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Neuroscience

단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기

doi: 10.3791/54240 Published: September 6, 2016

Summary

여기에서 우리는 단일 코호트 꿀벌 식민지의 제조를위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명 - 롤 관련 근로자의 생리를 분석하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 또한 작업자의 행동 및 / 또는 생리 조절에 이러한 호르몬의 참여를 평가하기 위해 청소년 호르몬과 에크 디손과 근로자를 치료하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

Introduction

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유럽 ​​꿀벌, API를 mellifera이는 고도로 조직 된 사회 (1)와 eusocial 곤충이다. 작업자 꿀벌 (노동 계급) 식민지 활동을 유지하기 위해 다양한 작업에 종사하고 있으며, 이러한 작업은 노동 2-4의 연령과 관련된 부문이라고 우화 후 작업자 꿀벌의 연령에 따라 변경합니다. 젊은 노동자 (<십삼일 세) 고령 근로자는 동안, 로얄 제리 (간호사 꿀벌)을 분비하여 하이브에 무리를 돌봐 (> 15 일)는 하이브 (초지) 2-4 이외의 꿀과 꽃가루를 수집합니다. 노동자의 생리는이 역할 변화와 관련하여 변경합니다. 예를 들어, 하인두암 샘 (HPGs)의 기능은 2,5를 구하고으로 간호의 역할 변화와 관련 외분비 머리에있는 땀샘, 변화를 쌍. 간호사 꿀벌 HPGs는 주로 꿀벌 우유의 주요 구성 요소 주요 로얄 젤리 단백질을 합성. 한편, 주로 사일리지의 HPGs포도당과 과당 수크로오스로 변환하여 허니에 꿀을 처리하기 위해, 예컨대 α 글루코 III 탄수화물 대사 효소를 합성한다. 우리의 이전 연구는 밝혀 그 역할 변화 6-9시 α - 글루코시다 III, 변경 내용을 암호화하는 주요 로얄 젤리 단백질 및 Hbg3를 인코딩 mrjp2의 표현.

HPGs 포함 작업자 조직에서 생리적 변화는, 롤 시프트 또는 작업자의 나이와 관련되어 있는지 여부를 확인하기 위해, 단일 집단을 조제 같은 꿀벌 콜로니 인구 조성물을 조작하는 것이 유용 할 것이다 식민지는 거의 같은 나이의 노동자들은 다른 작업 10, 11을 수행합니다. 로빈슨 등의 알. (1989)는 단일 콜로니 10 코호트를 구축하는 방법을 설명했다. 단일 코호트 식민지 초기에 여왕과 0~2일 된 근로자를 포함한다. 며칠 식민지를 설정 한 후, ALM의 노동자같은 나이 OST 다른 작업을 가정합니다. 다른 근로자가 평소보다 일찍 꼴 작업을 수행함으로써 조숙 한 초지라고하는 반면 일부 노동자들은 전형적인 식민지로 간호 작업을 수행합니다. 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 사이의 유전자 발현 비교는 노동자 조직 12-16의 역할 관련된 생리에 대한 유용한 정보를 제공 할 것이다. 여기, 우리는 HPGs (16)의 역할 - 및 / 또는 연령 관련 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한 간단히 HPG 생리학을 평가하기 위해 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 mrjp2Hbg3의 유전자 발현을 확인하는 방법을 설명한다.

단일 코호트 식민지에서 노동자 생리학의 분석뿐만 아니라, 내분비 시스템의 검사 역할 관련 작업자 생리의 규제 메커니즘을 분석하는 것이 중요하다. 알것입니다 청소년 호르몬 (JH)곤충 애벌레의 '현 상태'호르몬과 같은 WN, 작업자 꿀벌 11 꼴에 간호의 역할에 변화를 가속화합니다. 또한, 변형하는 동안 털갈이 호르몬으로 알려져있다 에크 디손은, 버섯 몸에 작업자 뇌 17-19의 높은 중심을 표현 에크 디손 신호 분자를 코딩하는 유전자와 같은 역할 변화에 관여 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 또한 HPG 생리학의 내분비 시스템의 효과 분석 (의 발현에 대한 자세한 에크 디손의 활성 형태 20E 근로자를 치료하기 위해 우리의 이전 연구 (16)에 사용되는 프로토콜 및 methoprene하는 JH 아날로그를 설명 mrjp2Hbg3).

