Summary
Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för framställning av en enda kohort honungs kolonier - ett användbart verktyg för att analysera rollen associerade arbetare fysiologi. Vi beskriver också detaljerade protokoll för behandling av arbetare med juvenil hormon och ekdyson att utvärdera medverkan av dessa hormoner i regleringen av arbetar beteende och / eller fysiologi.
Introduction
Den europeiska honungsbiet, Apis mellifera, är en eusocial insekt med en mycket organiserat samhälle 1. Arbetsbin (arbets kast) är engagerade i olika åtgärder för att upprätthålla koloni aktivitet, och dessa uppgifter ändras beroende på arbetstaga honeybee ålder efter eclosion, som kallas åldersrelaterad arbetsfördelning 2-4. Unga arbetstagare (<13 dagar gamla) tar hand om yngel i kupan genom att utsöndra bidrottninggelé (sjuksköterska bin), medan äldre (> 15 dagar gamla) samla nektar och pollen utanför kupan (hackar) 2-4. Fysiologi arbetarna förändras i samband med denna roll skift. Till exempel, funktionen hos de hypofarynxcancer körtlar (HPGs), parade exokrina körtlar belägna i huvudet, förändringar i association med den roll förskjutning från omvårdnad för födoinsamlande 2,5. Sjuksköterska bee HPGs syntetisera huvudsakligen stora drottninggelé proteiner, som är viktiga komponenter i bee mjölk. Å andra sidan, fält HPGs huvudsakligensyntetisera kolhydrat metaboliserande enzymer, såsom α-glukosidas III, för att bearbeta nektar in honung genom att omvandla sackaros till glukos och fruktos. Våra tidigare studier avslöjade att uttrycket av mrjp2, som kodar en stor drottninggelé protein och Hbg3, som kodar α-glukosidas III, förändringar under roll skift 6-9.
För att avgöra om de fysiologiska förändringar i arbetstaga vävnader, inklusive HPGs, är förknippad med rollen skift eller med en ålder av arbetarna, skulle det vara lämpligt att manipulera befolkningen sammansättningen av en honungsbinas koloni, såsom att förbereda enda kohort kolonier där arbetarna i nästan samma ålder utföra olika uppgifter 10,11. Robinson et al. (1989) beskrev en metod för att upprätta en enda kohort koloni 10. Single-kohort kolonier omfattar initialt en drottning och 0-2 dagar gamla arbetstagare. Flera dagar efter fastställande av kolonierna, arbetarna i almost samma ålder anta olika uppgifter. Några arbetare utför omvårdnadsuppgifter som i typiska kolonier, medan andra arbetstagare utför födosök uppgifter tidigare än vanligt och därför kallas brådmogna hackar. Genuttryck jämförelser mellan sjuksköterska bin och brådmogen hackar skulle ge användbar information om den roll associerade fysiologi arbetar vävnader 12-16. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för framställning av single-kohort kolonier för analys av roll- och / eller åldersrelaterad fysiologi HPGs 16. Vi har också kortfattat beskriva hur att undersöka genuttrycket av mrjp2 och Hbg3 genom kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) för att utvärdera HPG fysiologi.
Utöver analysen av arbetar fysiologi i enkel kohortstudier kolonier, är viktigt för att analysera de reglerande mekanismerna för roll tillhörande arbetare fysiologi undersökning av det endokrina systemet. Juvenil hormon (JH), som KNOwn som "status quo" hormon i insektslarver, accelererar skiftet i rollen från omvårdnad till födosök i arbetsbin 11. Vidare ekdyson, som är känd som ömsat hormon under metamorfos, kan vara inblandade i rollen skift som gener som kodar för ekdyson signalmolekyler uttrycks i svamp kroppar, en högre centrum för arbetstagaren hjärnan 17-19. Därför beskriver vi också detaljerat protokoll som används i vår tidigare studie 16 att behandla arbetstagare med 20E, som är en aktiv form av ekdyson, och metopren, en JH analog, för analys av effekten av det endokrina systemet på HPG fysiologi (uttryck av mrjp2 och Hbg3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Single-cohort kolonier
- Förbered tre honungs kolonier att skapa två enkel kohort kolonier och att få ett tillräckligt antal nykläckta arbetare.
