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Neuroscience

एकल पलटन कालोनियों और कार्यकर्ता मधुमक्खियों के हार्मोन उपचार की तैयारी भूमिका और / या अंत: स्रावी प्रणाली के साथ फिजियोलॉजी एसोसिएटेड का विश्लेषण करने के लिए

doi: 10.3791/54240 Published: September 6, 2016

Summary

भूमिका से जुड़े कार्यकर्ता शरीर क्रिया विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण - यहाँ हम एकल पलटन मधुप कालोनियों की तैयारी के लिए हमारे विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन। हम यह भी कार्यकर्ता व्यवहार और / या शरीर क्रिया विज्ञान के नियमन में इन हार्मोन की भागीदारी का मूल्यांकन करने के लिए किशोर हार्मोन और ecdysone साथ श्रमिकों के इलाज के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Introduction

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यूरोपीय मधुप, एपीआई mellifera, एक अत्यंत संगठित समाज 1 के साथ एक eusocial कीट है। कार्यकर्ता मधुमक्खियों (श्रम जाति) कॉलोनी गतिविधि को बनाए रखने के लिए विभिन्न कार्यों में लगे हुए हैं, और इन कार्यों eclosion के बाद कार्यकर्ता मधुप की उम्र, जो श्रम 2-4 साल की उम्र से संबंधित विभाग के रूप में जाना जाता है के अनुसार बदल जाते हैं। युवा कार्यकर्ताओं (<13 दिन पुरानी), शाही जेली (नर्स मधुमक्खियों) स्रावित द्वारा छत्ते में चिंता का ख्याल रखना है, जबकि पुराने श्रमिकों (> 15 दिन पुराने) अमृत और पराग छत्ता (foragers) 2-4 के बाहर इकट्ठा। श्रमिकों के शरीर क्रिया विज्ञान इस भूमिका के बदलाव के साथ सहयोग में बदल जाता है। उदाहरण के लिए, hypopharyngeal ग्रंथियों (HPGs) के समारोह, 2,5 foraging को नर्सिंग से भूमिका पारी के सहयोग से बहि सिर में स्थित ग्रंथियों, परिवर्तन बनती। नर्स मधुमक्खी HPGs मुख्य रूप से प्रमुख शाही जेली प्रोटीन है, जो मधुमक्खी दूध के प्रमुख घटक हैं synthesize। दूसरी ओर, भोजन के लिये घूमनेवाला HPGs मुख्य रूप सेऐसे α-ग्लुकोसिडेस III के रूप में कार्बोहाइड्रेट metabolizing एंजाइमों, synthesize, ग्लूकोज और फ्रुक्टोज में सुक्रोज परिवर्तित करके शहद में अमृत की प्रक्रिया। हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि mrjp2 की अभिव्यक्ति है, जो एक प्रमुख शाही जेली प्रोटीन, और Hbg3 encodes, जो भूमिका पारी के दौरान 6-9 α-ग्लुकोसिडेस तृतीय, परिवर्तन encodes।

निर्धारित करें कि क्या कार्यकर्ता ऊतकों में शारीरिक परिवर्तन, HPGs सहित भूमिका बदलाव के साथ या कार्यकर्ताओं की उम्र के साथ जुड़ा हुआ है, यह इस तरह के रूप में एक मधुप कॉलोनी की आबादी की संरचना में हेरफेर करने, एकल पलटन तैयार करने के लिए उपयोगी होगा कालोनियों में जो लगभग एक ही उम्र के श्रमिकों विभिन्न कार्यों 10,11 प्रदर्शन करते हैं। रॉबिन्सन एट अल। (1989) एक एकल पलटन कॉलोनी में 10 की स्थापना के लिए एक विधि का वर्णन किया। एकल पलटन कालोनियों शुरू में एक रानी और 0-2 दिन पुराने श्रमिकों शामिल। कई दिनों कालोनियों की स्थापना के बाद, एएलएम के कार्यकर्ताओंएक ही उम्र Ost विभिन्न कार्यों मान। कुछ श्रमिकों, ठेठ कालोनियों में के रूप में नर्सिंग कार्य करते हैं जबकि अन्य कार्यकर्ताओं foraging कार्यों सामान्य से पहले प्रदर्शन करते हैं और इस प्रकार असामयिक foragers कहा जाता है। नर्स मधुमक्खियों और असामयिक foragers के बीच जीन अभिव्यक्ति तुलना कार्यकर्ता ऊतकों 12-16 की भूमिका से जुड़े शरीर विज्ञान के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करेगा। यहाँ, हम HPGs 16 वर्ष की role- और / या उम्र जुड़े शरीर क्रिया विज्ञान के विश्लेषण के लिए एकल पलटन कालोनियों की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम भी संक्षेप में कैसे HPG शरीर क्रिया विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी पीसीआर) द्वारा mrjp2 और Hbg3 के जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने का वर्णन है।

एकल पलटन कालोनियों में कार्यकर्ता शरीर क्रिया विज्ञान के विश्लेषण के अलावा, अंत: स्रावी प्रणाली की परीक्षा भूमिका से जुड़े कार्यकर्ता शरीर क्रिया विज्ञान के नियामक तंत्र का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। किशोर हार्मोन (झा) है, जो kno हैकीट लार्वा में 'यथास्थिति' हार्मोन के रूप में WN, कार्यकर्ता मधुमक्खियों 11 में foraging को नर्सिंग से भूमिका में बदलाव accelerates। इसके अलावा, ecdysone, जो कायापलट दौरान molting हार्मोन के रूप में जाना जाता है, एन्कोडिंग ecdysone संकेतन अणुओं, कार्यकर्ता मस्तिष्क 17-19 के एक उच्च केंद्र मशरूम शरीर में व्यक्त कर रहे हैं जीनों के रूप में भूमिका पारी में शामिल किया जा सकता है। इसलिए, हम भी HPG शरीर क्रिया विज्ञान पर अंत: स्रावी प्रणाली के प्रभाव का विश्लेषण (की अभिव्यक्ति के लिए विस्तृत अध्ययन हमारे पिछले 16 में इस्तेमाल किया 20E के साथ श्रमिकों के इलाज के लिए प्रोटोकॉल, जो ecdysone के एक सक्रिय रूप है, और methoprene, एक झा एनालॉग, का वर्णन mrjp2 और Hbg3)।