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Protocol

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단일 코호트 식민지 1. 준비

  1. 세 꿀벌 식민지 두 개의 단일 코호트 식민지를 만들려면 새로 등장 노동자의 충분한 수를 얻기 위해를 준비합니다.
    1. 콤에 덮인 주변 세포의 일부 번데기는 갈색 눈과 핀셋을 사용하여 출장 빗를 열어 착색 된 표피가 있는지 확인합니다. 이 번데기 주변 콤 세포에 존재하는 경우, 전체의 빗 번데기 대부분 약 1~3일을에 등장 할 것이다.
    2. 그 후, 모든 부착 성인 꿀벌이 브러시로 제거 된 후 이러한 번데기가 포함 된 빗를 수집하고 식민지 사이의 변동성을 최소화하기 위해 세 개의 식민지에서 빗 섞는다.
  2. 빈 하이브 상자에 수집 된 빗를 놓고 습한 조건에서 33 ° C (> 60 % 상대 습도)에 품어. 수집 된 빗에서 삼일 (식민지 3,000 근로자)을 통해 약 6,000 새롭게 등장 근로자를 수집합니다.
  3. worke의의 양을 결정오 새롭게 등장 노동자의 중량을 기준으로 R은 임의로 조작되지 식민지에서 수집.
    1. 무작위로 저울을 사용하여 조작되지 식민지에서 수집 한 다섯 새롭게 등장 노동자의 무게를.
      참고 : 다섯 새롭게 등장 근로자의 무게는 일반적으로 500-600 밀리그램이다.
    2. 오 새롭게 등장 근로자의 평균 무게에 의해 수집 된 노동자의 무게를 나누어 수집 된 노동자의 양을 추정한다.
  4. 수성 포스터 페인트 마커를 사용하여 약 1,800 근로자 (식민지 당 900 노동자)의 흉곽에 페인트 자국을 적용합니다.
    참고 : 빨 마커 페인트를 적용하는 데 사용되는 재료의 표에 나열되어 있습니다.
  5. 두 빗, 한 빗 포함 꿀, 보존 식품 등의 꽃가루와 알을 낳는 여왕에 의해 또 다른 빈 빗 포함 된 새 하이브 상자에 여왕 약 3,000 0-2일 된 근로자를 소개합니다. 꿀과 꽃가루 FR이 포함 된 빗를 수집톰 모든 부착 꿀벌 후 다른 조작되지 식민지가 제거됩니다.
    참고 : 핵 하이브 상자 (소형 하이브 상자)의 사용을 권장합니다.
  6. 단일 코호트 식민지를 만든 후 6 ~ 8 일 페인트 마크 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 수집합니다.
    1. , 간호사 꿀벌 수집 한 무리 돌봐 빗 세포에 머리를 넣어 노동자를 선택합니다. 많은 무리와 성인 근로자를 포함 빗에서 간호사 꿀벌을 수집 핀셋을 사용합니다.
      참고 : 단계 1.7에 설명 된대로 해부 할 때 수집 된 근로자의 HPGs이 개발하는 경우, 이러한 노동자들은 간호사 꿀벌로 정의됩니다. 핀셋으로 흉곽을 잡고하는 콤 근로자를 선택하는 것이 좋습니다.
    2. 초지를 수집하려면, 자신의 뒷다리에 꽃가루 부하 자신의 두드러기로 돌아 근로자를 캡처하는 곤충 그물을 사용합니다.
      참고 : 단계 1.7에 설명 된대로 해부 할 때 캡처 노동자의 HPGs이 수축 나타날 경우 해당 근로자는 초지로 정의됩니다.
  7. CLAS세 그룹, '개발', '중간'으로 HPG를 sify하고, 실체 현미경 아래에서 절개하여 '말라 비틀어 진'.
    1. 꿀벌 비행 또는 걸을 수있을 때까지 10 ~ 15 분 동안 냉장고에 곤충 케이지에서 10 ~ 15 벌을 마취. 그런 다음 얼음에 꿀벌을 이동하고 5 분 동안 얼음에 마취를 완료합니다.
      참고 : 마취를 달성하기 위해 총 15 ~ 20 분 정도 걸립니다. 마취 시간을 단축 할 필요가있을 때에는 케이지 벌 수 케이지 당 1-3 꿀벌로 감소되어야한다.
    2. 가위와 핀셋으로 몸에서 머리를 해부하다. 핀 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 머리를 고정합니다. 머리를 해결하기 위해 안테나의 기지에 두 개의 핀을 삽입합니다. 곤충 생리 식염수 (130 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 2)에 고정 된 머리를 만끽 해보세요.
    3. 쌍안 현미경 미세 핀셋을 사용하여 머리와 수술 용 칼의 표피의 앞쪽 부분을 제거합니다.
      주 : HPGs 용이 C 제거한 후 헤드에 있습니다uticle. HPG는 머리에 뇌의 주위에 존재하는 botryoid 기관이다.
    4. 표피 아래에 흰 막질 조직되는 기관 조직을 제거합니다. 그런 다음 천천히 족집게로 당겨 머리에서 HPGs을 해부하다.
    5. '개발'과 같은 대형 원형 꽈리와 HPGs를 분류. '말라 비틀어 진'작은 왜곡 꽈리와 HPGs를 분류. HPGs이 '중간'으로도 '개발'이나 '말라 비틀어 진'에 해당하는 분류.
      참고 : HPG 상태의 세 가지 클래스가 그림 2에 표시되어 보여 대표 사진.
    6. 주제 '개발'과 같은 RNA 추출에 '말라 비틀어 진'HPGs 각각과 간호사 꿀벌과 초지 (4 절) 사이의 HPGs에서 유전자 발현을 비교하는 '간호사 꿀벌 HPGs'와 '사일리지 콤바인 HPGs'.