- Kontrollera att vissa puppor i utjämnade perifera celler i kammar har bruna ögon och en pigmenterad nagelband genom att öppna utjämnade kammar använder pincett. Om dessa puppor finns i perifera kam celler, kommer de flesta av puppor i hela kammar dyka upp i ca 1-3 dagar.
- Därefter samlar kammar innehåller dessa puppor efter all vidhäftande vuxna bin har tagits bort med en borste och blanda kammar från de tre kolonierna att minimera variabiliteten bland kolonier.
- Placera de uppsamlade kammar i en tom hive låda och inkubera vid 33 ° C under fuktiga betingelser (> 60% relativ fuktighet). Samla cirka 6000 nykläckta arbetstagare över 3 dagar (3.000 arbetare per koloni) från de insamlade kammar.
- Bestämma mängden workers baserat på vikten av fem nyligen framkommit arbetare slumpmässigt samlas in från omanipulerat kolonier.
- Väg fem nykläckta arbetare slumpmässigt samlats in från omanipulerat kolonier med hjälp av vågar.
Obs: Vikten av fem nyligen framkommit arbetare är i allmänhet 500-600 mg. - Uppskatta hur stor mängd insamlade arbetstagare genom att dividera vikten av de insamlade arbetarna genom den genomsnittliga vikten av fem nyligen framkommit arbetare.
- Väg fem nykläckta arbetare slumpmässigt samlats in från omanipulerat kolonier med hjälp av vågar.
- Applicera färgmärken på thoraces av cirka 1800 arbetare (900 arbetare per koloni) med vattenbaserade affisch måla markörer.
Obs: Tvättbart markör som används för att applicera färgen finns med i Tabell över Materials. - Införa en drottning och cirka 3000 av de 0-2 dagar gamla arbetstagare till en ny bikupa låda som innehåller två kammar, en kam som innehåller honung och pollen som konserver och annan tom kam för äggläggning av drottningen. Samla kammen innehåller honung och pollen frOm en annan omanipulerat koloni efter all vidhäftande bin tas bort.
Obs: Användningen av kärn bikupa box (liten storlek bikupa box) rekommenderas. - Samla sjuksköterska bin och brådmogen hackar med färgmärken sex till åtta dagar efter att ha skapat en enda kohort kolonier.
- För att samla sjuksköterska bin, plocka upp arbetare som sätter sina huvuden i kam celler att ta hand om yngel. Använd pincett för att samla sjuksköterskan bina från kammar som innehåller många avkommor och vuxna arbetstagare.
Obs: Om HPGs insamlade arbetare utvecklas när dissekeras som beskrivs i steg 1,7, är dessa arbetstagare definieras som sjuksköterska bin. Hålla thoraces av pincett rekommenderas att plocka upp arbetstagare mot kammar. - För att samla hackar, använda en insektsnät att fånga arbetare som återvänder till sina bikupor med pollenlaster på bakbenen.
Obs: Om HPGs av infångade arbetare verkar krympt när dissekeras som beskrivs i steg 1,7, är dessa arbetstagare definieras som hackar.
- För att samla sjuksköterska bin, plocka upp arbetare som sätter sina huvuden i kam celler att ta hand om yngel. Använd pincett för att samla sjuksköterskan bina från kammar som innehåller många avkommor och vuxna arbetstagare.
- clasSify den HPG in i tre grupper, "utvecklade", "Intermediate" och "krympta" av dissektion under ett stereomikroskop.
- Söva 10-15 bin i en insekt bur i ett kylskåp i 10-15 min tills bina kan inte flyga eller gå. Sedan flyttar bin på is och slutföra anestesi på is i 5 minuter.
