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Neuroscience

Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino

doi: 10.3791/54240 Published: September 6, 2016

Summary

Aqui nós descrevemos nosso protocolo detalhado para a preparação de colônias de abelhas-coorte único - uma ferramenta útil para analisar a fisiologia trabalhador associada à função. Descrevemos também protocolos detalhados para o tratamento de trabalhadores com hormônio juvenil e ecdisona para avaliar o envolvimento desses hormônios na regulação do comportamento do trabalhador e / ou fisiologia.

Introduction

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A abelha europeia, Apis mellifera, é um inseto eusocial com uma sociedade altamente organizada 1. Abelhas operárias (casta de trabalho) estão envolvidos em várias tarefas para manter a atividade colônia, e estas tarefas mudar de acordo com a idade da abelha trabalhador após a eclosão, o que é referido como a divisão relacionada com a idade do trabalho 2-4. Os trabalhadores jovens (<13 dias de idade) cuidar da ninhada na colmeia através da secreção de geléia real (abelhas enfermeira), enquanto os trabalhadores mais velhos (> 15 dias de idade) recolhem o néctar e pólen fora da colméia (forrageiras) 2-4. A fisiologia dos trabalhadores muda em associação com esta mudança de papel. Por exemplo, a função das glândulas hipofaringe (HPGS), emparelhado glândulas exócrinas localizadas na cabeça, alterações em associação com a mudança de papel a partir de enfermagem para forrageamento 2,5. HPGS enfermeira abelha sintetizar principalmente principais proteínas da geléia real, que são os principais componentes do leite de abelha. Por outro lado, HPGS de forrageiras, principalmente,sintetizar enzimas metabolizadoras de hidratos de carbono, tais como α-glucosidase III, para processar néctar em mel através da conversão de sacarose em glicose e frutose. Os nossos estudos anteriores revelaram que a expressão de mrjp2, que codifica uma proteína principal da geleia real, e Hbg3, que codifica α-glucosidase III, alterações durante o deslocamento papel 6-9.

Para determinar se as alterações fisiológicas dos tecidos de trabalho, incluindo as HPGS, está associada com a mudança de papel ou com a idade dos trabalhadores, seria útil para manipular a composição da população de uma colónia de abelhas, tal como para preparar uma única coorte colónias em que os trabalhadores de quase a mesma idade executar diferentes tarefas 10,11. Robinson et al. (1989) descreveram um método para o estabelecimento de uma colónia única de 10-coorte. colónias-coorte único compreendem inicialmente uma rainha e 0-2 dia os trabalhadores de idade. Vários dias depois de estabelecer as colônias, os trabalhadores de almost a mesma idade assumir diferentes tarefas. Alguns trabalhadores executar tarefas de enfermagem como em colónias típicas, enquanto outros trabalhadores executar tarefas de forrageamento mais cedo do que o habitual e são assim chamados forrageiras precoces. Comparações de expressão genética entre as abelhas de enfermagem e forrageiras precoces iria fornecer informações úteis sobre a fisiologia associada ao papel dos tecidos trabalhador 12-16. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de colónias-coorte único para análise da fisiologia de papéis e / ou associada à idade de HPGS 16. Também descrevemos brevemente como analisar a expressão gênica de mrjp2 e Hbg3 por quantitativa reação em cadeia de polimerase reversa (RT-PCR) para avaliar HPG fisiologia.

Para além da análise de fisiologia trabalhador em colónias-coorte único, o exame do sistema endócrino é importante para analisar os mecanismos de regulação da fisiologia associada trabalhador-papel. hormônio juvenil (JH), que é known como o hormônio 'status quo' em larvas de insetos, acelera a mudança no papel da enfermagem para forrageamento de abelhas operárias 11. Além disso, de ecdisona, que é conhecida como a hormona de muda durante a metamorfose, podem estar envolvidos na mudança de papel como genes que codificam para moléculas de sinalização de ecdisona são expressas nos corpos de cogumelo, um centro superior do cérebro trabalhador 17-19. Por isso, também descrevem o protocolo detalhado utilizado no nosso estudo anterior 16 para tratar os trabalhadores com 20E, que é uma forma activa de ecdisona, e metopreno, um análogo de JH, para análise do efeito do sistema endócrino em HPG fisiologia (expressão de mrjp2 e Hbg3).

