Summary
Здесь мы опишем наш подробный протокол для подготовки одной когорты пчелиных семей - полезный инструмент для анализа роли ассоциированного работник физиологии. Мы также описали подробные протоколы для лечения работников с ювенильным гормоном и экдизона оценить участие этих гормонов в регуляции поведения работников и / или физиологии.
Introduction
Европейская медоносной пчелы, Apis MELLIFERA, является eusocial насекомое с высокоорганизованной общества 1. Работник медоносные (труд кастовые) занимаются различными задачами для поддержания деятельности колонии, и эти задачи меняются в зависимости от возраста трудящегося Пчелы после вылупления, который упоминается как связанных с возрастом разделения труда 2-4. Молодые рабочие (<13 дней) заботиться о выводка в улье секретируя маточное молочко (медсестра пчел), в то время как пожилые работники (> 15 дней) собирают нектар и пыльцу за пределами улья (фуражиров) 2-4. Физиология рабочих меняется в связи с этой ролью сдвига. Например, функция гипофарингеальных желез (HPGs), парные экзокринных желез , расположенных в голове, изменения в связи с переходом от роли медсестер к нагула 2,5. Медсестра пчелы HPGs в основном синтезировать основные маточное молочко белки, которые являются основными компонентами пчелиного молока. С другой стороны, фуражиры HPGs в основномсинтезировать углеводные метаболизировать ферменты, такие как альфа-глюкозидазы III, обрабатывать нектара в мед путем превращения сахарозы в глюкозу и фруктозу. Наши предыдущие исследования показали , что экспрессия mrjp2, который кодирует основную протеинами маточного молочка и Hbg3, которая кодирует альфа-глюкозидазы III, изменения во время роль сдвига 6-9.
Для того, чтобы определить, являются ли физиологические изменения в тканях рабочих, в том числе HPGs, связано с ролью сдвига или с возрастом рабочих, было бы полезно, чтобы манипулировать состав популяции медоносных пчел колонии, например, подготовить одинарной когорту колонии , в которых работники почти того же возраста выполняют разные задачи 10,11. Робинсон и др. (1989) описали метод создания одной когорты колонии 10. Single-когорты колонии изначально содержат ферзя и 0-2 суточных рабочих. Через несколько дней после установления колоний, работники УАПОСТ же возраста принимать различные задачи. Некоторые работники выполняют задачи медсестер, как в типичных колоний, в то время как другие работники выполняют фуражировать задачи раньше, чем обычно, и, таким образом, называется скороспелых фуражиров. Экспрессии генов сравнения между медсестрой пчел и скороспелых фуражиров бы дать полезную информацию о роли ассоциированных физиологии рабочих тканей 12-16. Здесь мы описываем подробный протокол для подготовки одной когорты колоний для анализа и ролевой / или возрастной физиологии из HPGs 16. Мы также кратко описать , как исследовать экспрессию генов mrjp2 и Hbg3 с помощью количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для оценки HPG физиологии.
В дополнение к анализу рабочего физиологии в одной когорты колоний, исследование эндокринной системы имеет важное значение для анализа регуляторных механизмов роли ассоциированного работника физиологии. Ювенильного гормона (JH), который KNOшп как гормон "статус - кво" у личинок насекомых, ускоряет сдвиг в роли от медсестер к нагула в рабочих медоносных 11. Кроме того, экдизол, который известен как линьки гормона во время метаморфоза, могут быть вовлечены в ролевой сдвиг в качестве генов , кодирующих экдизол сигнальных молекул экспрессируются в грибовидных телах, более высокий центр работника головного мозга 17-19. Таким образом, мы также описываем подробный протокол , используемый в нашем предыдущем исследовании 16 для лечения работников с 20E, который является активной формой экдизон и метопрен, а JH аналог, для анализа влияния эндокринной системы на HPG физиологии (выражение mrjp2 и Hbg3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение Single-когорты Колонии
- Подготовьте три пчелиных семей для создания двух когорт одной колонии и получить достаточное количество вновь появившихся работников.