20E 2. 주입

  1. DESCR 전형적인 식민지에서 간호사 꿀벌 수집절차 1.6.1에서 ibed.
    참고 : 꿀벌을 사육하는 바와 같이 HPGs이 꿀벌에 검사 할 수 없습니다.
  2. 냉장고 (안 얼음)에서 4 ° C에서 꿀벌을 마취.
    참고 : 마취를 달성하기 위해 약 30 분 소요됩니다. 마취 시간이 단축되는 경우, 케이지 벌 수 케이지 당 1-3 꿀벌로 감소되어야한다.
  3. 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 꿀벌을 고정.
  4. 유리 바늘 풀러를 사용하여 보정 된 모세관 마이크로 피펫으로부터 이루어지는 분사구를 사용하여 헤드의 전방 측면에 20E 액 1 μl를 주입한다.
    1. 에탄올 곤충 식염수 (130 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 2) 혼합물 (20E)를 용해 (1 : 4) 2.5 μg의에서 / μL.
    2. 고무 튜브에 분사구를 연결 관의 양측에 옐로우 마이크로 피펫 팁을 연결한다.
    3. 은 마이크로 피펫을 사용하여 파라 필름에 20E 솔루션 1 μl를 놓고 입에 노란색 마이크로 피펫 팁을 개최분사구로 용액을 그리 거라고.
    4. 안테나의 기본에 주입 팁을 삽입하고 노란색 마이크로 피펫 팁을 통해 불어 솔루션을 주입.
      주 :이 단계에 도시 된 프로토콜은 대표적인 주입 방법이지만, 자동 주입 장치의 사용이 20 필요한 안전 권장된다.
  5. 후면은 1 ~ 3 일 동안 어둡고 습한 조건 (> 60 % 상대 습도)에서 33 ~ 36 ℃에서 곤충 케이지에 주입 된 꿀벌 (이상적인 온도는 35 ° C)입니다. 공급 꿀 - 물 혼합물 (1 : 1) 꿀벌에. 필요한 경우, 주사 후 꿀벌 생존 계산합니다.

