Summary
Burada tek kohort bal arısı kolonilerinin hazırlanması için detaylı protokol açıklar - rol ilişkili işçi fizyolojisi analiz etmek için kullanışlı bir araç. Biz de işçi davranışı ve / veya fizyoloji düzenlenmesinde bu hormonların katılımını değerlendirmek jüvenil hormon ve ekdisonla işçileri tedavisi için ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.
Introduction
Avrupa bal arısı, Apis mellifera, son derece örgütlü bir toplumda 1 ile eusocial böcek olduğunu. İşçi bal arıları (emek kast) koloni etkinliğini sürdürmek için çeşitli görevler yapan ve bu görevleri emek 2-4 yaşa bağlı bölümü olarak adlandırılır eclosion sonra işçi bal arısı yaşına göre değişir. Genç işçiler (<13 gün) yaşlı işçiler ise, arı sütü (hemşire arılar) salgılayarak kovandaki yavru özen (> 15 gün) kovanı (silaj) 2-4 dışındaki nektar ve polen toplamak. İşçilerin fizyolojisi bu rol kayması ile birlikte değişir. Örneğin, hipofaringeal bezleri (HPGler) işlevi, 2,5 kazarak için hemşirelik rol kayması ile birlikte egzokrin kafasında bulunan bezleri, değişiklikleri eşleştirilmiş. Hemşire arı HPGler ağırlıklı arı sütünün en önemli bileşenleri olan büyük arı sütü proteinleri sentezler. Öte yandan, toplayıcı HPGler ağırlıklıglukoz ve fruktoz halinde sakaroz dönüştürerek bal içine nektar işlemek için, bu tür α-glukosidaz III olarak karbonhidrat metabolize edici enzimleri, sentez. Daha önceki çalışmalar ortaya koydu rolü kayması 6-9 içinde α-glukozidaz III değişiklikleri kodlayan önemli bir arı sütü protein ve Hbg3 kodlayan mrjp2 ekspresyonu.
HPGler dahil işçi dokularda fizyolojik değişiklikler, rol kayması veya işçilerin yaş ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için, tek kohort hazırlamak için gibi, bir arı kolonisinin nüfusu kompozisyonunu işlemek için yararlı olacaktır koloniler hangi neredeyse aynı yaştaki işçiler farklı görevleri 10,11 gerçekleştirin. Robinson ve ark. (1989), tek bir kohort koloni 10 oluşturulması için bir yöntem açıklamıştır. Tek kohort koloniler başlangıçta bir kraliçe ve 0-2 gün eski işçileri kapsar. Birkaç gün koloniler kurduktan sonra, alm işçileriAynı yaşta ost farklı görevler üstlenecek. Diğer işçiler her zamankinden daha erken toplayıcı görevleri gerçekleştirmek ve böylece erken silaj denir oysa Bazı işçiler, tipik koloniler olarak hemşirelik görevleri gerçekleştirmek. Hemşire arılar ve erken toplayıcılar arasındaki gen ifadesi karşılaştırmaları işçi dokuların 12-16 rolü ile ilişkili fizyolojisi hakkında yararlı bilgiler sağlayacaktır. Burada, HPGler 16 rol ve / veya yaşa bağlı fizyoloji analizi için tek bir kohort koloniler hazırlamak için detaylı bir protokol açıklar. Ayrıca kısa bir süre HPG fizyolojisi değerlendirmek için niceliksel ters kopyalama-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile mrjp2 ve Hbg3 gen ekspresyonunu incelemek için açıklanmıştır.
Tek kohort kolonilerinde işçi fizyolojisi analizine ek olarak, endokrin sistemin incelenmesi rol ilişkili işçi fizyolojisi düzenleyici mekanizmaların analiz etmek için önemlidir. kullanımları bilinmektedir Jüvenil hormon (JH),Böcek larvaları 'statükonun' hormon gibi wn, işçi bal arılarının 11 kazarak için hemşirelik rolü kayması hızlandırır. Ayrıca, metamorfoz sırasında tüy dökümü hormonu olarak bilinen ekdison, mantar organları işçi beynin 17-19 daha yüksek bir merkezi ifade edilir ekdison sinyal molekülleri kodlayan genlerin olarak rol kayması dahil olabilir. Bu nedenle, biz de HPG fizyolojisi üzerindeki endokrin sistemin etkisinin analizi (ifadesi için ayrıntılı ekdisonla aktif formudur 20E işçileri tedavi önceki çalışmamızda 16 kullanılan protokol, ve methopiren, bir JH analog tanımlamak mrjp2 ve Hbg3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tek kohort Kolonileri 1. Hazırlık
- Üç balarısı kolonilerinin iki tek-kohort koloniler oluşturmak ve yeni ortaya çıkan işçilerin yeterli sayıda elde etmek için hazırlayın.