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Protocol

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1. Preparação de colónias-coorte Individual

  1. Prepare três colônias de abelhas para criar duas colónias-coorte único e obter um número suficiente de trabalhadores recém-emergidas.
    1. Verifique se algum pupas nas células periféricas tampadas nos favos, tem olhos castanhos e uma cutícula pigmentada abrindo os pentes tampado com uma pinça. Se existem essas pupas em células pente periféricos, a maioria das pupas em todo o pentes vão surgir em cerca de 1-3 dias.
    2. Posteriormente, recolher os favos que contenham esses pupas depois de todas as abelhas adultas aderentes foram removidas com uma escova, e misture pentes das três colónias para minimizar a variabilidade entre as colônias.
  2. Coloque os pentes recolhidos em uma caixa colmeia vazia e incubar a 33 ° C sob condições de umidade (> 60% de umidade relativa). Recolher cerca de 6.000 trabalhadores recém-emergidas durante 3 dias (3.000 trabalhadores por colónia) dos pentes recolhidos.
  3. Determinar a quantidade de workers com base no peso de cinco trabalhadores recém-emergidas coletadas aleatoriamente a partir de colónias não manipuladas.
    1. Pesar cinco trabalhadores recém-emergidas recolhidos aleatoriamente a partir de colónias não manipuladas utilização de máquinas de pesagem.
      Nota: O peso de cinco trabalhadores recém-emergidas é geralmente 500-600 mg.
    2. Estimar a quantidade de trabalhadores recolhidos pela divisão do peso dos trabalhadores recolhidos pelo peso médio de cinco trabalhadores recém-emergidas.
  4. Aplicar marcas de tinta para as thoraces de cerca de 1.800 trabalhadores (900 trabalhadores por colônia), utilizando marcadores de tinta à base de água poster.
    Nota: marcador lavável, que é usada para aplicar a tinta está listada na tabela de materiais.
  5. Introduzir uma rainha e aproximadamente 3.000 dos trabalhadores 0-2 dias de idade para uma nova caixa de colmeia que contém dois pentes, um pente contendo mel e pólen como conservas e outro pente vazio para postura de ovos pela rainha. Recolher o pente contendo mel e pólen from outra colônia unmanipulated depois de todas as abelhas aderentes são removidas.
    Nota: O uso da caixa de ramificação nuclear (caixa pequena colmeia tamanho) é recomendado.
  6. Recolher as abelhas de enfermagem e forrageiras precoces com marcas de tinta de 6 a 8 dias após a criação de colónias-coorte único.
    1. Para a coleta de abelhas enfermeira, pegar os trabalhadores que colocam suas cabeças em células pente para cuidar da prole. Use uma pinça para recolher as abelhas enfermeira de pentes que contêm muitos trabalhadores de cria e adultos.
      Nota: Se HPGS de trabalhadores recolhidos são desenvolvidas quando dissecado tal como descrito na etapa 1.7, estes trabalhadores são definidos como abelhas enfermeira. Segurando as thoraces por pinças é recomendado para pegar os trabalhadores dos favos.
    2. Para a coleta de forrageiras, utilize uma rede de insetos para capturar os trabalhadores que retornam para suas colméias com cargas de pólen em suas pernas traseiras.
      Nota: Se HPGS dos trabalhadores capturados aparecem quando encolhido dissecado tal como descrito no passo 1.7, os trabalhadores são definidos como forrageiras.
  7. clasSIFY o HPG em três grupos, "desenvolvidos", "intermediário" e "encolhida" pela dissecção sob microscópio estereoscópico.
    1. Anestesiar 10-15 abelhas em uma gaiola de inseto em uma geladeira por 10-15 minutos até que as abelhas não podem voar ou a pé. Em seguida, mover-se sobre gelo e abelhas completar a anestesia em gelo durante 5 min.
      Nota: Demora cerca de total de 15-20 minutos para alcançar a anestesia. Se o tempo de anestesia deve ser reduzido, o número de abelhas em uma gaiola deve ser reduzida para 1-3 por gaiola abelhas.
    2. Dissecar a cabeça do corpo com tesouras e pinças. Fixar a cabeça em cera dental colocado em uma placa de Petri com alfinetes. Inserir dois pinos para as bases das antenas para fixar a cabeça. Soak cabeças fixas em solução salina de insectos (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM CaCl2).
    3. Remover o aspecto anterior da cutícula da cabeça utilizando uma pinça fina e uma faca cirúrgica sob um microscópio binocular.
      Nota: Os HPGS podem ser facilmente encontrados na cabeça após a remoção de Cuticle. A HPG é um órgão botrióide que existe em torno do cérebro na cabeça.
    4. Remover o tecido traqueal, que é um tecido membranoso branco sob a cutícula. Então, dissecar os HPGS da cabeça, puxando-os lentamente com uma pinça.
    5. Classificar HPGS com ácinos grande e circular como "desenvolvido". Classificar HPGS com pequena e distorcida ácinos como 'encolhido'. Classificar HPGS correspondente a nenhum "desenvolvido" nem "encolhida" como "intermediário".
      Nota: Fotografias representativas que mostram estas três classes de estados HPG são indicados na Figura 2.
    6. Assunto "desenvolvido" e HPGS 'Shrunken' para extração de RNA como 'enfermeira abelha HPGS' e 'HPGS de forrageiras ", respectivamente, e comparar a expressão do gene nos HPGS entre abelhas de enfermagem e forrageiras (Seção 4).