Methoprene 3. 응용 프로그램

  1. 모든 부착 성인 꿀벌이 브러시로 제거 후 전형적인 식민지에서 번데기가 포함 된 빗를 수집합니다. 33 ~ 36 ℃에서 콤을 품어 일일 최대를위한 다습 한 조건에서 (> 60 % 상대 습도) (이상적인 온도는 35 ° C)입니다.
  2. 육일 후, 식민지에서 (6 일 이전) 그린 근로자를 수집합니다. 핀셋으로 자신의 흉곽을 잡고 빗에서 그린 근로자를 선택합니다.
  3. 절차 2.2에서와 같이 (안 얼음) 냉장고에 4 ° C에서 꿀벌을 마취. 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 꿀벌을 고정 및 마이크로 피펫을 사용하여 머리에 아세톤에 용해 methoprene 용액 (50-250 μg의 / μL)의 1-5 μl를 적용합니다. 아세톤에 내성 필터 팁을 사용합니다.
    참고 : 아세톤 죽음에 이르는 꿀벌에 유해한 영향을 미칠 수 있습니다. 꿀벌의 높은 사망률이 관찰되는 경우, 최소 1 μL로 아세톤의 양의 감소가 권장된다.
  4. 후면 33 ~ 36 °의 C (이상적인 t에서 곤충 케이지에서 꿀벌럼 온은 어둡고 습한 조건에서 7 일간 35 ° C) (> 60 % 상대 습도)입니다. 공급 꿀 - 물 혼합물 (1 : 1) 꿀벌에. 필요한 경우, 국소 적용 후 꿀벌 생존 계산합니다.
    참고 :이 기사에서는 생존 꿀벌 7 일 응용 프로그램 (표 3) 후 계산됩니다.

4. RNA 추출 및 정량적 RT-PCR

  1. 꿀벌 마취 및 1.7.4에 단계 1.7.1에 설명 된대로 HPGs을 해부하다.
  2. 사용할 때까지 -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소에 microcentrifuge 관에서 해부 HPGs를 수집합니다.
  3. 단백질 변성을위한 시약 400 μl를 추가합니다.
    참고 :이 시약 (재료의 표 참조) 상업적으로 사용할 수 있습니다.
  4. 미세 원심 관 내부에 맞는 균질화 유봉과 전기 믹서 핸드 헬드를 사용하여 HPG 조직을 균질화. 끊는 얼음를 Lyse 조직 세포에 1 분 동안 약 300 rpm의 회전 속도로 균질화시킨다.
    (재료의 표 참조).
  5. 80 μl의 클로로포름을 넣고 잘 섞는다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션.
  6. 4 ℃에서 15 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기. 새로운 튜브로 수성 단계를 전송합니다. 이소프로판올 1 μL 글리코겐 (5 ㎎ / ㎖)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적어도 20 분 동안 -20 ℃에서 인큐베이션.
  7. 4 ° C에서 10 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
  8. 펠렛에 75 % 에탄올 400 μl를 추가하고 잘 혼합, 4 ° C에서 15 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리하고, 상층 액을 제거합니다. 한 번 더이 절차를 반복합니다.
  9. 5-10 분 동안 펠렛을 공기 - 건조 후, 10 μL의 RNase가없는 물에 녹인다.
    참고 : 펠렛의 완전 건조가 물에 RNA 펠렛의 불용 화의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 약간 젖은 펠렛은 적합용해.
  10. NanoDrop 또는 유사한 같은 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다.
  11. 어떤 오염 게놈 DNA를 분해하기 위해 30 분 동안 37 ℃에서 배양에서의 DNase I의 2.0 U와 총 RNA의 500 NG를 취급합니다.
  12. 역 전사의 DNase I 처리 RNA 200 NG 및 시판되는 키트를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 특이 적 프라이머 (mrjp2 (재료 및 시약의 테이블의 목록 참조) 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 '와 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). 다음과 같이 PCR을 수행 : 95 ° C X 30 초 + (95 ° C × 5 초 + 60 ° C X 15 초 + 72 ° C × 20 ​​초) 45 ~ 55주기를 X].
  13. 신장 인자 1α-F2 (EF1α˗F2) 또는 리보솜 단백질 49 (rp49) 9,16,21,22의와 성적 증명서의 양을 정상화. 이 유전자는 신뢰할 수있는 제어 g입니다QRT-PCR을 사용하여 HPGs 유전자 발현을 분석 ENES.
  14. 통계 소프트웨어를 사용하여 두 실험 그룹 (간호사 꿀벌 대 조숙 기계, 제어 꿀벌 대 20E 처리 꿀벌 및 제어 꿀벌 대 methoprene 처리 꿀벌) 사이에 유의 한 차이를 감지하는 두 개의 꼬리 t 테스트를 수행합니다.
    주 : F-테스트 분산의 균일 성을 가정하면, 스튜던트 t 검정을 사용할 수있다. 그렇지 않으면 웰치 t 테스트가 사용될 수있다.