- Убедитесь, что некоторые куколки в удаляемого периферических клеток в сотах имеют карие глаза и пигментированного кутикулу, открыв блокированы расчески с помощью пинцета. Если эти куколки существуют в клетках периферической гребенки, большинство из куколок в целых сотах появится приблизительно через 1-3 дней.
- Затем собирают гребни, содержащие эти куколки после того, как все прилипшие взрослые пчелы были удалены с помощью кисти, и смешать гребни из трех колоний, чтобы минимизировать изменчивость среди колоний.
- Поместите собранные гребенки в пустом улье поле и инкубировать при температуре 33 ° С в условиях повышенной влажности (> 60% относительной влажности). Сбор около 6000 новых рабочих появившихся в течение 3-х дней (3000 рабочих в колонии) из собранных сотов.
- Определить количество ВоркеRS, основанные на весе пять вновь появившихся работников случайным образом собирали из unmanipulated колоний.
- Взвесьте пять вновь появившихся рабочих случайно собранных из unmanipulated колоний с использованием взвешивающих устройств.
Примечание: вес пяти вновь появившихся работников, как правило, 500-600 мг. - Оценки количества собранных рабочих путем деления массы собранных работников в среднем весе пять вновь появившихся работников.
- Взвесьте пять вновь появившихся рабочих случайно собранных из unmanipulated колоний с использованием взвешивающих устройств.
- Нанесите краску марки на thoraces около 1,800 рабочих (900 рабочих в колонии) с использованием маркеров плаката краски на водной основе.
Примечание: моющийся маркер , который используется для нанесения краски перечислен в таблице материалов. - Представьте королеву и приблизительно 3000 из 0-2-дневных рабочих на новый улей ящик, который содержит два расчески, один гребень, содержащий меда и пыльцы, как консервированных продуктов, а другой пустой расческа для откладки яиц королевой. Соберите гребень, содержащий мед и пыльца фром другой unmanipulated колонии после всех прилипших пчел удалены.
Примечание: Использование улья коробки ядерного (небольшие размеры улья коробки) рекомендуется. - Собирают медсестра пчел и скороспелых фуражиров с краской марок от 6 до 8 дней после создания одной когорты колоний.
- Для сбора медсестра пчел, подобрать работников, которые ставят свои головы в гребень клетки, чтобы заботиться о выводке. Используйте пинцет, чтобы собрать медсестрой пчел от сотов, которые содержат много расплода и взрослых рабочих.
Примечание: Если HPGs из собранных рабочих разрабатываются, когда расчлененный, как описано на стадии 1.7, эти рабочие определяются как медсестра пчел. Проведение thoraces пинцетом рекомендуется подобрать работников из сотов. - Собрать фуражиров, использовать сетку от насекомых, чтобы захватить работников, которые возвращаются в свои ульи с пыльцой нагрузок на задних ногах.
Примечание: Если HPGs захваченных рабочих появляются усохшие, когда вскрывали, как описано на стадии 1.7, эти рабочие определяются как фуражиров.
- Для сбора медсестра пчел, подобрать работников, которые ставят свои головы в гребень клетки, чтобы заботиться о выводке. Используйте пинцет, чтобы собрать медсестрой пчел от сотов, которые содержат много расплода и взрослых рабочих.
- Класфицировать в HPG на три группы, «развитых», «промежуточный» и «Усохшие» по рассечение под стереомикроскопа.
- не Обезболить 10-15 пчел в качестве клетки насекомых в холодильнике в течение 10-15 мин, пока пчелы не могут летать или ходить. Затем переместить пчел на лед и завершить анестезии на льду в течение 5 мин.