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Protocol

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1. एकल पलटन कालोनियों की तैयारी

  1. तीन मधुप कालोनियों दो एकल पलटन कालोनियों को बनाने के लिए और नव उभरा श्रमिकों के लिए पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने के लिए तैयार करें।
    1. जाँच करें कि कंघी में छाया हुआ परिधीय कोशिकाओं में से कुछ pupae भूरी आँखें और चिमटी का उपयोग कर छाया हुआ कंघी खोलने के द्वारा एक pigmented छल्ली है। इन pupae परिधीय कंघी कोशिकाओं में मौजूद हैं, तो पूरे कंघी में pupae से अधिकांश लगभग 1-3 दिनों में उभरेगा।
    2. बाद में, के बाद सभी पक्षपाती वयस्क मधुमक्खियों एक ब्रश के साथ हटा दिया गया है इन pupae युक्त कंघी जमा है, और कालोनियों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए तीन कालोनियों से कंघी मिश्रण।
  2. एक खाली छत्ता बॉक्स में एकत्र कंघी की जगह और आर्द्र परिस्थितियों के तहत 33 डिग्री सेल्सियस (> 60% सापेक्ष आर्द्रता) पर सेते हैं। एकत्र कंघी से 3 दिन (कॉलोनी प्रति 3,000 कर्मचारी) पर लगभग 6000 नव उभरा कार्यकर्ताओं लीजिए।
  3. worke की मात्रा का निर्धारणपांच नव उभरा श्रमिकों के वजन के आधार पर रुपये बेतरतीब ढंग से unmanipulated कालोनियों से एकत्र की।
    1. पांच नव उभरा कार्यकर्ताओं बेतरतीब ढंग से वजन मशीनों का उपयोग कर unmanipulated कालोनियों से एकत्र वजन।
      नोट: पांच नव उभरा कार्यकर्ताओं का वजन आम तौर पर 500-600 मिलीग्राम है।
    2. पांच नव उभरा श्रमिकों की औसत वजन से एकत्र कार्यकर्ताओं का वजन विभाजित करके एकत्र कार्यकर्ताओं की मात्रा का अनुमान है।
  4. लगभग 1,800 श्रमिकों (कॉलोनी प्रति 900 श्रमिकों) पानी आधारित पोस्टर पेंट मार्कर का उपयोग कर के वक्ष स्थल के लिए रंग के निशान को लागू करें।
    नोट: धो सकते हैं मार्कर जो रंग लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है।
  5. एक नया छत्ता बॉक्स है कि दो कंघी, एक कंघी युक्त शहद और संरक्षित खाद्य पदार्थ के रूप में पराग और अंडे बिछाने रानी के लिए एक और खाली कंघी शामिल करने के लिए एक रानी और लगभग 3,000 0-2 दिन पुराने श्रमिकों के परिचय। शहद युक्त और पराग मंगलवार कंघी लीजिएOm सब पक्षपाती मधुमक्खियों के बाद एक और unmanipulated कॉलोनी हटा रहे हैं।
    नोट: परमाणु छत्ता बॉक्स (छोटे आकार का छत्ता बॉक्स) के उपयोग की सिफारिश की है।
  6. एकल पलटन कालोनियों बनाने के बाद 6 से 8 दिनों के रंग के निशान के साथ नर्स मधुमक्खियों और असामयिक foragers लीजिए।
    1. नर्स मधुमक्खियों को इकट्ठा करने के लिए, कार्यकर्ताओं से कहा कि कंघी कोशिकाओं में उनके सिर डाल दिया बच्चे की देखभाल करने के लिए उठा। कंघी है कि कई बच्चे और वयस्क श्रमिकों होते से नर्स मधुमक्खियों इकट्ठा करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें।
      नोट: एकत्र कार्यकर्ताओं की HPGs विकसित कर रहे हैं जब विच्छेदित कदम 1.7 में वर्णित के रूप में, इन श्रमिकों नर्स मधुमक्खियों के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। होल्डिंग चिमटी से वक्ष स्थल कंघी से श्रमिकों को लेने के लिए सिफारिश की है।
    2. foragers इकट्ठा करने के लिए, कार्यकर्ताओं से कहा कि अपने पिछले पैरों पर पराग भार के साथ अपने पित्ती पर लौटने पर कब्जा करने के लिए एक कीट नेट का उपयोग करें।
      नोट: कब्जा कर लिया श्रमिकों के HPGs सिकुड़ा हुआ दिखाई देते हैं जब विच्छेदित कदम 1.7 में वर्णित है, उन श्रमिकों foragers के रूप में परिभाषित कर रहे हैं।
  7. clasतीन समूहों, 'विकसित', 'इंटरमीडिएट' में HPG सिफी, और एक stereomicroscope के तहत विच्छेदन द्वारा 'सिकुड़ा हुआ'।
    1. 10-15 मिनट के लिए एक रेफ्रिजरेटर में एक कीट पिंजरे में 10-15 मधुमक्खियों anesthetize तक मधुमक्खियों उड़ान भरने या नहीं चल सकता है। फिर, बर्फ पर मधुमक्खियों के लिए कदम और 5 मिनट के लिए बर्फ पर संज्ञाहरण को पूरा करें।
      नोट: यह संज्ञाहरण प्राप्त करने के लिए कुल 15-20 मिनट लगते हैं। संज्ञाहरण समय छोटा करने की जरूरत है, तो एक पिंजरे में मधुमक्खियों की संख्या पिंजरे प्रति 1-3 मधुमक्खियों को कम किया जाना चाहिए।
    2. कैंची और चिमटी के साथ शरीर से सिर काटना। पिन के साथ एक पेट्री डिश पर रखा दंत मोम पर सिर को ठीक करें। सिर ठीक करने के लिए एंटीना के ठिकानों में दो पिनों डालें। कीट खारा (130 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी CaCl 2) में तय सिर लेना।
    3. एक दूरबीन खुर्दबीन के नीचे सिर ठीक चिमटी का उपयोग कर और एक सर्जिकल चाकू की छल्ली के पूर्वकाल पहलू निकालें।
      नोट: HPGs आसानी ग को हटाने के बाद सिर में पाया जा सकता हैuticle। HPG एक botryoid अंग है कि सिर में मस्तिष्क के चारों ओर मौजूद है।
    4. सांस की नली ऊतक जो छल्ली के तहत एक सफेद झिल्लीदार ऊतक है निकालें। फिर, धीरे धीरे उन्हें चिमटी के साथ खींच कर सिर से HPGs काटना।
    5. के रूप में 'विकसित' बड़े और परिपत्र acini साथ HPGs वर्गीकृत। 'सिकुड़ा हुआ' के रूप में छोटे और विकृत acini साथ HPGs वर्गीकृत। वर्गीकृत HPGs 'इंटरमीडिएट' के रूप में न तो 'विकसित' और न ही 'सिकुड़ा हुआ' के लिए इसी।
      नोट: प्रतिनिधि तस्वीरों चलता है कि HPG राज्यों के इन तीन वर्गों चित्रा 2 में संकेत कर रहे हैं।
    6. विषय 'विकसित' और रूप में शाही सेना निकासी के लिए 'सिकुड़ा हुआ' HPGs 'नर्स मधुमक्खी HPGs' और 'भोजन के लिये घूमनेवाला HPGs', क्रमशः, और नर्स मधुमक्खियों और foragers (धारा 4) के बीच HPGs में जीन की अभिव्यक्ति की तुलना करें।