2. Injecção de 20E

  1. Recolha abelhas enfermeira de colónias típicas como described no procedimento 1.6.1.
    Nota: HPGS não pode ser examinada nessas abelhas como as abelhas serão criados.
  2. Anestesiar as abelhas a 4 ° C num frigorífico (não em gelo).
    Nota: Demora cerca de 30 min para conseguir anestesia. Se o tempo de anestesia é reduzido, o número de abelhas na gaiola deve ser reduzida para 1-3 abelhas por gaiola.
  3. Com uma pinça, imobilizar as abelhas em cera dental colocados em uma placa de Petri.
  4. Injectar 1 ul de uma solução 20E no aspecto anterior da cabeça utilizando uma ponta de injecção feita a partir de uma micropipeta capilar calibrado usando um extractor de agulha de vidro.
    1. Dissolve-se em solução salina de etanol 20E-inseto (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 1 mM) mistura (1: 4) a 2,5 ug / ul.
    2. Ligue a ponta de injecção para um tubo de borracha, e ligar uma ponta de micropipeta de amarelo para o lado oposto do tubo.
    3. Coloque 1 ml de solução 20E em parafilme utilizando uma micropipeta, segure a ponta da micropipeta amarelo na boca, umd desenhar a solução para a ponta de injecção.
    4. Inserir a ponta de injecção para a base da antena, e injectar a solução por sopro através da ponta da micropipeta amarelo.
      Nota: O protocolo mostrado neste passo é o método de injecção representativo, mas o uso da máquina de injecção automatizado é recomendado para a segurança como necessário 20.
  5. Traseira as abelhas injetados em gaiolas de insetos em 33-36 ° C (a temperatura ideal é de 35 ° C) em condições escuras e úmidas (> 60% de umidade relativa) durante 1 ou 3 dias. Fornecimento mistura mel-água (1: 1) para as abelhas. Se necessário, a contagem de sobreviventes abelhas após a injecção.