Примечание: Это занимает около 15-20 мин общей для достижения анестезии. Если время анестезии необходимо укоротить, количество пчел в клетке должна быть уменьшена до 1-3 пчел на клетку. - Рассеките голову от тела с ножницами и пинцетом. Зафиксируйте голову на зубной воск, помещенного на чашку Петри с булавками. Вставьте два штифта в основания усиков, чтобы зафиксировать голову. Замочите фиксированные головы в физиологическом растворе насекомых (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl 2).
- Снимите переднюю сторону кутикулы головы с использованием тонких пинцетом и хирургический нож под бинокулярным микроскопом.
Примечание: HPGs можно легко найти в голову после удаления Cuticle. HPG является кистевидный орган, который существует вокруг мозга в голове. - Удалите трахеи ткани, которая является белой мембранозной ткани под кутикулой. Затем, рассекать HPGs из головы, медленно вытягивая их с помощью пинцета.
- Классифицировать HPGs с большой и круглой ацинусов как «развитых». Классифицировать HPGs с малым и искаженной ацинусов как "усохшие". Классифицировать HPGs, соответствующий ни "Развитая", ни "усохшие", как "Промежуточное".
Примечание: Представитель фотографии , которые показывают эти три класса состояний HPG показаны на рисунке 2. - Тема "Разработано" и HPGs "усохшие" до выделения РНК как "медсестра пчелы HPGs 'и' фуражиры HPGs ', соответственно, и сравнение экспрессии генов в HPGs между медсестрой пчел и фуражиров (раздел 4).
- не Обезболить 10-15 пчел в качестве клетки насекомых в холодильнике в течение 10-15 мин, пока пчелы не могут летать или ходить. Затем переместить пчел на лед и завершить анестезии на льду в течение 5 мин.
2. Инъекция 20E
- Собирают медсестра пчел от типичных колоний как Described в процедуре 1.6.1.
Примечание: HPGs нельзя рассматривать в этих пчел, как пчелы будут выращены. - Обезболить пчел при 4 ° С в холодильнике (не на льду).
Примечание: Это займет около 30 мин для достижения анестезии. Если время анестезии сокращается, число пчел в клетке должна быть снижена до 1-3 пчел в клетку. - С помощью пинцета иммобилизации пчел на зубной воск, размещенными на чашку Петри.
- Вводят 1 мкл раствора 20E в переднюю часть головки, используя наконечник инъекции, сделанный из калиброванного капилляра микропипетки с помощью стеклянной иглы съемника.
- Растворите 20Е в этаноле-насекомым растворе (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl 2) смеси (1: 4) в дозе 2,5 мкг / мкл.
- Подключение наконечника инъекционного к резиновой трубкой, и соединить желтый кончик микропипетки к противоположной стороне трубки.
- Поместите 1 мкл раствора 20E на парафином с помощью микропипетки, удерживая желтый кончик микропипетки во рту, А.Н.d обратить решение в наконечник инъекции.
- Вставьте кончик инъекцией в основание усиков, и впрыскивают раствор путем продувки через желтый наконечник микропипетки.
Примечание: Протокол показано на этом этапе является представителем метод инъекции, но использование автоматизированной литьевой машины рекомендуется для обеспечения безопасности по мере необходимости 20.
- Задний инъецированные пчелы в клетках насекомых при 33-36 ° С (идеальная температура составляет 35 ° С) в темных и влажных условиях (> 60% относительной влажности) в течение 1 или 3 дня. Поставка медово-водной смеси (1: 1) к пчелам. В случае необходимости, подсчет живых пчел после инъекции.
3. Применение Метопрен
- Соберите гребни, которые содержат куколок из типичных колоний после того, как все прилипшие взрослые пчелы удаляются с помощью кисти. Выдержите гребенки при 33-36 ° С (идеальная температура составляет 35 ° С) в условиях повышенной влажности (> 60% относительной влажности) на срок до 1 суток.
- Через 6 дней, собирают расписные рабочих (6-дневных) из колоний. Возьмите нарисованные рабочих из сотов, держа их thoraces с помощью пинцета.