Obs: Det tar ca totalt 15-20 minuter för att uppnå anestesi. Om anestesi tiden måste förkortas, bör antalet bin i en bur reduceras till 1-3 bin per bur. - Dissekera huvud från kroppen med saxar och pincetter. Fäst huvudet på tand vax placeras i en petriskål med stift. För in två stift i grunderna för antenner för att fixera huvudet. Blöt fasta huvuden i insekts saltlösning (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2).
- Ta bort den främre aspekten av nagelband av huvudet med användning av fin pincett och en kirurgisk kniv under ett binokulärt mikroskop.
Notera: De HPGs lätt kan hittas i huvudet efter avlägsnande av cuticle. HPG är en botryoid organ som existerar runt hjärnan i huvudet. - Ta bort luftrör vävnad som är en vit membranvävnad under nagelbanden. Då, dissekera HPGs från huvudet genom att långsamt dra dem med pincett.
- Klassificera HPGs med stor och rund acini som "utvecklade". Klassificera HPGs med små och förvrängda acini som "Krympt". Klassificera HPGs motsvarar varken "utvecklade" eller "Krympt" som "Intermediate".
Obs: Representativa fotografier som visar dessa tre klasser av HPG stater visas i figur 2. - Angående "utvecklade" och "Krympta" HPGs till RNA-extraktion som "sjuksköterska bee HPGs" och "fält HPGs", respektive, och jämför genuttryck i HPGs mellan sjuksköterska bin och hackar (avsnitt 4).
- Söva 10-15 bin i en insekt bur i ett kylskåp i 10-15 min tills bina kan inte flyga eller gå. Sedan flyttar bin på is och slutföra anestesi på is i 5 minuter.
2. Injektion av 20E
- Samla sjuksköterska bin från typiska kolonier som described i förfarandet 1.6.1.
Obs: HPGs kan inte prövas i dessa bin som bina kommer födas upp. - Söva bina vid 4 ° C i kylskåp (inte på is).
Obs: Det tar ca 30 minuter för att uppnå anestesi. Om anestesi tiden förkortas, bör antalet bin i buren minskas till 1-3 bin per bur. - Med hjälp av pincett, immobilisera bin på dentalvax placeras i en petriskål.
- Injicera 1 pl av 20E-lösning in i den främre aspekten av huvudet med hjälp av en injektionsspets gjord av en kalibrerad kapillär mikropipett med användning av en glasnål avdragare.
- Upplösa 20E i etanol-insekts saltlösning (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2) blandning (1: 4) vid 2,5 ^ g / | il.
- Ansluta insprutningsspetsen till en gummislang, och ansluta en gul mikropipett spets till den motsatta sidan av röret.
- Placera 1 pl 20E lösning på parafilm med hjälp av en mikropipett, hålla den gula mikropipett spetsen i munnen, end Dra in lösningen i injektionsspetsen.
- För in injektions spets i botten av antenner, och injicera lösningen genom att blåsa genom den gula mikropipett spets.
Obs: Protokollet som visas i det här steget är den representativa injektionsmetoden, men användningen av den automatiserade injektion maskin rekommenderas för säkerhet som behövs 20.
- Bakre de injicerade bin i insekts burar vid 33-36 ° C (den idealiska temperaturen är 35 ° C) under mörka och fuktiga förhållanden (> 60% relativ fuktighet) för 1 eller 3 dagar. Supply blandning honung-vatten (1: 1) till bina. Om det behövs, räkna överlevande bin efter injektion.
3. Tillämpning av Methoprene
- Samla kammar som innehåller puppor från typiska kolonier efter all vidhäftande vuxna bin tas bort med en borste. Inkubera kammar vid 33-36 ° C (den idealiska temperaturen är 35 ° C) under fuktiga förhållanden (> 60% relativ fuktighet) i upp till ett dygn.
- Efter 6 dagar, samla målade arbetare (6 dagar gamla) från kolonierna. Plocka upp målade arbetare från kammarna genom att hålla sina thoraces med pincett.