2. 20E इंजेक्शन

  1. Descr के रूप में विशिष्ट कालोनियों से नर्स मधुमक्खियों लीजिएप्रक्रिया 1.6.1 में ibed।
    नोट: HPGs इन मधुमक्खियों से जांच नहीं की जा सकती रूप में मधुमक्खियों पाला जाना होगा।
  2. एक रेफ्रिजरेटर (बर्फ पर नहीं) में 4 डिग्री सेल्सियस पर मधुमक्खियों anesthetize।
    नोट: यह संज्ञाहरण को प्राप्त करने के बारे में 30 मिनट लगते हैं। संज्ञाहरण समय छोटा है, तो पिंजरे में मधुमक्खियों की संख्या पिंजरे प्रति 1-3 मधुमक्खियों को कम किया जाना चाहिए।
  3. चिमटी का प्रयोग, एक पेट्री डिश पर रखा दंत मोम पर मधुमक्खियों स्थिर करना।
  4. एक इंजेक्शन एक calibrated केशिका एक गिलास सुई खींचने का उपयोग micropipette से बना टिप का उपयोग कर सिर के पूर्वकाल पहलू में 20E समाधान के 1 μl इंजेक्षन।
    1. इथेनॉल कीट खारा में 20E भंग (130 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी CaCl 2) मिश्रण (1: 4) 2.5 माइक्रोग्राम पर / μl।
    2. एक रबर ट्यूब के लिए इंजेक्शन नोक कनेक्ट करें, और ट्यूब के विपरीत पक्ष को एक पीले रंग की micropipette टिप कनेक्ट।
    3. एक micropipette का उपयोग parafilm पर 20E समाधान के 1 μl प्लेस, मुंह में पीले micropipette टिप पकड़ है, एकघ इंजेक्शन टिप में समाधान निकालना।
    4. एंटीना के आधार में इंजेक्शन नोक डालें, और पीले micropipette टिप के माध्यम से उड़ाने से समाधान इंजेक्षन।
      नोट: इस कदम प्रोटोकॉल में दिखाया प्रतिनिधि इंजेक्शन तरीका है, लेकिन स्वचालित इंजेक्शन मशीन के उपयोग के लिए आवश्यक सुरक्षा के रूप में 20 के लिए सिफारिश की है।
  5. रियर 33-36 डिग्री सेल्सियस पर कीट पिंजरों में इंजेक्शन मधुमक्खियों 1 या 3 दिन के लिए अंधेरे और आर्द्र परिस्थितियों (> 60% सापेक्ष आर्द्रता) के तहत (आदर्श तापमान 35 डिग्री सेल्सियस है)। आपूर्ति शहद पानी के मिश्रण (1: 1) मधुमक्खियों के लिए। यदि आवश्यक हो, इंजेक्शन के बाद मधुमक्खियों जीवित रहने का भरोसा।