3. Aplicação de Methoprene

  1. Recolher os favos que contêm pupas de colónias típicas depois de todas as abelhas adultas aderentes são removidas com uma escova. Incubar os pentes de 33-36 ° C (a temperatura ideal é de 35 ° C) em condições húmidas (> 60% de humidade relativa) durante 1 dia.
  2. Após 6 dias, recolher trabalhadores pintadas (6 dias de idade) a partir das colónias. Pegar trabalhadores pintadas dos pentes, mantendo suas thoraces com uma pinça.
  3. Anestesiar as abelhas a 4 ° C num frigorífico (não em gelo) como no procedimento 2.2. Usando pinças, imobilizar as abelhas em cera dental colocados numa placa de Petri e aplicar 1-5 uL de uma solução de metopreno (50-250 mg / mL) dissolvido em acetona para as suas cabeças utilizando uma micropipeta. Utilizar uma ponta de filtro que é resistente à acetona.
    Nota: Acetona pode ter efeitos nocivos sobre as abelhas, levando à morte. Se é observada a uma elevada mortalidade de abelhas, a redução do volume de acetona para 1 ml no mínimo é recomendado.
  4. Traseira as abelhas em gaiolas de insetos em 33-36 ° C (o ideal temperature é de 35 ° C) durante 7 dias sob condições escuros e úmidos (> 60% de umidade relativa). Fornecimento mistura mel-água (1: 1) para as abelhas. Se necessário, a contagem de sobreviventes abelhas após a aplicação tópica.
    Nota: Neste artigo, abelhas sobreviventes são contadas 7 dias após a aplicação (Tabela 3).

4. Extracção de ARN e RT-PCR quantitativo

  1. Anestesiar abelhas e dissecar HPGS como descrito nos passos 1.7.1 a 1.7.4.
  2. Recolher os HPGS dissecados em um tubo de microcentrifugadora em gelo seco e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
  3. Adicionar 400 ul de reagente para a desnaturação da proteína.
    Nota: Este reagente está comercialmente disponível (ver a tabela de materiais).
  4. Homogeneizar os tecidos HPG usando uma mão batedeira com um pilão de homogeneização que se encaixa dentro de um tubo de microcentrífuga. Homogeneizar a uma velocidade de rotação de aproximadamente 300 rpm durante 1 min em gelo para quebrar e lisam células de tecido.
    Tabela de Materiais).
  5. Adicionar 80 ul de clorofórmio e misture bem. Incubar durante 5 min à TA.
  6. Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 14170 xg durante 15 min a 4 ° C. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Adicionar um volume igual de isopropanol e 1 ul de glicogénio (5 mg / ml). Incubar a -20 ° C durante pelo menos 20 min.
  7. Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 14170 xg durante 10 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
  8. Adicionar 400 ul de etanol a 75% ao sedimento e misturar bem, centrifugar os tubos de microcentrífuga a 14170 xg durante 15 min a 4 ° C, e remover o sobrenadante. Repita estes procedimentos mais uma vez.
  9. Ar seco o sedimento durante 5-10 min e depois dissolvê-lo em 10 de água livre de RNase mL.
    Nota: a secagem completa do pelete pode causar insolubilização do sedimento de ARN em água. Assim, o sedimento que é ligeiramente molhado é apropriado paradissolução.
  10. Medir a concentração de RNA usando um espectrofotómetro, tal como NanoDrop ou semelhante.
  11. Tratar 500 ng de ARN total com 2,0 U de ADNase I por incubação a 37 ° C durante 30 minutos para degradar qualquer ADN genómico contaminante.
  12. Reverse-transcrever 200 ng de ARN tratado com ADNase I e realizar PCR em tempo real utilizando kits disponíveis comercialmente (ver a lista na Tabela de Reagentes e Materiais) e iniciadores específicos do gene (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', e 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'e 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Executar a PCR como se segue: [95 ° C x 30 seg + (95 ° C x 5 segundos + 60 ° C x 15 seg + 72 ° C x 20 seg) x 45-55 ciclos].
  13. Normalizar a quantidade de transcrição com o do factor de elongação 1α-F2 (EF1α˗F2) ou ribosomal da proteína 49 (rp49) 9,16,21,22. Estes genes são o controle confiável genos para analisar a expressão do gene nas HPGS utilizando qRT-PCR.
  14. Execute bicaudal t-teste para detectar as diferenças significativas entre dois grupos experimentais (abelhas enfermeira vs. forrageiras precoces, abelhas tratadas-20E contra as abelhas de controle, e as abelhas tratadas com methoprene vs. abelhas controle) usando o software estatístico.
    Nota: Se o teste F assume a homogeneidade da variância, teste t de Student pode ser usado. Se não, o teste t de Welch pode ser usado.