- Обезболить пчел при 4 ° С в холодильнике (не на льду), как в процедуре 2.2. С помощью пинцета иммобилизации пчел на зубной воск, размещенными на чашку Петри и применять 1-5 мкл раствора метопрена (50-250 мкг / мкл), растворенного в ацетоне, чтобы их головы с помощью микропипетки. С помощью фильтрующего мундштука, который устойчив к ацетону.
Примечание: Ацетон может иметь вредное воздействие на пчел, приводящих к смерти. Если наблюдается высокая смертность пчел, рекомендуется уменьшение объема ацетона до 1 мкл на минимальном уровне. - Задние пчелы в клетках насекомых при 33-36 ° С (идеал темпера тура составляет 35 ° C) в течение 7 дней при темных и влажных условиях (> 60% относительной влажности воздуха). Поставка медово-водной смеси (1: 1) к пчелам. В случае необходимости, подсчет живых пчел после местного применения.
Примечание: В этой статье, выживающие пчелы подсчитывают через 7 дней после применения (таблица 3).
4. Экстракция РНК и количественный RT-PCR
- Обезболить пчел и рассекают HPGs как описано в пунктах 1.7.1 1.7.4.
- Собирают отсеченных HPGs в микроцентрифужных трубки на сухом льду и хранят при -80 ° С до использования.
- Добавьте 400 мкл реагента для денатурации белка.
Примечание: Этот реагент является коммерчески доступным (смотри таблицу материалов). - Однородный ткани HPG с использованием ручного миксером с гомогенизацией пестиком, который помещается внутрь трубки микроцентрифужных. Однородный при скорости вращения приблизительно 300 оборотов в минуту в течение 1 мин на льду ломаться и клеток, лизировать ткани.
таблицу материалов). - Добавляют 80 мкл хлороформа и хорошо перемешать. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга микроцентрифужных пробирки при 14,170 мкг в течение 15 мин при 4 ° С. Передача водной фазы в новую пробирку. Добавить равный объем изопропанола и 1 мкл гликогена (5 мг / мл). Инкубируйте при -20 ° С в течение по меньшей мере 20 мин.
- Центрифуга микроцентрифужных пробирки при 14,170 х г в течение 10 мин при 4 ° C и удалить супернатант.
- Добавить 400 мкл 75% этанола к осадку и хорошо перемешать, центрифугировать микроцентрифужных пробирки при 14,170 х г в течение 15 мин при 4 ° С, и удалить супернатант. Повторите эту процедуру еще раз.
- Высушите осадок в течение 5-10 мин, а затем растворить его в 10 мкл РНКазы без воды.
Примечание: Полное высыхание крупинки может вызвать нерастворимую осадок РНК в воде. Таким образом, осадок, который немного влажный подходит дляРастворение. - Измерение концентрации РНК с использованием спектрофотометра такой, как NanoDrop или аналогичный.
- Treat 500 нг тотальной РНК с 2,0 U ДНКазы I путем инкубирования при 37 ° С в течение 30 мин для разрушения любого загрязняющего геномной ДНК.
- Реверс-транскрибировать 200 нг ДНКазы I-обработанной РНК и проводить ПЦР в реальном времени с использованием коммерчески доступных наборов (см список в Таблице материалов и реагентов) и праймеры геноспецифических (mrjp2, 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'и 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'и 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Выполните ПЦР следующим образом: [95 ° С х 30 сек + (95 ° С × 5 сек + 60 ° С х 15 сек + 72 ° С х 20 сек) х 45-55 циклов].
- Нормализация количества транскрипта с этим фактора элонгации 1 & alpha-F2 (EF1α˗F2) или рибосомального белка 49 (rp49) 9,16,21,22. Эти гены являются надежное управление гены для анализа экспрессии генов в HPGs с использованием QRT-PCR.