3. Methoprene के आवेदन

  1. कंघी कि ठेठ कालोनियों से pupae शामिल होने के बाद सभी पक्षपाती वयस्क मधुमक्खियों एक ब्रश के साथ हटा रहे हैं ले लीजिए। 33-36 डिग्री सेल्सियस पर कंघी सेते हैं 1 दिन तक के लिए आर्द्र परिस्थितियों में (> 60% सापेक्ष आर्द्रता) (आदर्श तापमान 35 डिग्री सेल्सियस है)।
  2. 6 दिन बाद, कालोनियों से चित्रित श्रमिकों (6 दिन पुराने) इकट्ठा। चिमटी के साथ उनके वक्ष स्थल धारण करके कंघी से चित्रित कार्यकर्ताओं उठाओ।
  3. एक रेफ्रिजरेटर (बर्फ पर नहीं) प्रक्रिया 2.2 में के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर मधुमक्खियों anesthetize। चिमटी का प्रयोग, एक पेट्री डिश पर रखा दंत मोम पर मधुमक्खियों को स्थिर और methoprene समाधान (50-250 माइक्रोग्राम / μl) एक micropipette का उपयोग करने के लिए उनके सिर एसीटोन में भंग 1-5 μl लागू होते हैं। एक फिल्टर टिप है कि एसीटोन के लिए प्रतिरोधी है का प्रयोग करें।
    नोट: एसीटोन मौत के लिए अग्रणी मधुमक्खियों पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है। मधुमक्खियों के उच्च मृत्यु दर मनाया जाता है, कम से कम 1 μl के लिए एसीटोन की मात्रा में कमी की सिफारिश की है।
  4. रियर 33-36 डिग्री सेल्सियस (आदर्श टी में कीट पिंजरों में मधुमक्खियोंemperature अंधेरे और आर्द्र परिस्थितियों के तहत 7 दिनों के लिए 35 डिग्री सेल्सियस) (> 60% सापेक्ष आर्द्रता) है। आपूर्ति शहद पानी के मिश्रण (1: 1) मधुमक्खियों के लिए। यदि आवश्यक हो, सामयिक आवेदन के बाद मधुमक्खियों जीवित रहने का भरोसा।
    नोट: इस लेख में, जीवित मधुमक्खियों 7 दिन आवेदन (3 टेबल) के बाद गिने जाते हैं।

4. शाही सेना निकालना और मात्रात्मक आरटी पीसीआर

  1. मधुमक्खियों anesthetize और HPGs काटना 1.7.4 के लिए कदम 1.7.1 में वर्णित है।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक सूखी बर्फ और दुकान पर एक microcentrifuge ट्यूब में विच्छेदित HPGs लीजिए।
  3. प्रोटीन विकृतीकरण के लिए अभिकर्मक के 400 μl जोड़ें।
    नोट: यह अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (सामग्री की तालिका देखें)।
  4. एक हाथ एक homogenization मूसल कि एक microcentrifuge ट्यूब के अंदर फिट बैठता है के साथ बिजली के मिक्सर आयोजित का उपयोग कर HPG ऊतकों homogenize। बर्फ तोड़ने के लिए और lyse ऊतक कोशिकाओं पर 1 मिनट के लिए लगभग 300 आरपीएम की घूर्णन गति पर homogenize।
    (सामग्री की तालिका देखें)।
  5. 80 μl क्लोरोफॉर्म जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 14,170 XG पर microcentrifuge ट्यूबों अपकेंद्रित्र। एक नया ट्यूब जलीय चरण स्थानांतरण। isopropanol और 1 μl ग्लाइकोजन (5 मिलीग्राम / एमएल) की एक समान मात्रा में जोड़ें। कम से कम 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,170 XG पर microcentrifuge ट्यूबों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  8. गोली के लिए 75% इथेनॉल के 400 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 14,170 XG पर microcentrifuge ट्यूबों अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। एक बार फिर इन प्रक्रियाओं को दोहराएँ।
  9. 5-10 मिनट के लिए गोली हवा शुष्क और फिर 10 μl RNase मुक्त पानी में भंग।
    नोट: गोली का पूरा सुखाने पानी में शाही सेना गोली की insolubilization का कारण बन सकता है। इस प्रकार, गोली जो थोड़ा गीला है के लिए उपयुक्त हैभंग।
  10. आरएनए एकाग्रता उपाय एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर NanoDrop या इसी तरह के रूप में इस तरह के प्रयोग से।
  11. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating किसी भी दूषित जीनोमिक डीएनए नीचा करने से DNase मैं के 2.0 यू के साथ कुल शाही सेना के 500 एनजी समझो।
  12. रिवर्स टाइप DNase मैं इलाज शाही सेना के 200 एनजी और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन और जीन विशिष्ट प्राइमरों (mrjp2 (सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका में सूची देखें); 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA -3 ', और 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC -3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC -3 'और 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG -3')। इस प्रकार के रूप पीसीआर प्रदर्शन: [95 डिग्री सेल्सियस x 30 सेकंड + (95 डिग्री सेल्सियस एक्स 5 सेकंड 60 डिग्री सेल्सियस x 15 सेकंड + 72 डिग्री सेल्सियस x 20 सेकंड) x 45-55 चक्र]।
  13. बढ़ाव कारक 1α-F2 (EF1α˗F2) या ribosomal प्रोटीन 49 (rp49) 9,16,21,22 के साथ कि प्रतिलेख की राशि मानक के अनुसार। इन जीनों विश्वसनीय नियंत्रण जी रहे हैंQRT- पीसीआर का उपयोग कर HPGs में जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए Enes।
  14. दो प्रयोग समूह (नर्स मधुमक्खियों बनाम असामयिक foragers, बनाम नियंत्रण मधुमक्खियों 20E इलाज मधुमक्खियों, और बनाम नियंत्रण मधुमक्खियों methoprene इलाज मधुमक्खियों) सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए दो पूंछ टी परीक्षण प्रदर्शन करना।
    नोट: एफ परीक्षण विचरण की एकरूपता हो जाती है, तो छात्र की टी परीक्षण का इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि नहीं, तो वेल्च की टी-परीक्षण का इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