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Representative Results

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Uma visão geral do protocolo para a preparação de colónias-coorte único é ilustrado na Figura 1A. Tempo-decorrer de experiências de preparação de colónias-coorte único da recolha da amostra é mostrado na Figura 1B. Trabalhadores que satisfizeram os critérios comportamentais para o comportamento de enfermagem ou de comportamento de forrageamento foram coletados a partir de colónias-coorte único, e desenvolvimento HPG foi estimado nesses trabalhadores Tabela 1 mostra a classificação do desenvolvimento HPG em três grupos.; "Desenvolvido", "Intermediário" e "encolhida" de acordo com o tamanho. Fotografias representativas que mostram estas três classes de HPGS são indicados na Figura 2. Os resultados indicam que ambas as abelhas de enfermagem e forrageiras precoces, de acordo com os critérios descritos no protocolo, foram também observadas nas colônias-coorte único. Expressão de mrjp2 e Hbg3 nas HPGS foi enriched em abelhas de enfermagem e forrageiras precoces, respectivamente, indicando que a função GPS está associado com o papel do trabalhador (Figura 3) 16.

O procedimento para injectar 20E em cabeças de trabalho é ilustrada na Figura 4. Abelhas sobreviventes foram contadas 1, 5 e 7 dias após a injecção para examinar a sobrevivência taxa de abelhas injetados com solução salina de inseto ou solvente para solução 20E antes do experimento 20E. Aos 7 dias após a injecção, cerca de 60-80% de abelhas foram injectados vivo, e taxa de sobrevivência das abelhas injectados com solvente para a solução 20E foi comparável à que, com solução salina inseto (Tabela 2). O efeito da injecção 20E expressão diminuída de ambos mrjp2 e Hgb3 nas HPGS (Figura 5) 16. Além 20E, o efeito da aplicação tópica de metopreno no mrjp2 e Hbg3 (Tabela 3). Por outro lado, apenas cerca de 20% a 30% de abelhas injectados com acetona / solução salina de abelha (1: 4) solução sobreviveram 7 dias após a injecção, quando as abelhas sobreviventes foram contadas 1, 3, 5 e 7 dias após a injecção (Tabela 4) . Assim, foi adoptado o método de aplicação para o tratamento methoprene. Aplicação de metopreno inibiu a expressão de mrjp2 e aumentou a expressão de Hbg3 (Figura 6) 16.

figura 1
Figura 1. Visão Geral do-coorte único experimento colônia. (A) Esquema para a preparação de colónias-coorte único. (B) Time-curso do experimento de Preparing colónias-coorte único para coleta de abelhas de enfermagem e forrageiras precoce. seta horizontal indica o curso da vida de um trabalhador nas colónias-coorte único. Os números com linhas verticais indicam a idade do trabalhador. Não só forrageiras precoces, mas também as abelhas enfermeira overaged (28-32 dias de idade) são relatados para ser encontrado em colônias-coorte único 15. Assim, a comparação da fisiologia entre abelhas enfermeira overaged e forrageiras pode ser realizado em colónias-coorte único, embora isso não foi feito neste estudo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Fotografias mostrando as três classes de estados HPG. Desenvolvido (A), Intermediário (B), e encolhida (C Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. expressão de mrjp2 e Hbg3 nas HPGS de trabalhadores de colónias-coorte única associada à função. O gráfico mostra uma comparação dos níveis de mRNA de mrjp2 (A) e Hbg3 (B) nos HPGS entre abelhas enfermeira (N) e forrageiras precoces (PF) de dois co-coorte únicalonies. O nível de ARNm de cada gene foi normalizado com o da proteína ribossómica 49 (rp49). O nível de ARNm relativa de cada gene no HPGS abelha enfermeira foi definido como 1. O nível de ARNm de mrjp2 em alguns forrageiras precoces não pôde ser quantificada porque de intensidades de sinal mais baixas do que o limiar de detecção. Portanto, o número de amostras difere entre os genes. Os níveis de ARNm relativos são indicados com o erro padrão. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as abelhas enfermeira e forrageiras precoces (*, p <0,05; teste-t). Esta figura foi reproduzida de Ueno et al., (2015) 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Esquema do protocolo para INJEC 20Eção. Procedimentos 2.3 e 2.4 na seção de protocolo são ilustrados nesta figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Efeito da injecção 20E em mrjp2 e expressão Hbg3 na HPGS 16. O gráfico mostra uma comparação dos níveis de mRNA de mrjp2 (A) e Hbg3 (B) nos HPGS entre abelhas tratados 20E (20E +) e abelhas controle (20E-). Números abaixo do gráfico indicam o dia após o tratamento 20E. O nível de ARNm de cada gene foi normalizado com o do factor de elongação 1α-F2 (EF1α-F2). nível de ARNm de Relativacada gene no HPGS abelha de controlo foi definido como 1. Os níveis de ARNm relativos são indicadas com um erro padrão. Um asterisco indica uma diferença significativa entre as abelhas tratadas-20E e abelhas de controlo (*, p <0,05; teste-t). Esta figura foi reproduzida de Ueno et al., (2015) 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Efeito da aplicação de metopreno no mrjp2 e expressão Hbg3 nas HPGS 16. O gráfico mostra a comparação dos níveis de mRNA de mrjp2 (A) e Hbg3 (B) nos HPGS entre abelhas tratadas com methoprene e abelhas controle. onível de ARNm de cada gene foi normalizado com o de EF1α-F2. nível de ARNm relativa de cada gene no HPGS abelha de controlo foi definido como 1. Os níveis de ARNm relativos são indicados com o erro padrão. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as abelhas tratadas-methoprene abelhas e de controlo (*, p <0,05; teste-t). Esta figura foi reproduzida de Ueno et al., (2015) 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Colony No. comportamento observado Número de indivíduos em cada classe HPG
Desenvolvido Intermediário Encolhido Total
1 Enfermagem 8 1 1 10
forrageamento 0 4 7 11
2 Enfermagem 4 2 0 6
forrageamento 0 0 5 5