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Representative Results

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단일 콜로니 코호트 제조 프로토콜의 개요는도 1a에 도시되어있다. 컬렉션 샘플 단일 코호트 식민지를 준비에서 실험의 시간 코스는 그림 1B에 표시됩니다. 간호 행동이나 구하고 행동에 대한 행동 기준을 만족 근로자는 단일 코호트 식민지에서 수집하고, HPG의 개발은 이러한 노동자 추정 표 1은 세 그룹으로 HPG 개발의 분류를 보여줍니다.; 크기에 따라 '개발', '중간'및 '주름진'. HPGs의 세 가지 클래스를 보여주는 대표적인 사진은 그림 2에 표시됩니다. 결과는 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 모두, 프로토콜에 설명 된 기준에 따라, 또한 단일 코호트 식민지에서 관찰되었다 나타냅니다. HPGs에 mrjp2Hbg3의 발현이었다 엔HPG 기능은 작업자의 역할 (그림 3) (16)와 연결되어 있음을 나타내는 각각 간호사 꿀벌과 조숙 한 기계,에 riched.

작업자에 헤드 (20E)를 주입하기위한 절차.도 4에 도시되어 생존 꿀벌 5 7 일간 생존을 조사 주사 후 1 센다 곤충 생리 식염수 또는 20E 실험 전에 20E 솔루션에 대한 용매를 주입 꿀벌의 속도입니다. 주입 후 7 일에서 주입 꿀벌의 약 60-80% 살아 있었고, 20E 솔루션을위한 용매로 주입 꿀벌의 생존율은 곤충 생리 식염수 (표 2)에 필적했다. 20E 주입의 영향 (도 5) 16 HPGs 모두 mrjp2Hgb3의 발현을 감소시켰다. 20E, mrjp2Hbg3 국소 methoprene 응용 프로그램의 효과에 더하여 (표 3) 후 7 일에서 살아 남았다. 한편, 꿀벌의 약 20 % 내지 30 %가 주입 아세톤 / 꿀벌 염수 (1 : 4) 생존 꿀벌 5 7 일간 주사 후 3 일 계산되었을 때 용액을 7 일 주사 후 생존 (표 4) . 따라서 methoprene 처리 용 도포 방법을 채용 하였다. methoprene의 적용 mrjp2의 발현을 억제하고 (도 6) 16 Hbg3의 발현을 향상.

그림 1
단일 코호트 식민지 실험 그림 1. 개요. (A) 계획 단일 코호트 식민지를 준비합니다. (B) 실험의 시간 코스 preparin에서간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 수집하는 g 단일 코호트 식민지. 수평 화살표는 단일 코호트 식민지에서 근로자의 평생의 과정을 나타냅니다. 수직 라인 숫자는 근로자의 나이를 나타냅니다. 조숙 한 초지뿐만 아니라 과시 효 간호사 꿀벌 (28~32일 이전)뿐만 아니라이 단일 코호트 식민지 (15)에서 발견되는 것으로보고있다. 문제는이 연구에서 수행되지 않았지만 따라서, 과시 효 간호사 꿀벌과 초지의 생리의 비교, 단일 코호트 식민지에서 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
HPG 상태의 세 개의 클래스를 나타내는도 2의 사진. 개발 (A), 중간체 (B), 및 주름진 (C 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 역할 관련된 단일 코호트 식민지 노동자의 HPGs에 mrjp2 Hbg3의 발현을. 그래프는 두 개의 단일 코호트 공동에서 간호사 꿀벌 (N)와 조숙 한 초지 (PF) 사이의 HPGs에 mrjp2 (A)Hbg3 (B)의 mRNA 수준의 비교를 표시lonies. 각 유전자의 mRNA 발현이 리보솜 단백질 49 (rp49)의 정규화 하였다. 간호사 꿀벌 HPGs 각 유전자의 상대적인 mRNA의 수준은 몇 조숙 초지 mrjp2에서의 mRNA 발현 때문에, 검출 임계 값보다 낮은 신호 세기로 정량화 될 수없는 1로 정의 하였다. 따라서, 샘플 수는 유전자 사이에서 다르다. 상대 mRNA 수준은 표준 오차로 표시됩니다. 별표는 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다 (* P <0.05; t 테스트). 이 수치는 우에노 등의 알에서 재현 할 수 있습니다., (2015) 16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
20E의 injec에 대한 프로토콜의 그림 4. 계획기. 절차 2.3 프로토콜 섹션에서 2.4이이 그림에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 HPGs 16 mrjp2 Hbg3 식에 20E 주입 5. 효과. 그래프 mrjp2의 mRNA 수준의 비교를 나타낸다 20E 처리 꿀벌 (20E의 +) 및 제어 꿀벌 (20E-) 사이의 HPGs에서 (A)Hbg3 (B). 그래프 아래의 숫자는 20E 처리 후의 일을 나타냅니다. 각 유전자의 mRNA의 수준은 신장 인자 1α-F2 (EF1α-F2)의 정규화 하였다. 상대의 mRNA 수준1. 상대적인 mRNA의 수준은 표준 오차로 표시되는 바와 같이, 제어 꿀벌 HPGs 각 유전자를 정의 하였다. 별표는 20E 처리 꿀벌과 제어 꿀벌 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다 (* P <0.05; t 테스트). 이 수치는 우에노 등의 알에서 재현 할 수 있습니다., (2015) 16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 HPGs 16 mrjp2 Hbg3 식에 methoprene 응용 프로그램 6. 효과. 그래프 methoprene 처리 꿀벌 제어 꿀벌의 HPGs mrjp2의 (A)Hbg3 (B)의 mRNA 수준의 비교를 나타낸다. 그만큼각 유전자의 mRNA의 수준은 EF1α-F2의 정규화 하였다. 1. 상대 mRNA 수준이 표준 오차로 표시됩니다으로 제어 꿀벌 HPGs의 각 유전자의 상대 mRNA의 수준을 정의 하였다. 별표는 methoprene 처리 꿀벌과 제어 꿀벌 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다 (* P <0.05; t 테스트). 이 수치는 우에노 등의 알에서 재현 할 수 있습니다., (2015) 16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