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एकल पलटन कालोनियों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 ए में सचित्र है। एकल पलटन कालोनियों की तैयारी कर संग्रह करने के लिए नमूना से प्रयोगों के समय पाठ्यक्रम चित्रा 1 बी में दिखाया गया है। कार्यकर्ताओं से कहा कि नर्सिंग व्यवहार या foraging व्यवहार के लिए व्यवहार मानदंड संतुष्ट एकल पलटन कालोनियों से एकत्र किए गए थे, और HPG विकास के इन कार्यकर्ताओं में अनुमान लगाया गया था 1 टेबल को तीन समूहों में HPG विकास के वर्गीकरण से पता चलता है। 'विकसित', आकार के अनुसार 'इंटरमीडिएट', और 'सिकुड़ा हुआ'। प्रतिनिधि HPGs के इन तीन वर्गों दिखा तस्वीरों चित्रा 2 में संकेत कर रहे हैं। परिणामों से संकेत मिलता है कि दोनों नर्स मधुमक्खियों और असामयिक foragers, प्रोटोकॉल में वर्णित मापदंड के अनुसार, यह भी एकल पलटन कालोनियों में मनाया गया। Mrjp2 और HPGs में Hbg3 की अभिव्यक्ति en थानर्स मधुमक्खियों और असामयिक foragers में क्रमश: riched, यह दर्शाता है कि HPG समारोह कार्यकर्ता की भूमिका (चित्रा 3) 16 के साथ जुड़ा हुआ है।

कार्यकर्ता सिर में 20E इंजेक्शन लगाने के लिए प्रक्रिया चित्रा 4 में सचित्र है। जीवित मधुमक्खियों 1 गिना रहे थे, 5 और 7 दिनों के अस्तित्व की जांच करने के लिए इंजेक्शन के बाद कीट खारा या 20E प्रयोग से पहले 20E समाधान के लिए विलायक के साथ इंजेक्शन मधुमक्खियों की दर। इंजेक्शन के बाद 7 दिन में, इंजेक्शन मधुमक्खियों का लगभग 60-80% जिंदा थे, और 20E समाधान के लिए विलायक के साथ इंजेक्शन मधुमक्खियों के जीवित रहने की दर है कि कीट खारा (तालिका 2) के साथ के बराबर था। 20E इंजेक्शन का असर दोनों mrjp2 और HPGs में Hgb3 की अभिव्यक्ति (चित्रा 5) 16 की कमी हुई। 20E, mrjp2 और Hbg3 पर सामयिक methoprene आवेदन के प्रभाव के अलावा (3 टेबल) के बाद 7 दिन बच गया। दूसरी ओर, मधुमक्खियों का केवल लगभग 20% से 30% के साथ इंजेक्शन एसीटोन / मधुमक्खी खारा (1: 4) समाधान 7 दिन इंजेक्शन के बाद बच गया जब जीवित मधुमक्खियों 1 गिना रहे थे, 3, 5 और 7 दिनों के इंजेक्शन के बाद (तालिका 4) । इस प्रकार, methoprene उपचार के लिए आवेदन विधि को अपनाया गया था। Methoprene के आवेदन mrjp2 की अभिव्यक्ति हिचकते और Hbg3 की अभिव्यक्ति (चित्रा 6) 16 बढ़ाया।