- peteklerde şapkalı periferik hücrelerde bazı pupa kahverengi gözleri ve cımbız kullanarak şapkalı tarak açarak bir pigmentli manikür olup olmadığını kontrol edin. Bu pupa periferik tarak hücrelerinde varsa, bütün peteklerde pupa çoğu yaklaşık 1-3 gün içinde ortaya çıkacaktır.
- Daha sonra, tüm yapışık yetişkin arıların bir fırça ile temizlendikten sonra bu pupa içeren petekleri toplamak ve koloniler arasında değişkenliği en aza indirmek için üç koloniler tarakları karıştırın.
- boş kovanı kutusunda toplanır tarak yerleştirin ve nemli koşullar altında 33 ° C (>% 60 nispi nem) inkübe edilir. Toplanan tarak 3 gün (koloni başına 3.000 işçi) üzerinden yaklaşık 6.000 yeni ortaya çıkan işçileri toplayın.
- worke miktarını belirlemekBeş yeni ortaya işçi ağırlığına göre RS rastgele unmanipulated koloniler toplanmıştır.
- rastgele tartı makineleri kullanarak unmanipulated koloniler toplanan beş yeni ortaya çıkan işçileri tartılır.
Not: Beş yeni çıkan işçilerin ağırlığı genellikle 500-600 mg olduğunu. - Beş yeni ortaya çıkan işçilerin ortalama ağırlığı ile toplanan işçilerin ağırlığı bölünmesiyle tarafından toplanan işçilerin miktarını tahmin edin.
- rastgele tartı makineleri kullanarak unmanipulated koloniler toplanan beş yeni ortaya çıkan işçileri tartılır.
- su bazlı afiş boya işaretlerini kullanarak yaklaşık 1.800 işçi (koloni başına 900 işçi) ve thoraces boya işaretleri uygulayın.
Not: Yıkanabilir işaretleyici boya uygulamak için kullanılan Malzemelerin Tablo listelenir. - İki tarak, bir tarak içeren bal ve korunmuş gıdalar gibi polen ve yumurta döşeme kraliçe tarafından başka bir boş tarak içeren yeni bir kovan kutusuna bir kraliçe ve yaklaşık 3.000 0-2 gün eski işçilerin tanıtmak. bal ve polen fr içeren tarağı toplamakom tüm yapışık arıların sonra başka unmanipulated koloni kaldırılır.
Not: Nükleer kovan kutusunun (küçük ölçekli kovanı kutusu) kullanılması tavsiye edilir. - Tek kohort koloniler oluşturduktan sonra 6 ila 8 gün boya işaretleri ile hemşire arılar ve erken silaj toplayın.
- , Hemşire arıları toplamak kuluçka dikkat çekmek için tarak hücrelere başlarını koymak işçileri almak için. Birçok yavru ve yetişkin işçilerin ihtiva tarak gelen hemşire arıları toplamak için cımbız kullanın.
Not: Adım 1.7'de açıklandığı gibi disseke zaman toplanan işçilerin HPGler geliştirilmesi halinde, bu işçilerin hemşire arılar olarak tanımlanır. cımbız ile thoraces tutan tarak işçileri almak için tavsiye edilir. - silaj toplamak için, kendi arka ayakları üzerinde polen yükleri ile kendi kovanlarına geri işçileri yakalamak için bir böcek net kullanabilirsiniz.
Not: Adım 1.7'de açıklandığı gibi disseke zaman yakalanan işçilerin HPGler büzülmüş görünüyorsa, bu işçiler toplayıcılar olarak tanımlanmaktadır.
- , Hemşire arıları toplamak kuluçka dikkat çekmek için tarak hücrelere başlarını koymak işçileri almak için. Birçok yavru ve yetişkin işçilerin ihtiva tarak gelen hemşire arıları toplamak için cımbız kullanın.