- Söva bina vid 4 ° C i kylskåp (ej på is) såsom i förfarandet 2,2. Med användning av pincett, immobilisera bin på dental vax placeras i en petriskål och applicera 1-5 | il av metopren lösning (50-250 | j, g / | al) löst i aceton för att deras huvuden med hjälp av en mikropipett. Använda ett filtermunstycke som är resistent mot aceton.
Obs: Aceton kan ha skadliga effekter på bin som leder till döden. Om den höga dödligheten hos bin observeras, är minskningen av volymen aceton till 1 pl på lägsta rekommenderade. - Bakre bina i insekts burar vid 33-36 ° C (den perfekta temperatur är 35 ° C) under 7 dagar under mörka och fuktiga förhållanden (> 60% relativ fuktighet). Supply blandning honung-vatten (1: 1) till bina. Om det behövs, räkna överlevande bin efter topisk applicering.
Obs: I den här artikeln är överlevande bin räknades 7 dagar efter applicering (tabell 3).
4. RNA-extraktion och Kvantitativ RT-PCR
- Söva bin och dissekera HPGs som beskrivs i steg 1.7.1 till 1.7.4.
- Samla in de dissekerade HPGs i ett mikrocentrifugrör på torris och förvara vid -80 ° C fram till användning.
- Tillsätt 400 ul av reagens för proteindenaturering.
Obs: Denna reagens är kommersiellt tillgängliga (se tabell of Materials). - Homogenisera HPG vävnader med hjälp av en handhållen elvisp med en homogenisering mortelstöt som passar inuti ett mikrocentrifugrör. Homogenisera vid en rotationshastighet av approximativt 300 varv per minut under 1 min på is för att bryta och lyserar vävnadsceller.
tabell of Materials). - Lägg 80 | il kloroform och blanda väl. Inkubera under 5 min vid RT.
- Centrifugera mikrocentrifugrör vid 14.170 xg under 15 min vid 4 ° C. Överför vattenfasen till ett nytt rör. Tillsätt en lika stor volym isopropanol och en pl glykogen (5 mg / ml). Inkubera vid -20 ° C under minst 20 min.
- Centrifugera mikrocentrifugrör vid 14.170 xg under 10 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 400 | il 75% etanol till pelleten och blanda väl, centrifugera mikrocentrifugrör vid 14.170 xg under 15 min vid 4 ° C, och avlägsna supernatanten. Upprepa dessa förfaranden ännu en gång.
- Lufttorka pelleten i 5-10 min och sedan lösa upp den i 10 | il RNas-fritt vatten.
Notera: Komplett torkning av pellets kan orsaka insolubilisering av RNA-pelleten i vatten. Således är lämplig för den pellet som är något våtupplösande. - Mäta RNA-koncentrationen med användning av en spektrofotometer, såsom Nanodrop eller liknande.
- Behandla 500 ng av totalt RNA med 2,0 U av DNas I genom att inkubera vid 37 ° C under 30 min för att bryta ned eventuella kontaminerande genomiskt DNA.
- Omvänd transkribera 200 ng DNas I-behandlat RNA och utföra realtids-PCR med användning av kommersiellt tillgängliga kit (se listan i tabellen av Material och reagenser) och genspecifika primers (mrjp2, 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', och 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'och 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Genomförande av PCR-enligt följande: [95 ° C X 30 sek + (95 ° C x 5 sek + 60 ° C x 15 sek + 72 ° C x 20 sek) x 45-55 cykler].
- Normalisera mängden utskrift med den i förlängningsfaktor 1α-F2 (EF1α˗F2) eller ribosomalt protein 49 (rp49) 9,16,21,22. Dessa gener är tillförlitlig kontroll gener för analys av genuttryck i HPGs använder QRT-PCR.
- Utför tvåsidiga t-test för att upptäcka signifikanta skillnader mellan två experimentgrupper (sjuksköterska bin kontra brådmogna hackar, 20E-behandlade bin kontra kontroll bin, och metopren behandlade bin kontra kontroll bin) med statistisk programvara.