आकृति 1
चित्रा 1. एकल पलटन कॉलोनी प्रयोग का अवलोकन। (ए) योजना एकल पलटन कालोनियों की तैयारी के लिए। (बी) के प्रयोग के समय पाठ्यक्रम preparin सेनर्स मधुमक्खियों और असामयिक foragers इकट्ठा करने के लिए जी एकल पलटन कालोनियों। क्षैतिज तीर एकल पलटन कालोनियों में एक कार्यकर्ता के जीवनकाल के दौरान इंगित करता है। खड़ी रेखा के साथ नंबर कार्यकर्ता उम्र संकेत मिलता है। इतना ही नहीं असामयिक foragers लेकिन यह भी Overaged नर्स मधुमक्खियों (28-32 दिन पुरानी) एकल पलटन कालोनियों 15 में पाया जा रिपोर्ट कर रहे हैं। इस प्रकार, Overaged नर्स मधुमक्खियों और foragers के बीच शरीर क्रिया विज्ञान की तुलना में, एकल पलटन कालोनियों में प्रदर्शन किया जा सकता है, हालांकि इस अध्ययन में यह नहीं किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. HPG राज्यों के तीन वर्गों दिखा तस्वीरें। विकसित (ए), मध्यवर्ती (बी), और सिकुड़ा हुआ (सी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. भूमिका जुड़े एकल पलटन कालोनियों से श्रमिकों के HPGs में mrjp2 और Hbg3 की अभिव्यक्ति। ग्राफ से दो एकल पलटन सह mrjp2 (ए) और Hbg3 (बी) नर्स मधुमक्खियों (एन) और असामयिक foragers (पीएफ) के बीच HPGs में mRNA स्तर की तुलना में प्रदर्शित करता हैlonies। प्रत्येक जीन की mRNA स्तर Ribosomal प्रोटीन 49 (rp49) के साथ कि सामान्यीकृत था। नर्स मधुमक्खी HPGs में प्रत्येक जीन के रिश्तेदार mRNA स्तर के रूप में परिभाषित किया गया था 1. कुछ असामयिक foragers में mrjp2 के mRNA स्तर क्योंकि संकेत का पता लगाने सीमा की तुलना में कम तीव्रता के मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता है। इसलिए, नमूनों की संख्या जीन के बीच अलग है। सापेक्ष mRNA स्तर मानक त्रुटि के साथ संकेत कर रहे हैं। तारों नर्स मधुमक्खियों और असामयिक foragers के बीच महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है (*, पी <0.05; टी परीक्षण)। यह आंकड़ा Ueno एट अल से reproduced किया गया है।, (2015) 16। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. 20E injec के लिए प्रोटोकॉल की योजनाtion। प्रक्रियाओं 2.3 और प्रोटोकॉल अनुभाग में 2.4 इस आंकड़े में सचित्र हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा HPGs 16 में mrjp2 और Hbg3 अभिव्यक्ति पर 20E इंजेक्शन के प्रभाव 5.। ग्राफ mrjp2 की mRNA स्तर की तुलना से पता चलता (ए) और Hbg3 (बी) 20E इलाज मधुमक्खियों (20E +) और मधुमक्खियों को नियंत्रित (20E-) के बीच HPGs में। ग्राफ के तहत संख्या 20E उपचार के बाद दिन का संकेत मिलता है। प्रत्येक जीन की mRNA स्तर बढ़ाव कारक 1α-F2 (EF1α-F2) के साथ कि सामान्यीकृत था। के सापेक्ष mRNA स्तर1 के रूप में सापेक्ष mRNA स्तर एक मानक त्रुटि के साथ संकेत कर रहे हैं नियंत्रण मधुमक्खी HPGs में प्रत्येक जीन परिभाषित किया गया था। एक तारांकित 20E इलाज मधुमक्खियों और मधुमक्खियों को नियंत्रित बीच एक महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है (*, पी <0.05; टी परीक्षण)। यह आंकड़ा Ueno एट अल से reproduced किया गया है।, (2015) 16। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा HPGs 16 में mrjp2 और Hbg3 अभिव्यक्ति पर methoprene आवेदन के 6. प्रभाव। ग्राफ methoprene इलाज मधुमक्खियों और मधुमक्खियों को नियंत्रित बीच HPGs में mrjp2 (ए) और Hbg3 (बी) के mRNA स्तर की तुलना से पता चलता।प्रत्येक जीन की mRNA स्तर EF1α-F2 के साथ कि सामान्यीकृत था। 1 के रूप में सापेक्ष mRNA स्तर मानक त्रुटि के साथ संकेत कर रहे हैं नियंत्रण मधुमक्खी HPGs में प्रत्येक जीन के सापेक्ष mRNA स्तर परिभाषित किया गया था। तारों के methoprene इलाज मधुमक्खियों और मधुमक्खियों को नियंत्रित के बीच महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है (*, पी <0.05; टी परीक्षण)। यह आंकड़ा Ueno एट अल से reproduced किया गया है।, (2015) 16। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कालोनी नं मनाया व्यवहार व्यक्तियों की संख्या प्रत्येक कक्षा में HPG
विकसित मध्यम सिकुड़ा हुआ कुल
1 नर्सिंग 8 1 1 10
foraging 0 4 7 1 1
2 नर्सिंग 4 2 0 6
foraging 0 0 5 5

तालिका 1: कार्यकर्ताओं जिसका नर्सिंग या foraging व्यवहार एकल पलटन कालोनियों में मनाया गया की HPGs का वर्गीकरण। दो एकल पलटन कालोनियों से कार्यकर्ताओं में HPG आकार (कॉलोनी नं 1 और 2।) तीन वर्गों में बांटा गया था; 'विकसित', 'इंटरमीडिएट' और आकार के द्वारा 'सिकुड़ा हुआ'।

दिन इंजेक्शन के बाद कोई इंजेक्शन कीट खारा 20E Soln के लिए विलायक
1 ट्रायल Day0 15/15 15/15 14/15
पहला दिन 15/15 14/15 13/15
Day5 14/15 13/15 11/15
Day7 14/15 12/15 9/15
2 ट्रायल Day0 15/15 15/15 15/15
पहला दिन 15/15 13/15 15/15
Day5 15/15 11/15 12/15
Day7 14/15 10/15 12/15

तालिका 2: जीवन रक्षा 20E समाधान के लिए विलायक के साथ इंजेक्शन मधुमक्खियों की दर। पंद्रह कार्यकर्ताओं प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में तैयार किए गए थे।

दिन आवेदन के बाद एसीटोन Methoprene
1 ट्रायल 0 दिवस 7/7 8/8
7 दिन 7/7 6/8
2 ट्रायल 0 दिवस 7/7 8/8
7 दिन 7/7 8/8

तालिका 3:। अस्तित्व के साथ methoprene सात से आठ श्रमिकों प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में तैयार किए गए इलाज किया मधुमक्खियों की दर।

दिन इंजेक्शन के बाद कोई इंजेक्शन एसीटोन / बी खारा (1: 4)
0 दिवस 15/15 15/15
पहला दिन 15/15 6/15
तीसरा दिन 15/15 5/15
दिन 5 15/15 4/15
7 दिन 15/15 4/15

सारणी 4: (: 4 1)। समाधान पंद्रह कार्यकर्ताओं प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए तैयार किए गए जीवन रक्षा मधुमक्खियों एसीटोन / मधुमक्खी खारा के साथ इंजेक्शन की दर। एसीटोन / मधुमक्खी खारा (1: 4) समाधान कार्यकर्ता पेट में इंजेक्ट किया गया था। मधुमक्खी खारा की संरचना 130 मिमी NaCl, 6 मिमी KCl, 4 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी 2 CaCl, 160 मिमी सुक्रोज, 25 मिमी ग्लूकोज, और 10 मिमी HEPES (7.0 पीएच)।

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Discussion

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एकल पलटन कालोनियों की तैयारी