Tabela 1: Classificação de HPGS de trabalhadores cuja enfermagem ou forrageamento comportamento foi observado em colônias-coorte único. tamanho HPG em trabalhadores de duas colónias-coorte único (nos colônia 1 e 2.) foram agrupados em três classes; "Desenvolvido", "Intermediário" e "encolhida" por tamanho.

Dias após injecção Sem a injeção salina inseto Solvente para soln 20E
ensaio 1 Day0 15/15 15/15 14/15
Dia 1 15/15 14/15 13/15
day5 14/15 13/15 11/15
day7 14/15 12/15 9/15
ensaio 2 Day0 15/15 15/15 15/15
Dia 1 15/15 13/15 15/15
day5 15/15 11/15 12/15
day7 14/15 10/15 12/15

Tabela 2: Taxa de sobrevivência de abelhas injetados com solvente para 20E solução. Quinze trabalhadores foram preparadas em cada grupo experimental.

Dias após a aplicação Acetona methoprene
ensaio 1 dia 0 7/7 8/8
dia 7 7/7 6/8
ensaio 2 dia 0 7/7 8/8
dia 7 7/7 8/8

Tabela 3: A taxa de sobrevivência de abelhas tratadas com metopreno Sete a oito trabalhadores foram preparadas em cada grupo experimental..

Dias após injecção Sem a injeção Acetona / solução salina Bee (1: 4)
dia 0 15/15 15/15
Dia 1 15/15 6/15
dia 3 15/15 5/15
dia 5 15/15 4/15
dia 7 15/15 4/15

Tabela 4: Taxa de sobrevivência de abelhas injectados com solução salina acetona / abelha (1: 4). Quinze trabalhadores solução foram preparadas para cada grupo experimental. salina acetona / abelha (1: 4) solução foi injectado no abdómen trabalhador. A composição da solução salina de abelha é NaCl 130 mM, KCl 6 mM, 4 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 160 mM de sacarose, glicose 25 mM e HEPES 10 mM (pH 7,0).