Obs: Om F-test antar homogenitet av varians, kan t-test användas. Om inte, kan användas Welch t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt av protokollet för framställning av single-cohort kolonier visas i figur 1A. Tidsförloppet för experiment från framställning av single-cohort kolonier till provsamling visas i figur 1B. Arbetare som uppfyller de beteende kriterierna för omvårdnad beteende eller födosöksbeteende samlades från en enda cohort kolonier, och HPG utveckling uppskattades i dessa arbetare Tabell 1 visar klassificeringen av HPG utveckling i tre grupper. "Utvecklade", "Intermediate" och "krympta" beroende på storleken. Representativa fotografier som visar dessa tre klasser av HPGs anges i figur 2. Resultaten indikerar att både sjuksköterskan bin och brådmogna hackar, enligt de kriterier som beskrivs i protokollet, observerades också i enkel kohortstudier kolonier. Expression av mrjp2 och Hbg3 i HPGs var svriched i sjuksköterska bin och brådmogen hackar, respektive, vilket tyder på att HPG funktion är förknippad med arbetstagarens roll (Figur 3) 16.
Förfarandet för att injicera 20E in i arbetarhuvuden visas i fig 4. Överlevande bin räknades 1, 5 och 7 dagar efter injektion för att undersöka överlevnaden graden av bin som injicerats med insekt saltlösning eller lösningsmedel för 20E lösning innan 20E experimentet. Vid 7 dagar efter injektion, var ungefär 60-80% av injicerade bin levande, och överlevnaden av bin som injicerats med lösningsmedel för 20E lösning var jämförbar med den med insekts saltlösning (tabell 2). Effekten av 20E injektion minskat uttryck av både mrjp2 och Hgb3 i HPGs (Figur 5) 16. Förutom 20E, effekten av topisk metopren applikation på mrjp2 och Hbg3 (tabell 3). Å andra sidan, endast ungefär 20% till 30% av bin injicerade med aceton / bi saltlösning (1: 4) lösning överlevde 7 dagar efter injektion när överlevande bin räknades 1, 3, 5 och 7 dagar efter injektion (tabell 4) . Således var ansökan metod för metopren behandling antogs. Tillämpning av metopren inhiberade expressionen av mrjp2 och ökad expression av Hbg3 (figur 6) 16.
Figur 1. Översikt av en enda kohort koloni experiment. (A) System för framställning av single-cohort kolonier. (B) tidsförloppet för experimentet från preparing enda kohort kolonier till att samla sjuksköterska bin och brådmogna hackar. Horisontell pil visar loppet av arbetstagarens livstid i enkel kohortstudier kolonier. Siffror med vertikala linjer anger arbetare ålder. Inte bara brådmogen hackar utan även överåriga sjuksköterska bin (28-32 dagar gamla) rapporteras återfinnas i en enda kohort kolonier 15. Således kan utföras jämförelse av fysiologi mellan överåriga sjuksköterska bin och fält i singel kohortstudier kolonier, även om detta inte gjordes i denna studie. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fotografier som visar de tre klasser av HPG stater. Utvecklad (A), Intermediate (B), och krympta (C Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Roll associerade uttryck för mrjp2 och Hbg3 i HPGs arbetare från en enda kohort kolonier. Diagrammet visar en jämförelse av mRNA-nivåer av mrjp2 (A) och Hbg3 (B) i HPGs mellan sjuksköterska bin (N) och brådmogna hackar (PF) från två single-cohort colonies. MRNA-nivån av varje gen normaliserades med den för ribosomalt protein 49 (rp49). Den relativa mRNA-nivå av varje gen i sjuksköterskan bee HPGs definierades som 1. mRNA-nivån av mrjp2 i vissa brådmogen hackar kunde inte kvantifieras på grund av signalnivåer lägre än detekteringströskeln. Därför skiljer sig antalet sampel mellan gener. Relativa mRNA-nivåer indikeras med standardfel. Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan sjuksköterska bin och brådmogen hackar (*, p <0,05; t-test). Denna siffra har reproducerats från Ueno et al., (2015) 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Schema av protokollet för 20E injection. Rutiner 2.3 och 2.4 i protokollet avsnitt illustreras i denna figur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effekt av 20E injektion mrjp2 och Hbg3 uttryck i HPGs 16. Diagrammet visar en jämförelse av mRNA-nivåer av mrjp2 (A) och Hbg3 (B) i HPGs mellan 20E-behandlade bin (20E +) och kontroll bin (20E-). Siffror under grafen visar dagen efter 20E behandling. MRNA-nivån av varje gen normaliserades med den i förlängningsfaktor 1α-F2 (EF1a-F2). Relativ mRNA-nivå avvarje gen i kontroll bee HPGs definierades som 1. Relativa mRNA-nivåer är indikerade med ett standardfel. En asterisk anger en signifikant skillnad mellan 20E-behandlade bin och kontroll bin (*, p <0,05; t-test). Denna siffra har reproducerats från Ueno et al., (2015) 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Effekt av metopren applikation på mrjp2 och Hbg3 uttryck i HPGs 16. Grafen visar jämförelsen av mRNA-nivåer av mrjp2 (A) och Hbg3 (B) i de HPGs mellan metopren behandlade bin och kontroll bin. DemRNA-nivå av varje gen normaliserades med den hos EF1a-F2. Relativ mRNA-nivå av varje gen i kontroll bee HPGs definierades som 1. Relativa mRNA-nivåer indikeras med standardfel. Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan metopren behandlade bin och kontroll bin (*, p <0,05; t-test). Denna siffra har reproducerats från Ueno et al., (2015) 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Koloni No. | observerat beteende | Antal personer i varje HPG klass | |||
| Tagit fram | Mellanliggande | Hopsjunken | Total | ||
| 1 | Amning | 8 | 1 | 1 | 10 |
| foraging | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | Amning | 4 | 2 | 0 | 6 |
| foraging | 0 | 0 | 5 | 5 | |
Tabell 1: Klassificering av HPGs arbetare vars vård eller födosöksbeteende observerades i en enda kohort kolonier. HPG storlek hos arbetare från två enkel kohort kolonier (koloni nr 1 och 2). Grupperades i tre klasser; "Utvecklade", "Intermediate" och "Krympt" efter storlek.
| Dagar efter injektion | ingen injektion | insekt saltlösning | Lösningsmedel för 20E-lösning | |
| Försök 1 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| Dag 1 | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| Day5 | 14/15 | 13/15 | 11/15 | |
| Dag7 | 14/15 | 12/15 | 15/09 | |
| Försök 2 | Day0 | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| Dag 1 | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| Day5 | 15/15 | 11/15 | 12/15 | |
| Dag7 | 14/15 | 10/15 | 12/15 |
Tabell 2: Överlevnad av bin som injicerats med lösningsmedel för 20E lösning. Femton arbetare framställdes i varje försöksgrupp.
| Dagar efter applicering | Aceton | metopren | |
| Försök 1 | dag 0 | 07/07 | 08/08 |
| dag 7 | 07/07 | 08/06 | |
| Försök 2 | dag 0 | 07/07 | 08/08 |
| dag 7 | 07/07 | 08/08 |
Tabell 3: Överlevnad av bin som behandlats med metopren Sju till åtta arbetare framställdes i varje försöksgrupp..