- Выполните Стьюдента-тест для выявления существенных различий между двумя группами эксперимента (медсестра пчел против скороспелых фуражиров, 20E обработанных пчел по сравнению с контролем пчел и Метопрен обработанных пчел по сравнению с контролем пчел) с использованием статистического программного обеспечения.
Примечание: Если F-тест предполагает гомогенность дисперсии, т-тест Стьюдента может быть использован. Если нет, то Т-тест Уэлша может быть использован.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор протокола для подготовки одного когорты колоний показан на рисунке 1А. Время-ход экспериментов от подготовки одной когорты колонии для сбора проб показан на рисунке 1В. Работники , которые удовлетворяют поведенческие критерии поведения медсестер или нагула поведения были собраны из одной когорты колоний, и развитие HPG оценивался в этих рабочих Таблица 1 показывает классификацию развития HPG на три группы. "Разработано", "промежуточный" и "Усохшая" в зависимости от размера. Типичные фотографии , показывающие эти три класса HPGs показаны на рисунке 2. Результаты показывают , что обе медсестры пчелы и не по годам фуражиров, в соответствии с критериями , описанными в протоколе, также наблюдались в одной когорты колоний. Выражение mrjp2 и Hbg3 в HPGs был анобогащены в питающих пчел и скороспелых фуражиров, соответственно, указывая , что функция HPG связана с ролью работника (рисунок 3) 16.
Процедура инъекций 20Е в рабочих головок показана на рисунке 4. Выжившие пчелы подсчитывались 1, 5 и 7 дней после инъекции , чтобы изучить выживаемость Скорость пчел, которым вводили физиологический раствор насекомых или растворителем для 20E раствора перед экспериментом 20E. Через 7 дней после инъекции, примерно на 60-80% инжектированных пчел были живы, и выживаемость пчел , инъецированных растворителем для 20E раствора была сравнима с физраствором насекомых (таблица 2). Эффект от инъекции 20E уменьшение экспрессии обоих mrjp2 и Hgb3 в HPGs (рисунок 5) 16. В дополнение к 20Е, эффект местного применения метопрена на mrjp2 и Hbg3 (таблица 3). С другой стороны, только около 20% до 30% пчел вводили ацетон / пчелиный физиологический раствор (1: 4) раствор выжила через 7 дней после инъекции , когда выжившие пчелы подсчитывались 1, 3, 5 и 7 дней после инъекции (Таблица 4) , Таким образом, был принят способ нанесения краски для лечения метопрена. Применение метопрен ингибирует экспрессию mrjp2 и усиливал экспрессию Hbg3 (рис 6) 16.
Рисунок 1. Обзор эксперимента колонии одной когорты. (А) Схема получения одной когорты колоний. (B) Время-ход эксперимента из preparinг одной когорты колоний сбора медсестер пчел и скороспелых фуражиров. Горизонтальная стрелка указывает на ход жизни работника в одной когорты колоний. Числа с вертикальными линиями указывают возраст работник. Не только по годам развитым фуражиров , но и перестойных медсестра пчел (28-32 дней) , как сообщается, находятся в одной когорты колоний 15. Таким образом, сравнение физиологии между перестойных медсестра пчел и фуражиров могут быть выполнены в одной когорты колоний, хотя это не было сделано в данном исследовании. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Фотографии , показывающие три класса состояний HPG. Развитый (A), промежуточное соединение (В), и сморщенное (C Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Роль-ассоциированной экспрессии mrjp2 и Hbg3 в HPGs рабочих из одной когорты колоний. График показывает сравнение уровней мРНК mrjp2 (А) и Hbg3 (B) в HPGs между медсестрой пчел (N) и скороспелых фуражиров (PF) из двух одного когорты соlonies. Уровень мРНК каждого гена нормализовали с этим рибосомального белка 49 (rp49). Относительный уровень мРНК каждого гена в пчелиных HPGs медсестра была определена как 1. Уровень мРНК mrjp2 в некоторых скороспелых фуражирами не может быть определена количественно из - за интенсивности сигналов ниже порога обнаружения. Таким образом, число выборок различается между генами. Относительные уровни мРНК указаны со стандартной ошибкой. Звездочки указывают на значительные различия между медсестрой пчел и скороспелых фуражиров (*, р <0,05; т-тест). Эта цифра была воспроизведена с Уэно и др., (2015) 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Схема протокола для 20E INJECции. Процедуры 2.3 и 2.4 в разделе протокола показаны на этом рисунке. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Влияние инъекции 20E на mrjp2 и экспрессии Hbg3 в HPGs 16. На графике показано сравнение уровней мРНК mrjp2 (А) и Hbg3 (B) в HPGs между 20E-обработанных пчел (20E +) и пчел управления (20E-). Цифры под графиком указывают на следующий день после лечения 20E. Уровень мРНК каждого гена нормализовали с этим фактора элонгации 1 & alpha; F2 (EF1α-F2). Относительный уровень мРНКкаждый ген в пчелиных HPGs контроля был определен как 1. Относительные уровни мРНК указаны с учетом стандартной ошибки. Звездочка указывает на существенную разницу между 20E-обработанных пчел и пчел управления (*, р <0,05; т-тест). Эта цифра была воспроизведена с Уэно и др., (2015) 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Влияние применения метопрена на mrjp2 и экспрессии Hbg3 в HPGs 16. На графике показано сравнение уровней мРНК mrjp2 (А) и Hbg3 (б) в HPGs между Метопрен обработанных пчел и пчел управления.Уровень мРНК каждого гена нормализовали с тем из EF1α-F2. Относительный уровень мРНК каждого гена в пчелиных HPGs контроля был определен как 1. Относительные уровни мРНК указаны с учетом стандартной ошибки. Звездочки указывают на значительные различия между Метопрен обработанных пчел и пчел управления (*, р <0,05; т-тест). Эта цифра была воспроизведена с Уэно и др., (2015) 16. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Колония № | Наблюдаемое поведение | Количество особей в каждом классе HPG | |||
| Разработано | промежуточный | сморщенный | Всего | ||
| 1 | уход | 8 | 1 | 1 | 10 |
| Foraging | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | уход | 4 | 2 | 0 | 6 |
| Foraging | 0 | 0 | 5 | 5 | |
Таблица 1: Классификация HPGs работников , чьи уход за больными или нагула поведение наблюдалось в одной когорты колоний. размер HPG в рабочих из двух когорт одной колонии (колонии № 1 и 2.) была сгруппирована на три класса; "Разработано", "Intermediate" и "Усохшие" по размеру.
| Через несколько дней после инъекции | Нет инъекции | Насекомое физиологический раствор | Растворитель для 20E SOLN | |
| Trial 1 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| 1 день | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| число 5 число | 14/15 | 13/15 | 11/15 | |
| День7 | 14/15 | 12/15 | 9/15 | |
| Trial 2 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| 1 день | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| число 5 число | 15/15 | 11/15 | 12/15 | |
| День7 | 14/15 | 10/15 | 12/15 |
Таблица 2: Выживаемость пчел , инъецированных растворителем для 20E раствора. Пятнадцать рабочих были подготовлены в каждой экспериментальной группе.
| Через несколько дней после применения | Ацетон | Метопрен | |
| Trial 1 | День 0 | 7/7 | 8/8 |
| 7-й день | 7/7 | 6/8 | |
| Trial 2 | День 0 | 7/7 | 8/8 |
| 7-й день | 7/7 | 8/8 |
Таблица 3: Выживаемость пчел , получавших метопрен семи до восьми рабочих были подготовлены в каждой экспериментальной группе..