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Discussion

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Preparação de colónias-coorte única

Aqui descrevemos o protocolo utilizado em nosso estudo anterior 16 para preparar colónias-coorte único para análise da HPG fisiologia associada com a mudança no papel das abelhas operárias. Abelhas de enfermagem e forrageiras precoces que satisfizeram os critérios descritos nos procedimentos de 1,6-1,7 e Figura 2 foram observadas nas colônias-coorte único (Tabela 1). As fotografias da Figura 2 seria útil na classificação de HPG indica como referência. Critérios baseados em tanto o comportamento do trabalhador e desenvolvimento HPG são válidos para a definição de abelhas enfermeira ou forrageiras em colônias típicas. Mudança de papel a partir de enfermagem para forrageamento gradualmente prossegue naquelas colónias: a quantidade de tempo gasto no comportamento de enfermagem declina gradualmente, enquanto que, no comportamento de forrageamento aumenta gradualmente durante o turno papel 2. Deste modo, seria difícil para recolher os trabalhadores que exclusivamenterealizar a amamentação ou forrageamento apenas por critérios comportamentais. O resultado que a expressão de mrjp2 e Hbg3 nas HPGS está associada com o papel dos trabalhadores indica claramente que o protocolo aqui descrito pode ser adoptada para examinar fisiologia HPG em abelhas de enfermagem e forrageiras precoces de colónias-coorte única (Figura 3). Critérios baseados em tanto o comportamento do trabalhador e desenvolvimento HPG também poderia ser aplicável na definição de abelhas de enfermagem e forrageiras precoces de colónias-coorte único. Além dos HPGS, outras glândulas exócrinas na cabeça sofrem alterações fisiológicas em associação com a mudança de papel. Por exemplo, a função dos mandibulares alterações da glândula da síntese dos ácidos gordos para a alimentação de ninhada para a síntese de alarme feromona 2-heptanona 2. O protocolo aqui descrito pode, assim, ser adaptados para examinar a fisiologia associada a função de outras do que as HPGS glândulas exócrinas.

recolha bem sucedida de nabelhas URSE e forrageiras precoces de colónias-coorte único depende da recolha de um número suficiente de trabalhadores recém-emergidas quando as colônias são preparados. Se um baixo número de trabalhadores recém-emergidas é recolhido, seria difícil até conseguir o suficiente abelhas de enfermagem e forrageiras precoces. Além disso, a condição das rainhas é outro ponto chave para a coleta de amostras de sucesso. Queens com uma grande abdómen são bons para a postura dos ovos porque estes rainhas geralmente têm desenvolvido ovários. Assim, o trabalho dos trabalhadores é pensado para ser efetivamente dividido, mesmo em colônias-coorte único porque a ninhada está constantemente fornecido pela rainha. Se nenhuma ninhada é fornecido, seria difícil recolher as abelhas enfermeira das colónias-coorte único. Finalmente, marcando os trabalhadores que utilizam pintura poster é necessário para garantir que os trabalhadores são recolhidas a partir de colónias-coorte único, porque forrageiras, ocasionalmente, voltar para a colônia errado. Para a coleta de forrageiras precoces de forma eficaz, marcas de tinta deve seraplicado como número possível de trabalhadores (mais de 900 trabalhadores recém-emergidas por colónia-coorte único). A utilização de uma tinta à base de água para a marcação pode ser recomendado, porque uma tinta à base de óleo, o qual geralmente contém compostos orgânicos voláteis, pode interromper a comunicação química entre as abelhas. As marcas de tinta à base de água não desaparecer muito durante o decurso da experiência.

O tratamento hormonal

Também descreveu o protocolo para injetar 20E na cabeça dos trabalhadores para examinar o efeito de ecdisona em HPG fisiologia (mrjp2 e expressão Hbg3). A taxa de sobrevivência de abelhas injectados com solução salina de insecto ou o solvente para 20E solução foi suficiente para a análise subsequente, indicando que o protocolo aqui descrito para injecção utilizando uma ponta de injecção e solvente para 20E solução pode ser adoptada para o experimento injecção 20E (Tabela 2 ). Além disso, a comparação da expressão de genes nas HPGSentre as abelhas tratadas-20E e abelhas de controlo indicaram que a 20E injectado alterou a expressão de mrjp2 e Hbg3, ambos os quais estão relacionados com a função de GPS (Figura 5). Este resultado sugere que o protocolo descrito aqui seriam úteis para examinar os efeitos de ecdisona sobre a fisiologia HPG, e pode ser adoptada pela análise de outras glândulas exócrinas na cabeça, tais como as glândulas mandibulares. Além disso, o método de injecção podem ser adoptadas para a injecção de outros produtos químicos. Por exemplo, o protocolo descrito aqui seria adequado para a injecção de soluções de ARN de cadeia dupla para as cabeças para as experiências silenciamento de genes.