| Dagar efter injektion | ingen injektion | Aceton / Bee saltlösning (1: 4) |
| dag 0 | 15/15 | 15/15 |
| Dag 1 | 15/15 | 15/06 |
| dag 3 | 15/15 | 15/05 |
| dag 5 | 15/15 | 15/04 |
| dag 7 | 15/15 | 15/04 |
Tabell 4: Överlevnadsgrad av bin injicerade med aceton / bi saltlösning (1: 4). Lösningen Femton arbetare framställdes för varje experimentgrupp. Aceton / bi saltlösning (1: 4) lösning injicerades i arbetaren buken. Sammansättningen av bee saltlösning är 130 mM NaCl, 6 mM KCl, 4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 160 mM sackaros, 25 mM glukos och 10 mM HEPES (pH 7,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framställning av en enda cohort kolonier
Här har vi beskrivit det protokoll som används i vår tidigare studie 16 att förbereda enda kohort kolonier för analys av HPG fysiologi i samband med övergången i rollen som arbetstagare bin. Sjuksköterska bin och brådmogen hackar som uppfyllde de kriterier som beskrivs i försök 1,6-1,7 och Figur 2 observerades i en enda kohort kolonier (tabell 1). Fotografierna i figur 2 skulle vara användbar i klassificering av HPG uppger som en referens. Kriterier som bygger på både arbetare beteende och HPG utveckling gäller för att definiera sjuksköterska bin eller hackar i typiska kolonier. Roll övergång från omvårdnad till födosök sker gradvis i dessa kolonier: den tid som tillbringas i omvårdnad beteende gradvis avtar medan den i födosöksbeteende successivt ökar under rollen Shift 2. Således skulle det vara svårt att samla arbetare som uteslutandeutföra omvårdnad eller föda med bara beteende kriterier. Det innebär att uttrycket av mrjp2 och Hbg3 i HPGs är förknippad med den roll som arbetarna visar tydligt att det protokoll som beskrivs här kan antas att undersöka HPG fysiologi sjuksköterska bin och brådmogen hackar från enkel kohort kolonier (Figur 3). Kriterier som bygger på både arbetare beteende och HPG utveckling skulle också kunna tillämpas för att definiera sjuksköterska bin och brådmogen hackar från en enda kohort kolonier. Förutom de HPGs, andra exokrina körtlar i huvudet genomgå fysiologiska förändringar i samband med rollen skift. Till exempel, funktionen hos de mandibular körtel förändringar från syntesen av fettsyror för yngel mat till syntesen av alarmferomon 2-heptanon 2. Protokollet som beskrivs här kan således anpassas för att undersöka vilken roll associerade fysiologi andra än de HPGs exokrina körtlar.
Framgångsrik insamling av nurse bin och brådmogen hackar från en enda kohort kolonier beror på insamling av ett tillräckligt antal nykläckta arbetstagare när kolonierna är beredda. Om ett lågt antal nyligen framkommit arbetare samlas, skulle det vara svårt att samla in tillräckligt sjuksköterska bin och brådmogna hackar. Dessutom är villkoret för drottningar annan viktig punkt för en lyckad provsamling. Queens med en stor mage är bra för att lägga ägg eftersom dessa drottningar vanligtvis har utvecklats äggstockar. Således är arbete av arbetare tros vara effektivt delas även i enkel kohort kolonier eftersom kullen är ständigt matas av drottningen. Om ingen kull tillförs, skulle det vara svårt att samla in sjuksköterska bin från singel-kohort kolonier. Slutligen markerar arbetstagare som använder affischfärg krävs för att se till att arbetstagare samlas in från en enda cohort kolonier, eftersom fält ibland tillbaka till fel kolonin. Att samla brådmogna hackar ett effektivt sätt bör färgmärken varatillämpas på så många arbetstagare som möjligt (mer än 900 nykläckta arbetare per enkel kohort koloni). Användning av vattenbaserat bläck för märkning kan rekommenderas, eftersom ett oljebaserat bläck, som vanligtvis innehåller flyktiga organiska föreningar, kan störa den kemiska kommunikationen mellan bina. De vattenbaserade bläck märken inte blekna mycket under experimentet.