식민지 번호 관찰 된 동작 각 HPG 클래스에서 개인의 수
개발 중간의 시든 합계
1 육아 8 1 1 (10)
0 4 (7) (11)
육아 4 0 6
0 0 (5) (5)

표 1 : 간호 또는 구하고 행동 단일 코호트 식민지에서 관찰되었다 노동자의 HPGs의 분류. HPG의 두 개의 단일 코호트 식민지 노동자의 크기 (식민지의 제 1, 2). 세 가지 클래스로 분류 하였다 '개발', '중간'과 크기에 의해 '말라 비틀어 진'.

주입 후 일수 아니 주입하지 곤충 생리 식염수 20E의 SOLN 용제
시험 1 Day0 15/15 15/15 14/15
첫째날 15/15 14/15 13/15
Day5 14/15 13/15 11/15
Day7 14/15 12/15 9/15
시험 2 Day0 15/15 15/15 15/15
첫째날 15/15 13/15 15/15
Day5 15/15 11/15 12/15
Day7 14/15 10/15 12/15

표 2 : 20E 솔루션을 용매로 주입 꿀벌의 생존율. 다섯 노동자는 각 실험군에서 제조 하였다.

일 신청 후 아세톤 Methoprene
시험 1 날 0 7/7 8/8
7 일 7/7 6/8
시험 2 날 0 7/7 8/8
7 일 7/7 8/8

표 3 :.와 methoprene 7 ~ 8 근로자가 각 실험군에서 제조 된 처리 꿀벌의 생존율.

주입 후 일수 아니 주입하지 아세톤 / 꿀벌 식염수 (1 : 4)
날 0 15/15 15/1(5)
1 일 15/15 6/15
3 일 15/15 5/15
5 일 15/15 4/15
7 일 15/15 4/15

표 4 (4 일). 솔루션 다섯 근로자가 각 실험 그룹에 대한 준비 하였다 아세톤 / 꿀벌의 생리 식염수를 주입 꿀벌의 생존율. 아세톤 / 꿀벌 염수 (1 : 4) 용액 작업자의 복부에 주사 하였다. 꿀벌 식염수의 조성은 130 mM의 염화나트륨, 6 mM의 KCl을,를 4mM의 MgCl 2, 2.5 mM의 CaCl2를 160 mM의 슈 크로스, 25 mM의 글루코오스, 10 mM의 HEPES (PH 7.0).