Além 20E, foi descrito um protocolo para a aplicação de metopreno, que é um análogo de JH. Methoprene é geralmente aplicado no abdómen. Por outro lado, metopreno foi aplicada à cabeça de trabalhadores, aqui. Quase todas as abelhas com aplicação tópica de metopreno ou acetona sobreviveram 7 dias após o tratamento, Sugerindo que a aplicação de 5 uL de metopreno ou solução de acetona, para as cabeças tem pouco efeito sobre a taxa de sobrevivência do trabalhador (Tabela 3). Além disso, a comparação da expressão e mrjp2 Hbg3 nas HPGS entre methoprene- e as abelhas tratadas com acetona, indica que a aplicação metopreno inibe a expressão mrjp2 e aumenta a expressão Hbg3 (Figura 6). Estes resultados sugerem que o protocolo aqui descrito é adequado para analisar os efeitos de metopreno sobre a fisiologia das glândulas exócrinas, tais como os HPGS na cabeça.

tratamento hormonal bem sucedida depende da taxa de sobrevivência das abelhas tratadas. exposição a baixa temperatura num refrigerador pode ser apropriado para anestesiar abelhas. Anestesia em gelo não é recomendado porque as abelhas se molhar no gelo, levando a uma baixa taxa de sobrevivência. Além disso, o método de injeção poderia ser outro ponto-chave para manter as abelhas vivo. É importante make a ponta de injecção longa e fina, e a dar-lhe forma de uma ponta afiada utilizando o cortador para minimizar os danos para as abelhas por injecção. No entanto, o método de injecção pode não ser apropriado para examinar os efeitos de metopreno no HPG fisiologia, porque o solvente para acetona metopreno afecta negativamente a sobrevivência de abelha (Tabela 4). Além disso, o método de injeção descrito aqui pode não ser apropriado para análise comportamental em colônias como as abelhas injetados seriam excluídos de suas colônias quando são re-introduzida após a injeção. Trabalhadores com ferimentos leves pode ser excluída das colónias. Outros métodos, tais como a aplicação ou administração oral da hormona pode ser apropriado para a avaliação comportamental.

A colônia-coorte único foi usado para examinar a regulação da divisão do trabalho das abelhas operárias 10,11. Além disso, o tratamento com hormônio juvenil tem sido utilizado para a análise de comportamento e no cérebro function relacionada com a divisão do trabalho 11. No entanto, protocolos detalhados para tanto a preparação das colónias-coorte único eo tratamento com JH não tenha sido previamente fornecidos em tal detalhe. Recentemente, a importância de ecdisona na divisão do trabalho estão se tornando cada vez mais reconhecida, e a regulação da divisão do trabalho por ambos JH e ecdisona é sugerida 23. Os protocolos detalhados para a preparação bem-sucedida de colónias-coorte única e tratamento hormonal, como JH e ecdisona descrito neste artigo pode contribuir para o avanço no estudo da fisiologia do trabalhador.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
UNIPOSCA Mitsubishi pencil PC-5M Marker pen for the application of marks to bees  
20-hydroxyecdysone Sigma Aldrich H5142
Methoprene Sigma Aldrich 33375
Breeding case insect IRIS OHYAMA CP-SS
Electromotion mixier  ISO 23M-R25 homogenization of tissue
TRIZol Reagent Invitrogen 15596-026 the reagent for total RNA extraction
DNase I  Takara 2270A
PrimeScript RT reagent kit Takara RR037A the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II Takara RR820A the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument Roche 12011468001 the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl) Roche 4929292001 the material for real-time PCR

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References

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Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino
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Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).More

Ueno, T., Kawasaki, K., Kubo, T. Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System. J. Vis. Exp. (115), e54240, doi:10.3791/54240 (2016).

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