- clasüç gruba, 'Gelişmiş', 'Intermediate' içine HPG yoğunlaştıracaktır ve stereomikroskop altında diseksiyon tarafından 'Büzüşük'.
- Arılar sinek ya da yürüyemiyorum kadar 10-15 dakika buzdolabında bir böcek kafes içinde 10-15 arılar anestezisi. Daha sonra, buz üzerine arılar taşımak ve 5 dakika boyunca buz üzerinde anestezi doldurun.
Not: anestezi elde etmek için toplam 15-20 dakika sürer. Anestezi süresi kısalır gerekiyorsa, bir kafes içinde arıların sayısı kafes başına 1-3 arılar için azaltılmalıdır. - makas ve cımbız ile vücuttan kafa teşrih. iğneler ile bir Petri kabı üzerine yerleştirilen diş mumu üzerine kafa sabitleyin. kafa düzeltmek için anten üsleri İki işaretçilerine yerleştirin. Böcek tuzlu su (130 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM CaCl2) sabit kafaları bekletin.
- binoküler mikroskop altında ince cımbız kullanarak baş ve cerrahi bıçak manikür ön yönünü çıkarın.
Not: HPGler kolay C çıkarılmasından sonra baş bulunabiliruticle. HPG baş beynin etrafında var olan bir botryoid organdır. - manikür altında beyaz bir zar doku trakeal doku çıkarın. Sonra, yavaş yavaş cımbız ile çekerek baş HPGler incelemek.
- 'Gelişmiş' gibi büyük ve yuvarlak asinüs ile HPGler sınıflandırır. 'Büzüşük' gibi küçük ve bozuk asinüs ile HPGler sınıflandırır. HPGler 'Intermediate' olarak ne 'geliştirildi' ne de 'Büzüşük' tekabül sınıflandırır.
Not: HPG devletlerin bu üç sınıf Şekil 2'de gösterilmiştir göstermektedir Temsilcisi fotoğraf. - Konu 'geliştirilen' ve RNA ekstraksiyonu için 'Büzüşük' HPGler sırasıyla ve hemşire arılar ve toplayıcılar (bölüm 4) arasındaki HPGler gen ifadesini karşılaştırın hemşire arı HPGler 've' silaj makina HPGler '.
- Arılar sinek ya da yürüyemiyorum kadar 10-15 dakika buzdolabında bir böcek kafes içinde 10-15 arılar anestezisi. Daha sonra, buz üzerine arılar taşımak ve 5 dakika boyunca buz üzerinde anestezi doldurun.
20E 2. Enjeksiyon
- descr gibi tipik kolonilerden hemşire arıları toplamakprosedür 1.6.1 anlatılagelmiştir.
Not: Arılar yetiştirilen olacak gibi HPGler bu arılar incelenebilir edilemez. - Bir buzdolabı (buz ile ilgili) 'de 4 ° C' de arı anestezisi.
Not: anestezi elde etmek için yaklaşık 30 dakika sürer. Anestezi süresi kısalır ise, kafes içinde arıların sayısı kafes başına 1-3 arılar için azaltılmalıdır. - cımbız kullanarak, Petri kabı üzerine yerleştirilen diş mumu üzerinde arı hareketsiz.
- Bir cam iğne çektirmenin kullanarak kalibre kılcal mikropipet yapılan bir enjeksiyon ucu kullanarak başın ön yüzünde içine 20E solüsyonu 1 ul enjekte edilir.
- Etanol böcek tuzlu su içinde (130 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM CaCl2) karışımı 20E çözülür (1: 4) 2.5 ug / ml.
- Bir lastik tüp enjeksiyon ucu bağlayın ve tüpün karşı tarafında sarı bir mikropipet ucu bağlayın.
- Bir, bir mikropipet kullanarak parafilm üzerindeki 20E solüsyonu 1 ul koyun ağızda sarı mikropipet ucu tutunenjeksiyon ucu içine çözümü çizmek d.
- antenlerin taban içine enjeksiyon ucu takın ve sarı mikropipet ucu ile üfleyerek çözüm enjekte.
Not: Bu adımda gösterilen Protokol Örnek enjeksiyon yöntemi, ancak otomatik enjeksiyon makinesinin kullanımı 20 gerekli güvenliği için tavsiye edilir.