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Discussion

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단일 코호트 식민지의 제조

여기에서 우리는 일벌의 역할의 변화와 관련된 HPG 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하는 우리의 이전 연구 (16)에서 사용되는 프로토콜을 설명했다. 절차 1.6-1.7 및 그림 2에 설명 된 기준을 만족 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지는 단일 코호트 식민지 (표 1)에서 관찰되었다. HPG의 분류 기준으로 미국에서 그림 2의 사진은 유용 할 것이다. 노동자의 행동과 HPG 개발 모두에 따라 기준은 전형적인 식민지에서 간호사 꿀벌 또는 초지를 정의하기위한 유효합니다. 점차 꼴로 간호의 역할 변화는 그 식민지에서 진행 : 그 꼴을 행동에 점차 역할 시프트 2시 증가하면서 간호 동작에서 보낸 시간의 양이 점차 감소한다. 따라서, 작업자가 그 독점적 수집하기 어렵다단지 행동 기준으로 간호 또는 꼴을 수행합니다. HPGs에 mrjp2Hbg3의 발현이 노동자의 역할과 연결되어 있는지 그 결과는 분명히 여기에 설명 된 프로토콜은 단일 코호트 식민지에서 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 (그림 3)에서 HPG 생리를 조사하기 위해 채택 될 수 있음을 나타냅니다. 노동자의 행동과 HPG 개발 모두에 따라 기준은 단일 코호트 식민지에서 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 정의에 적용 할 수 있습니다. HPGs 외에도 헤드 다른 외분비 땀샘 역할 시프트와 관련 생리적 변화를 겪는다. 예를 들어, 경보 페로몬 2- 헵 타논 (2)의 합성 브루 식품 지방산의 합성에서 하악 선 변경 기능. 여기에 설명 된 프로토콜에 따라서 HPGs 이외 외분비샘 역할 관련된 생리를 검사하도록 구성 될 수있다.

(n)의 성공적인 컬렉션식민지가 준비 될 때 단일 코호트 식민지에서 urse 꿀벌과 조숙 한 초지 새롭게 등장 노동자의 충분한 수의 모음에 따라 달라집니다. 새로 등장 근로자의 낮은 번호가 수집 될 경우, 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 충분히 수집하기 어렵다. 또한, 여왕의 조건은 성공적인 샘플 수집을위한 또 다른 중요한 포인트입니다. 큰 복부와 여왕이 여왕은 일반적으로 난소를 개발했기 때문에 산란을 위해 좋다. 따라서, 근로자의 노동은 무리가 지속적으로 여왕에 의해 공급되기 때문에 효과적으로 단일 코호트 식민지에서도 분할 될 것으로 생각된다. 아무런 무리가 제공되지 않는 경우, 단일 코호트 콜로니로부터 간호사 꿀벌 수집하기 어렵다. 초지 가끔 잘못된 식민지로 돌아가 있기 때문에 마지막으로, 포스터 페인트를 사용하여 근로자를 표시하는 근로자가 단일 코호트 식민지에서 수집되어 있는지 확인해야합니다. 효과적으로 조숙 한 초지를 수집하려면, 페인트 표시가 있어야한다가능한 한 많은 노동자 (단일 코호트 식민지 당 900 개 이상의 새롭게 등장 노동자)에 적용. 일반적으로 휘발성 유기 화합물을 함유하는 유성 잉크, 꿀벌의 화학 통신을 방해 할 수 있으므로 마킹 용 수성 잉크의 사용이 권장된다. 수성 잉크 자국은 실험 과정 동안 매우 퇴색되지 않았다.

호르몬 치료

우리는 또한 HPG 생리학 (mrjp2Hbg3 식)의 에크 디손의 효과를 조사하는 노동자의 머리에 20E를 주입하기위한 프로토콜을 설명했다. 곤충 식염수 20E 용액 용 용매 주입 꿀벌의 생존율 20E 주입 실험 (표 2에 채택 될 수있는 분사구 및 20E 용액 용 용매를 사용하여 프로토콜 주사 여기 기재된 것을 나타내는, 후속 분석을 위해 충분 ). 또한, HPGs 유전자 발현의 비교20E 처리 꿀벌과 제어 꿀벌 사이에 주입 된 20E는 mrjp2 및 HPG 기능에 관련된 둘 Hbg3 (그림 5)의 발현을 변화 것으로 나타났다. 이 결과는 여기에 설명 된 프로토콜 HPG 생리학 에크 디손의 효과를 조사하기위한 유용 할 것이며, 그러한 하악 분비와 헤드의 다른 외분비샘을 검사 채용 될 수 있음을 시사한다. 또한, 상기 주입 방법은 다른 화학 물질을 주입 채용 할 수있다. 예를 들어, 여기에 설명 된 프로토콜 유전자 녹다운 실험을 위해 머리에 이중 가닥 RNA 용액을 주입하기에 적합하다.

