inhiberer mrjp2 ekspression og forbedrer Hbg3 ekspression (figur 6). Disse resultater antyder, at den her beskrevne protokol er egnet til at analysere virkningen af methopren på fysiologi af eksokrine kirtler såsom HPGs i hovedet.
Vellykket hormonbehandling afhænger overlevelsesraten for behandlede bier. Lav temperatur eksponering i køleskab kan være passende for bedøvelse bier. Anæstesi på is ikke anbefales, da bierne får våde på isen, hvilket fører til en lav overlevelsesrate. Desuden kunne den injektionsteknik være et andet centralt punkt for at holde bier i live. Det er vigtigt at make injektionen spids lange og tynde, og forme det til en skarp spids ved hjælp af skæreren at minimere skade på bierne ved injektion. Dog kan den injektionsteknik ikke være passende for behandlingen af virkningerne af methopren på HPG fysiologi, fordi acetonen solvens til methopren negativt påvirker biers overlevelse (tabel 4). Derudover kan den her beskrevne injektion metode ikke være hensigtsmæssigt for adfærdsanalyse i kolonier som injicerede bier ville blive udelukket fra deres kolonier, når de genindføres efter injektion. Arbejdstagere med mindre skaden kunne blive udelukket fra kolonierne. Andre fremgangsmåder, såsom anvendelsen eller oral administration af hormon kan være passende for adfærdsanalyse.
Den fælles-kohorte koloni er blevet brugt til at undersøge reguleringen af arbejdsdeling af arbejdsbier 10,11. Derudover har behandlingen med juvenil hormon været brugt til undersøgelse af adfærd og hjernens functipå relateret til arbejdsdelingen 11. Men detaljerede protokoller for både udarbejdelsen af de single-kohorte kolonier og behandlingen med JH er ikke tidligere så detaljeret. For nylig, vigtigheden af ecdyson i arbejdsdelingen er ved at blive mere og mere anerkendt, og regulering af arbejdsdelingen både JH og ecdyson foreslås 23. De detaljerede protokoller for en vellykket forberedelse af single-kohorte kolonier og hormonbehandling såsom JH og ecdyson beskrevet i denne artikel kan bidrage til fremskridt i studiet af arbejdstager fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. The insect societies. , Harvard university press. (1971).
- Winston, M. L. The biology of the honey bee. , Harvard university press. (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