यहाँ हम कार्यकर्ता मक्खियों की भूमिका में बदलाव के साथ जुड़े HPG शरीर क्रिया विज्ञान के विश्लेषण के लिए एकल पलटन कालोनियों तैयार करने के लिए हमारे पिछले अध्ययन के 16 में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन किया। नर्स मधुमक्खियों और असामयिक foragers कि मापदंड प्रक्रियाओं 1.6-1.7 और चित्रा 2 में वर्णित संतुष्ट एकल पलटन कालोनियों (1 टेबल) में मनाया गया। चित्रा 2 में तस्वीरों के लिए उपयोगी होगा HPG के वर्गीकरण के लिए एक संदर्भ के रूप में राज्यों में। दोनों कार्यकर्ता व्यवहार और HPG विकास पर आधारित मानदंड ठेठ कालोनियों में नर्स मधुमक्खियों या foragers परिभाषित करने के लिए मान्य हैं। धीरे-धीरे foraging को नर्सिंग से भूमिका बदलाव उन कालोनियों में आय: नर्सिंग व्यवहार में बिताए समय की राशि धीरे-धीरे गिरावट आती है, जबकि कि foraging व्यवहार में धीरे-धीरे भूमिका पारी के दौरान 2 बढ़ जाती है। इस प्रकार, यह कार्यकर्ताओं से कहा कि विशेष रूप से एकत्र करने के लिए मुश्किल होगाकेवल व्यवहार मापदंडों के आधार पर नर्सिंग या foraging प्रदर्शन करते हैं। नतीजा यह है कि HPGs में mrjp2 और Hbg3 की अभिव्यक्ति के कार्यकर्ताओं की भूमिका के साथ जुड़ा हुआ है स्पष्ट रूप से इंगित करता है कि यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल नर्स मधुमक्खियों और एकल पलटन कालोनियों से असामयिक foragers (चित्रा 3) में HPG शरीर क्रिया विज्ञान की जांच करने के लिए अपनाया जा सकता है। दोनों कार्यकर्ता व्यवहार और HPG विकास पर आधारित मानदंड भी एकल पलटन कालोनियों से नर्स मधुमक्खियों और असामयिक foragers को परिभाषित करने में लागू हो सकता है। HPGs के अलावा, सिर में अन्य बहि ग्रंथियों भूमिका पारी के सहयोग से शारीरिक परिवर्तन से गुजरना। उदाहरण के लिए, अलार्म फेरोमोन 2-heptanone 2 के संश्लेषण के लिए चिंता भोजन के लिए फैटी एसिड के संश्लेषण से जबड़े ग्रंथि परिवर्तन का कार्य करते हैं। प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित इस प्रकार HPGs के अलावा अन्य बहि ग्रंथियों की भूमिका से जुड़े शरीर क्रिया विज्ञान की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

n के सफल संग्रहurse मधुमक्खियों और एकल पलटन कालोनियों से असामयिक foragers नव उभरा श्रमिकों के लिए पर्याप्त संख्या के संग्रह पर निर्भर करता है जब कालोनियों तैयार हैं। नव उभरा श्रमिकों की कम संख्या एकत्र किया जाता है, तो यह काफी नर्स मधुमक्खियों और असामयिक foragers इकट्ठा करने के लिए मुश्किल होगा। इसके अलावा, रानियों की हालत सफल नमूना संग्रह के लिए एक और महत्वपूर्ण मुद्दा है। एक बड़े पेट के साथ क्वींस अंडे बिछाने क्योंकि इन रानियों आमतौर पर अंडाशय विकसित किया है के लिए अच्छे हैं। इस प्रकार, श्रमिकों के श्रम क्योंकि चिंता लगातार रानी द्वारा आपूर्ति की है प्रभावी ढंग से एकल पलटन कालोनियों में भी विभाजित होने लगा है। कोई चिंता आपूर्ति की जाती है, तो यह एकल पलटन कालोनियों से नर्स मधुमक्खियों को इकट्ठा करने के लिए मुश्किल होगा। अंत में, पोस्टर पेंट का उपयोग श्रमिकों अंकन क्योंकि foragers कभी कभी गलत कॉलोनी के लिए वापसी सुनिश्चित करने के लिए कि श्रमिकों एकल पलटन कालोनियों से एकत्र कर रहे हैं की आवश्यकता है। असामयिक foragers प्रभावी ढंग से इकट्ठा करने के लिए, रंग के निशान होना चाहिएसंभव के रूप में कई श्रमिकों (900 से अधिक एकल पलटन कॉलोनी प्रति नव उभरा श्रमिकों) के लिए आवेदन किया। अंकन के लिए पानी आधारित स्याही का उपयोग करते हैं, की सिफारिश की जा सकती है क्योंकि एक तेल आधारित स्याही, जो आमतौर पर वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों शामिल, मधुमक्खियों के बीच रासायनिक संचार में बाधा आ सकती। पानी आधारित स्याही के निशान प्रयोग के दौरान बहुत ज्यादा नहीं हो पाती थी।

हार्मोन उपचार

हम यह भी कार्यकर्ताओं के सिर में 20E इंजेक्शन लगाने HPG शरीर विज्ञान (mrjp2 और Hbg3 अभिव्यक्ति) पर ecdysone के प्रभाव की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया। मधुमक्खियों के जीवित रहने की दर कीट खारा या 20E समाधान के लिए विलायक के साथ इंजेक्शन बाद के विश्लेषण के लिए पर्याप्त था, यह दर्शाता है कि प्रोटोकॉल के इंजेक्शन के लिए यहाँ वर्णित एक इंजेक्शन टिप और 20E समाधान के लिए विलायक का उपयोग कर 20E इंजेक्शन प्रयोग (2 टेबल के लिए अपनाया जा सकता है )। इसके अलावा, HPGs में जीन की अभिव्यक्ति की तुलना20E इलाज मधुमक्खियों और मधुमक्खियों को नियंत्रित बीच संकेत दिया है कि इंजेक्शन 20E mrjp2 और Hbg3, जो दोनों के HPG समारोह से संबंधित हैं (चित्रा 5) की अभिव्यक्ति बदल दिया है। यह परिणाम पता चलता है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल HPG शरीर क्रिया विज्ञान पर ecdysone के प्रभाव की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है, और इस तरह के जबड़े ग्रंथियों के रूप में सिर में अन्य बहि ग्रंथियों, जांच के लिए अपनाया जा सकता है। इसके अलावा, इंजेक्शन विधि अन्य रसायनों के इंजेक्शन लगाने के लिए अपनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल जीन पछाड़ना प्रयोगों के लिए सिर में डबल असहाय शाही सेना के समाधान के इंजेक्शन लगाने के लिए उपयुक्त होगा।