- Arka 1 veya 3 gün boyunca karanlık ve nemli koşullarda (>% 60 bağıl nem) altında 33-36 ° C'de böcek kafeslerde enjekte arılar (ideal sıcaklık 35 ° C). Tedarik bal-su karışımı (1: 1) arılara. Gerekirse, enjeksiyondan sonra arılar hayatta sayılır.
Methopiren 3. Uygulama
- tüm yapışık yetişkin arıların bir fırça ile çıkarıldıktan sonra tipik kolonilerden pupa ihtiva taraklar toplayın. 33-36 ° C'de tarakları inkübe 1 gün öncesine kadar için nemli ortamlarda (>% 60 bağıl nem) (ideal sıcaklık 35 ° C).
- 6 gün sonra, koloniler (6 gün eski) boyalı işçileri toplamak. cımbız ile thoraces tutarak tarak boyalı işçileri Pick up.
- prosedür 2.2 olarak (buz ile ilgili) bir buzdolabı içinde 4 ° C'de arılar anestezisi. cımbız kullanarak, bir Petri tabağına konmuş diş mumu arıların hareketsiz bir mikropipet kullanılarak başlarına asetonda çözündürüldü metopiren çözeltisi (50-250 mg / ml) 1-5 ul geçerlidir. aseton dirençli olan bir filtre ucu kullanın.
Not: Aseton ölüme yol açan arılar üzerinde zararlı etkileri olabilir. arı yüksek mortalite gözlenirse, en az 1 ul aseton hacmi azaltılması önerilir. - Arka 33-36 ° C (ideal bir ton böcek kafeslerde arılaremperature karanlık ve nemli koşullar altında 7 gün süreyle 35 ° C) (>% 60 nispi nem) 'dir. Tedarik bal-su karışımı (1: 1) arılara. Gerekirse, topik uygulamadan sonra arı kalan sayısı.
Not: Bu yazıda, hayatta kalan arılar 7 gün uygulama (Tablo 3) sonra sayılır.
4. RNA ekstraksiyonu ve kantitatif RT-PCR
- Arılar uyutmak ve 1.7.4'e adımları 1.7.1 açıklandığı gibi HPGler teşrih.
- kullanılıncaya kadar -80 ° C'de kuru buz ve mağaza bir mikrosantrifüj tüp disseke HPGler toplayın.
- Protein denatürasyonu için reaktif 400 ul ekle.
Not: bu madde (Malzeme Tablo) ticari olarak mevcuttur. - Bir mikrosantrifüj tüp içinde uygun bir homojenizasyon havan tokmağı ile elektrikli karıştırıcı bir el kullanarak HPG dokuları homojenize. kırmak için buz ve lize doku hücreleri üzerinde 1 dakika boyunca yaklaşık 300 rpm'lik bir dönme hızında homojenize edilir.
(Malzeme Tablo). - 80 ul kloroform ekleyin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 14.170 x g'de mikrosantrifüj tüpleri santrifüjleyin. yeni bir tüpe sulu faz transfer. izopropanol ve 1 ul glikojen (5 mg / ml) eşit hacim. En az 20 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.170 x g'de mikrosantrifüj tüpleri santrifüj ve supernatant çıkarın.
- pelet% 75 etanol içinde 400 ul ilave edin ve iyice karıştırın, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 14.170 x g'de mikrosantrifüj tüpleri santrifüj ve supernatant çıkarın. bir kez daha bu işlemleri tekrarlayın.
- 5-10 dakika boyunca pelet hava kuru ve daha sonra 10 mL RNaz içermeyen su içinde çözülür.
Not: pelet tam kuruma suyun RNA pellet çözünmez neden olabilir. Bu nedenle, hafif ıslak topak için uyguneritme. - NanoDrop veya benzeri gibi bir spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu ölçümü.
- Herhangi bir bulaşık genomik DNA'yı, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek DNase 2.0 U toplam RNA 500 ng tedavi edin.
- Ters-transkribe DNase I ile tedavi edilen RNA, 200 ng ve ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak gerçek zamanlı PCR yapmak ve gene-özel tetikleyiciler (mrjp2 (Malzemeler ve Reaktifler Tablo l'de liste), 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', ve 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 've 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). aşağıdaki gibi PCR gerçekleştirin: [95 ° C x 30 sn + (95 ° C x 5 saniye + 60 ° C x 15 saniye + 72 ° C x 20 sn) 45-55 döngüleri x].