20E 외에, 우리는 JH 유사체 methoprene을 적용하기위한 프로토콜을 설명했다. Methoprene 보통 복부에 적용된다. 한편, methoprene 여기서, 작업자의 머리에 적용 하였다. 거의 methoprene 또는 아세톤의 국소 적용으로 모든 꿀벌 7 일 치료 후 생존상기 헤드 5 μL의 methoprene 아세톤 용액의 애플리케이션을 제시하는 작업자 생존율 (표 3)에 거의 영향을 미치지 않는다. 또한, methoprene- 및 아세톤 처리 꿀벌의 HPGs에 mrjp2Hbg3 식의 비교는 methoprene 응용 프로그램이 mrjp2 발현을 억제하고 Hbg3 식 (그림 6) 향상을 나타냅니다. 이러한 결과는 여기에 설명 된 프로토콜은 머리에서 HPGs 같은 외분비샘의 생리에 methoprene의 효과를 분석하기에 적합한 것이 좋습니다.

성공적인 호르몬 치료는 치료 꿀벌의 생존 속도에 따라 달라집니다. 냉장고에서 저온 노출은 꿀벌을 마취에 적합 할 수있다. 꿀벌이 낮은 생존율을 선도, 얼음에 젖어 있기 때문에 얼음에 마취는하지 않는 것이 좋습니다. 또한, 상기 주입 방법은 살아있는 꿀벌 유지하기위한 또 다른 중요한 점이 될 수있다. 그것은 m에 중요하다분사구 길고 얇은 주입하여 꿀벌의 손상을 최소화하기 위해 커터를 사용하여 날카로운 팁으로 형상 아케. methoprene에 대한 용매 아세톤에 부정적인 꿀벌의 생존 (표 4)에 영향을주기 때문에 그러나, 주입 방법은, HPG 생리학에 methoprene의 효과를 검사에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한, 여기에 설명 된 주입 방법은 사출 후 다시 도입 될 때 주입 꿀벌이 자신의 식민지에서 제외되는 바와 같이 식민지에서 행동 분석에 적합하지 않을 수 있습니다. 약간의 부상 근로자는 식민지에서 제외 될 수 있습니다. 이러한 호르몬의 응용 프로그램 또는 경구 투여와 같은 다른 방법은, 행동 분석에 적합 할 수있다.

단일 코호트 식민지는 작업자 꿀벌 10, 11의 노동 분업의 규제를 검사하는 데 사용되었습니다. 또한, 소아 호르몬 치료는 동작 뇌 방지 동작의 시험에 사용 된노동 (11)의 분할에 관련합니다. 그러나, 단일 코호트 식민지의 준비와 JH와 치료 모두에 대한 자세한 프로토콜은 이전과 같은 상세하게 제공되지 않았습니다. 최근 노동의 부문의 에크 디손의 중요성이 점차 인식되고있다, 두 JH에 의해 노동과 에크 디손의 부문의 규제는 23을 권장합니다. 단일 코호트 식민지와 JH 등의 호르몬 치료 및이 문서에서 설명하는 에크 디손의 성공적인 준비에 대한 자세한 프로토콜은 작업자 생리학의 연구 발전에 기여할 수 있습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
UNIPOSCA Mitsubishi pencil PC-5M Marker pen for the application of marks to bees  
20-hydroxyecdysone Sigma Aldrich H5142
Methoprene Sigma Aldrich 33375
Breeding case insect IRIS OHYAMA CP-SS
Electromotion mixier  ISO 23M-R25 homogenization of tissue
TRIZol Reagent Invitrogen 15596-026 the reagent for total RNA extraction
DNase I  Takara 2270A
PrimeScript RT reagent kit Takara RR037A the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II Takara RR820A the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument Roche 12011468001 the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl) Roche 4929292001 the material for real-time PCR

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References

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단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기
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Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).More

Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).

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