20E के अलावा, हम methoprene है, जो एक झा अनुरूप है लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। Methoprene आमतौर पर पेट के लिए लागू किया जाता है। दूसरी ओर, methoprene कार्यकर्ताओं के सिर को लागू किया गया था, यहाँ। लगभग methoprene या एसीटोन के सामयिक आवेदन के साथ सभी मधुमक्खियों को 7 दिन के इलाज के बाद बच गयासिर करने के लिए 5 μl methoprene या एसीटोन समाधान के उस आवेदन का सुझाव कार्यकर्ता जीवित रहने की दर (3 टेबल) पर थोड़ा प्रभाव है। इसके अलावा, mrjp2 और methoprene- और एसीटोन का इलाज मधुमक्खियों के बीच HPGs में Hbg3 अभिव्यक्ति की तुलना इंगित करता है कि methoprene आवेदन mrjp2 अभिव्यक्ति को रोकता है और Hbg3 अभिव्यक्ति (चित्रा 6) को बढ़ाता है। इन परिणामों का सुझाव है कि प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित इस तरह के सिर में HPGs रूप बहि ग्रंथियों के शरीर क्रिया विज्ञान पर methoprene के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है।

सफल हार्मोन उपचार में इलाज मधुमक्खियों के जीवित रहने की दर पर निर्भर करता है। एक रेफ्रिजरेटर में कम तापमान जोखिम मधुमक्खियों anesthetizing के लिए उपयुक्त हो सकता है। बर्फ पर संवेदनहीनता की सिफारिश नहीं है क्योंकि मधुमक्खियों बर्फ पर गीला हो जाएगा, एक कम जीवित रहने की दर के लिए अग्रणी। इसके अलावा, इंजेक्शन विधि मधुमक्खियों को जीवित रखने के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु हो सकता है। यह मीटर के लिए महत्वपूर्ण हैake इंजेक्शन नोक लंबी और पतली, और इंजेक्शन से मधुमक्खियों को नुकसान को कम करने के लिए कटर का उपयोग कर एक तेज टिप करने के लिए इसे आकार देने के लिए। हालांकि, इंजेक्शन विधि, HPG शरीर क्रिया विज्ञान पर methoprene के प्रभाव की जांच के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है क्योंकि एसीटोन methoprene के लिए विलायक नकारात्मक मधुमक्खी अस्तित्व (तालिका 4) को प्रभावित करता है। इसके अतिरिक्त, यहाँ वर्णित इंजेक्शन विधि कालोनियों के रूप में इंजेक्शन मधुमक्खियों अपने उपनिवेशों से बाहर रखा जाएगा, जब वे कर रहे हैं इंजेक्शन के बाद फिर से शुरू में व्यवहार के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। मामूली चोट के साथ श्रमिक कालोनियों से बाहर रखा जा सकता है। इस तरह के आवेदन या हार्मोन की मौखिक प्रशासन के रूप में अन्य विधियों, व्यवहार विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो सकता है।

एकल पलटन कॉलोनी कार्यकर्ता मधुमक्खियों 10,11 के श्रम विभाजन के विनियमन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अतिरिक्त, किशोर हार्मोन के साथ इलाज के व्यवहार और मस्तिष्क के कामकाज की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया हैश्रम 11 के विभाजन के लिए संबंधित पर। हालांकि, दोनों एकल पलटन कालोनियों की तैयारी और झा के साथ इलाज के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पहले से इस तरह के विस्तार में नहीं प्रदान की गई है। हाल ही में, श्रम के विभाजन में ecdysone का महत्व तेजी से मान्यता प्राप्त हो रहे हैं, और दोनों झा द्वारा श्रम और ecdysone के विभाजन के नियमन के लिए सुझाव दिया है 23। एकल पलटन कालोनियों और इस तरह के झा के रूप में हार्मोन उपचार और इस आलेख में वर्णित ecdysone के सफल तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल कार्यकर्ता शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के क्षेत्र में उन्नति के लिए योगदान कर सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
UNIPOSCA Mitsubishi pencil PC-5M Marker pen for the application of marks to bees  
20-hydroxyecdysone Sigma Aldrich H5142
Methoprene Sigma Aldrich 33375
Breeding case insect IRIS OHYAMA CP-SS
Electromotion mixier  ISO 23M-R25 homogenization of tissue
TRIZol Reagent Invitrogen 15596-026 the reagent for total RNA extraction
DNase I  Takara 2270A
PrimeScript RT reagent kit Takara RR037A the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II Takara RR820A the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument Roche 12011468001 the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl) Roche 4929292001 the material for real-time PCR

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References

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एकल पलटन कालोनियों और कार्यकर्ता मधुमक्खियों के हार्मोन उपचार की तैयारी भूमिका और / या अंत: स्रावी प्रणाली के साथ फिजियोलॉजी एसोसिएटेड का विश्लेषण करने के लिए
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Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).More

Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).

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