- Uzama faktörü 1α-F2 (EF1α˗F2) ya da ribozomal proteini 49 (rp49) 9,16,21,22 bu ile transkript miktarı normalize. Bu genler güvenilir kontrol gr vardırMah-PCR ile HPGler gen ifadesini analiz etmek için enes.
- İstatistiksel yazılımı kullanarak iki deney gruplarında (hemşire arılar vs erken toplayıcılar, kontrol arılar vs 20E-tedavi arılar ve kontrol arılar vs methopiren tedavi edilen arı) arasında önemli farklılıklar tespit etmek için iki kuyruklu t-testi yapın.
Not: F-testi varyans homojenliğini kabul durumunda, Student t-testi kullanılır. Değilse, Welch t-testi kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek kohort koloniler hazırlanması için mFLINT Şekil 1A'da gösterilmiştir. Koleksiyonu örnek tek kohort koloniler hazırlamaktan deneylerin Zaman kurs Şekil 1B gösterilmiştir. Hemşirelik davranış veya toplayıcı davranış için davranışsal kriterleri karşılayıp işçiler tek kohort koloniler toplanmıştır ve HPG gelişme bu işçilerin tahmin edilmiştir Tablo 1 üç gruba HPG gelişme sınıflandırılmasını göstermektedir.; boyutuna göre 'geliştirilen', 'Intermediate' ve 'Büzüşük'. HPGler bu üç sınıf gösteren Örnek fotoğrafları Şekil 2'de gösterilir. Sonuçları hemşire arı ve erken yem iki protokolde tarif edilen kriterlere göre, aynı zamanda, tek bir kohort koloniler görülmüştür göstermektedir. HPGler içinde mrjp2 ve Hbg3 İfadesi oldu trHPG fonksiyonu işçinin rolü (Şekil 3) 16 ile ilişkili olduğunu gösteren sırasıyla hemşire arılar ve erken toplayıcılar, içinde riched.
Alt kafasında 20E enjekte edilmesi için prosedür. Şekil 4'te gösterilmiş olup, hayatta kalan arı 5 ve 7 gün hayatta incelenmesi için enjeksiyondan sonra 1 sayıldı böcek tuzlu su veya 20E deneyden önce 20E çözümü için çözücü enjekte arıların oranı. Enjeksiyondan 7 gün sonra, enjekte edilen arıların yaklaşık% 60-80 hayatta ve 20E çözeltisi için çözücü, enjekte arıların hayatta kalma oranı, böcek tuzlu su (Tablo 2) ile karşılaştırılabilir. 20E enjeksiyonun etkisi (Şekil 5) 16 HPGler hem mrjp2 ve Hgb3 ekspresyonunu azalmıştır. 20E, mrjp2 ve Hbg3 topikal metopiren uygulanmasının etkisinin yanısıra (Tablo 3) 7 gün sonra hayatta kaldı. Diğer taraftan, arıların, sadece yaklaşık olarak% 20 ila% 30 enjekte aseton / arı tuzlu su (1: 4) kalan arı 5 ve 7 gün sonra aynı, 3, 1 sayıldığında Çözelti 7 gün enjeksiyonundan sonra hayatta (Tablo 4) . Böylece, methopiren tedavisi için uygulama yöntemi benimsenmiştir. Metopren uygulanması mrjp2 ekspresyonunu inhibe (Şekil 6) 16 Hbg3 ekspresyonunu artırmıştır.