| Через несколько дней после инъекции | Нет инъекции | Ацетон / Пчелиный физиологический раствор (1: 4) |
| День 0 | 15/15 | 15/15 |
| 1 день | 15/15 | 6/15 |
| 3-й день | 15/15 | 5/15 |
| 5-й день | 15/15 | 4/15 |
| 7-й день | 15/15 | 4/15 |
Таблица 4: Выживаемость пчел , инъецированных ацетон / пчелиного физиологическим раствором (1: 4). Раствор Пятнадцать рабочих были подготовлены для каждой экспериментальной группы. Ацетон / пчелиный физиологический раствор (1: 4) раствор впрыскивают в рабочий брюшной полости. Состав пчелиного физиологического раствора составляет 130 мМ NaCl, 6 мМ КСl, 4 мМ MgCl 2, 2,5 мМ CaCl 2, 160 мМ сахарозы, 25 мМ глюкозы и 10 мМ HEPES (рН 7,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Получение одной когорты колоний
Здесь мы описали протокол , используемый в нашем предыдущем исследовании 16 для подготовки одной когорты колонии для анализа HPG физиологии , связанной с переходом в роли рабочих пчел. Медсестра пчелы и не по годам фуражиров , которые удовлетворяют критериям , описанным в процедурах 1.6-1.7 и рис 2 наблюдались в одной когорты колоний (таблица 1). На фотографиях на рисунке 2 было бы полезно в классификации HPG утверждает в качестве ссылки. Критерии, основанные как на поведение работника и развитие HPG действительны для определения медсестра пчел или фуражиров в типичных колоний. Роль переход от кормления до кормления постепенно переходит в этих колониях: количество времени , проведенного в поведении медсестер постепенно снижается в то время как в нагула поведение постепенно увеличивается во время роли сдвига 2. Таким образом, было бы трудно собрать рабочих, которые исключительновыполнять уход за больными или нагула только по поведенческим критериям. В результате , что экспрессия mrjp2 и Hbg3 в HPGs связано с ролью рабочих явно указывает на то, что протокол , описанный здесь , может быть принят для изучения HPG физиологии медсестра пчел и скороспелых фуражиров из одной когорты колоний (Рисунок 3). Критерии, основанные как на поведение работника и развитие HPG может также применяться при определении медсестра пчел и скороспелых фуражиров из одной когорты колоний. В дополнение к HPGs, других экзокринных желез в голове проходят физиологические изменения в связи с ролью сдвига. Например, функция нижнечелюстной железы изменяется от синтеза жирных кислот для расплода пищи для синтеза феромонов тревоги 2-гептаноне 2. Протокол, описанный здесь, таким образом, может быть адаптирована для изучения роли ассоциированных физиологии, отличных от HPGs экзокринных желез.
Успешный сбор пurse пчелы и преждевременное половое фуражиров из неполных когорт колоний зависит от сбора достаточного количества вновь появившихся рабочих, когда колонии подготовлены. Если небольшое число вновь появившихся работников собирается, было бы трудно собрать достаточно медсестра пчел и не по годам фуражиров. Кроме того, состояние маток является еще одним ключевым моментом для успешного сбора проб. Queens с большой живот хороши для откладки яиц, потому что эти королевами обычно разработали яичники. Таким образом, труд рабочих, как полагают, эффективно разделить даже в одной когорты колоний, потому что выводок постоянно подается королевой. Если ни один выводок не поставляется, было бы трудно собрать медсестра пчел из одной когорты колоний. И, наконец, маркировка рабочих с использованием плаката краски требуется для того, чтобы рабочие собирают из одной когорты колоний, так как фуражиров иногда возвращаться к неправильному колонии. Для того, чтобы эффективно собирать скороспелых фуражиров, краски маркировка должна бытьприменяется как много рабочих, как это возможно (более 900 вновь появившихся рабочих на одной когорты колонии). Использование водосодержащих чернил для маркировки может быть рекомендована, так как на масляной основе чернил, который обычно содержит летучие органические соединения, может нарушить химическую связь между пчелами. Водные знаки на основе чернил не выцветает очень в течение эксперимента.