Hormonbehandling
Vi beskrev också protokollet för att injicera 20E i huvudet på arbetarna att undersöka effekten av ecdyson på HPG fysiologi (mrjp2 och Hbg3 uttryck). Överlevnadsgraden för bin injicerats med insekt saltlösning eller lösningsmedel för 20E lösning var tillräcklig för den efterföljande analysen, vilket indikerar att det protokoll som beskrivs här för injektion med användning av en injektions spets och vätska till 20E lösning kan antas för 20E injektions experiment (Tabell 2 ). Dessutom jämförelse av genuttryck i HPGsmellan 20E-behandlade bin och kontroll bin indikerade att den injicerade 20E förändrat uttryck av mrjp2 och Hbg3, vilka båda är relaterade till HPG funktion (Figur 5). Detta resultat tyder på att det protokoll som beskrivs här skulle vara användbar för att undersöka effekterna av ecdyson på HPG fysiologi, och kan antas för att undersöka andra exokrina körtlar i huvudet, såsom mandibular körtlar. Vidare kan injektionsmetoden antas för injicering av andra kemikalier. Till exempel skulle det protokoll som beskrivs här vara lämpligt för insprutning dubbelsträngade RNA-lösningar in i huvudet för genen knockdown experiment.
Förutom 20E, beskrev vi ett protokoll för att applicera metopren, som är en JH-analog. Metopren vanligen appliceras på buken. Å andra sidan, var metopren appliceras på huvudet för arbetstagare, här. Nästan alla bin med lokal applicering av metopren eller aceton levde 7 dagar efter behandling, Vilket tyder på att tillämpningen av 5 ul metopren eller acetonlösning till cheferna har liten effekt på arbetstagare överlevnad (Tabell 3). Vidare jämförelse av mrjp2 och Hbg3 expression i de HPGs mellan methoprene- och acetonbehandlade bin indikerar att metopren ansökan inhiberar mrjp2 uttryck och förstärker Hbg3 expression (figur 6). Dessa resultat tyder på att det protokoll som beskrivs här är lämplig för att analysera effekterna av metopren på fysiologi exokrina körtlar såsom HPGs i huvudet.
Framgångsrik hormonbehandling beror på överlevnaden av behandlade bin. Låg temperatur exponering i kylskåp kan vara lämpligt för anesthetizing bin. Anestesi på is rekommenderas inte eftersom bina blir våt på isen, vilket leder till en låg överlevnad. Dessutom kan injektionsmetoden vara en annan viktig punkt för att hålla bin liv. Det är viktigt att make insprutningsspetsen lång och tunn, och att forma den till en vass spets med hjälp av skäraren för att minimera skador på bina genom injektion. Men kanske injektionsmetoden inte vara lämplig för att undersöka effekterna av metopren på HPG fysiologi, eftersom acetonlösningsmedlet för metopren påverkar bee överlevnad (Tabell 4) negativt. Dessutom kan den injektionsmetod som beskrivs här inte är lämpligt för beteendeanalys i kolonier som injicerade bin skulle uteslutas från sina kolonier när de återinförs efter injektionen. Arbetare med lindrig skada kan uteslutas från kolonierna. Andra metoder, såsom applicering eller oral administrering av hormon kan vara lämplig för beteendeanalys.
Den enda kohort koloni har använts för att undersöka regleringen av arbetsfördelningen av arbetsbin 10,11. Dessutom har behandlingen med ungdoms hormon använts för undersökning av beteende och hjärn functipå relaterade till arbetsdelningen 11. Men detaljerade protokoll för både framställning av single-kohort kolonier och behandling med JH har inte tillhandahållits tidigare i sådan detalj. Nyligen vikten av ekdyson i arbetsfördelningen blir alltmer erkänns, och regleringen av arbetsdelningen både JH och ekdyson föreslås 23. De detaljerade protokoll för utarbetandet av ett enda kohort kolonier och hormonbehandling som JH och ekdyson beskrivs i denna artikel kan bidra till framsteg i studien av arbetare fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. The insect societies. , Harvard university press. (1971).
- Winston, M. L. The biology of the honey bee. , Harvard university press. (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