Гормональная терапия
Мы также описали протокол для инъекций 20Е в головы рабочих , чтобы изучить влияние экдизона на HPG физиологии (mrjp2 и выражения Hbg3). Выживаемость пчел вводили физиологический раствор насекомых или растворителя для 20E раствора было достаточно для последующего анализа, что указывает , что протокол , описанный здесь для инъекций с использованием наконечника для инъекций и растворитель для 20E раствора может быть принята для инъекций 20E эксперимента (таблица 2 ). Кроме того, сравнение экспрессии генов в HPGsмежду 20E-обработанных пчел и пчел управления показал , что введенный 20E изменили экспрессию mrjp2 и Hbg3, оба из которых связаны с функцией HPG (рисунок 5). Этот результат наводит на мысль о том, что протокол, описанный здесь, будет полезен для изучения влияния экдизона на HPG физиологии, а также могут быть приняты для изучения других экзокринных желез в голове, такие как челюстных желез. Кроме того, способ инъекции может быть принят для инъекций других химических веществ. Например, протокол, описанный здесь, было бы целесообразно для потребителей инъекционных растворов двухцепочечной РНК в головы для гена нокдаун экспериментов.
В дополнение к 20Е, мы описали протокол для применения метопрен, который является аналогом JH. Метопрен обычно применяется к животу. С другой стороны, метопрен был применен к главе рабочих, здесь. Почти все пчелы с местным применением метопрен или ацетона выжили через 7 дней после обработки, Предполагая , что применение 5 мкл метопрен или раствора ацетона к головкам оказывает незначительное влияние на выживаемость рабочий (таблица 3). Кроме того, сравнение mrjp2 и выражения Hbg3 в HPGs между methoprene- и обработанные ацетоном пчел указывает на то, что применение метопрен ингибирует экспрессию mrjp2 и усиливает экспрессию Hbg3 (рисунок 6). Эти результаты свидетельствуют о том, что протокол, описанный здесь, является подходящим для анализа воздействия метопрена на физиологию экзокринных желез, такие как HPGs в голове.
Успешное лечение гормонами зависит от выживаемости обработанных пчел. экспозиции при низкой температуре в холодильнике может быть целесообразным для обезболивающее пчел. Анестезия на льду не рекомендуется, потому что пчелы будут намокать на льду, что приводит к низкой выживаемости. Кроме того, метод инъекции может стать еще одним ключевым моментом для поддержания пчел в живых. Важно маке кончик инъекции длинные и тонкие, и формировать его острым кончиком, используя режущий инструмент, чтобы свести к минимуму повреждения пчел путем инъекций. Тем не менее, метод инъекции , могут не подходить для изучения влияния метопрен на HPG физиологии, так как ацетон растворитель для метопрен отрицательно сказывается на выживаемости пчелиный (таблица 4). Кроме того, метод инъекции, описанный здесь, может не подходить для анализа поведения в колониях, как инъецированные пчелы будут исключены из своих колоний, когда они вновь введены после инъекции. Работники с легкой травмы могут быть исключены из колоний. Другие методы, такие как приложения или перорального введения гормона могут быть подходящими для анализа поведения.
Одной когорты колония была использована для изучения регуляции разделения труда работника медоносных 10,11. Кроме того, лечение ювенильного гормона был использован для изучения поведения и мозга functiна связанные с разделением труда 11. Тем не менее, подробные протоколы как в подготовке одноленточного когорт колоний и лечение JH не было ранее предусмотрено в таких деталях. В последнее время важность экдизона в разделении труда становятся все более широкое признание, и регулирование разделения труда со стороны как JH и экдизона предлагается 23. Подробные протоколы для успешной подготовки одной когорты колоний и гормонального лечения, такого как JH и экдизона, описанной в этой статье, могут способствовать продвижению в изучении физиологии работника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. The insect societies. , Harvard university press. (1971).
- Winston, M. L. The biology of the honey bee. , Harvard university press. (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