Tek kohort koloni deney Şekil 1. Genel. (A) Plan Tek kohort koloniler hazırlamak için. (B) Deney Zaman ders e haz gelenhemşire arılar ve erken silaj toplama g tek kohort koloniler. Yatay ok tek kohort sömürgelerde bir işçi ömür boyu seyrini göstermektedir. dikey çizgilerle Numaraları işçi yaşını belirtin. Büyümüş de küçülmüş silaj ama aynı zamanda aşırı yaşlanmış hemşire arılar (28-32 gün) Sadece tek kohort koloniler 15 bulunabilir bildirildi. Bu çalışmada yapılan olmamasına rağmen Böylece, aşırı yaşlanmış hemşire arı ve toplayıcılar arasındaki fizyoloji karşılaştırılması, tek kohort koloniler yapılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
HPG devletlerin üç sınıfları gösteren Şekil 2. Fotoğraf. Geliştirilen (A), Orta Düzey (B) ve büzülmüş (C Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Rol ilişkili tek kohort kolonilerden işçilerin HPGler içinde mrjp2 ve Hbg3 ifadesini. Grafik, iki tek-grup co hemşire arı (N) ve erken toplayıcılar (PF) arasındaki HPGler olarak mrjp2 (A) ve Hbg3 (B) mRNA seviyelerinin bir karşılaştırmasını gösterirlonies. Her bir genin mRNA düzeyi ribosomal protein 49 (rp49) o ile normalize edildi. Hemşire arı HPGler her genin göreceli mRNA düzeyi bazı erken toplayıcılar içinde mrjp2 mRNA düzeyi nedeniyle algılama eşiği daha düşük sinyal yoğunluğu tespit edilememiştir 1 olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, örneklerin sayısı genleri arasında farklılık gösterir. Bağıl mRNA düzeyleri standart hata ile gösterilir. Yıldız hemşire arılar ve erken toplayıcılar arasında önemli farklılıklar göstermektedir (* p <0.05; t-testi). Bu rakam Ueno ve ark çoğaltılamaz olmuştur. (2015) 16. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
20E injec için protokol Şekil 4. Şemayon. Prosedürler 2.3 ve protokol bölümünde 2.4 Bu şekilde gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil HPGler 16 mrjp2 ve Hbg3 ifadesi üzerindeki 20E enjeksiyon 5. etkisi. Grafik mrjp2 mRNA seviyelerinin bir karşılaştırmasını göstermektedir 20E ile muamele arı (20E +) ve kontrol arı (20E-) arasındaki HPGler olarak (A) ve Hbg3 (B). Grafiğin altında Sayılar 20E tedaviden sonra bir gün gösterir. Her bir genin mRNA düzeyi uzatma faktör 1α-F2 (EF1α-F2) buna normalize edildi. Bağıl mRNA düzeyi1. Bağıl mRNA düzeyleri bir standart hata ile gösterilir gibi kontrol arı HPGler her gen tanımlandı. Yıldız işareti 20E ile muamele arı ve kontrol arılar arasında önemli bir fark olduğunu gösterir (* p <0.05, t-testi). Bu rakam Ueno ve ark çoğaltılamaz olmuştur. (2015) 16. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil HPGler 16 mrjp2 ve Hbg3 ifadesi üzerindeki metopiren uygulamasının 6. etkisi. Grafik metopren ile muamele arı ve kontrol arılar arasında HPGler olarak mrjp2 (A) ve Hbg3 (B) mRNA seviyelerinin karşılaştırmasını göstermektedir.Her bir genin mRNA düzeyi EF1α-F2 bununla normalize edildi. 1. Göreli mRNA düzeyleri standart hata ile gösterilir gibi kontrol arı HPGler her genin göreli mRNA düzeyi tanımlanmıştır. Yıldız methopiren tedavi edilen arılar ve kontrol arılar arasında önemli farklılıklar göstermektedir (* p <0.05; t-testi). Bu rakam Ueno ve ark çoğaltılamaz olmuştur. (2015) 16. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Koloni No | gözlemlenen davranış | Her HPG sınıfta bireylerin sayısı | |||
| Gelişmiş | Orta düzey | çekmiş | Genel Toplam | ||
| 1 | hemşirelik | 8 | 1 | 1 | 10 |
| toplayıcılık | 0 | 4 | 7 | 11 | |
| 2 | hemşirelik | 4 | 2 | 0 | 6 |
| toplayıcılık | 0 | 0 | 5 | 5 | |
Tablo 1: hemşirelik veya beslenme davranış biçimi tek kohort koloniler gözlendi işçilerin HPGler sınıflandırılması. HPG iki tek-kohort koloniler işçilerin boyutu (koloni nos 1 ve 2). Üç sınıfa ayrılmıştır edildi; 'Gelişmiş', 'Intermediate' ve boyutuna göre 'Büzüşük'.
| Gün enjeksiyondan sonra | hiçbir enjeksiyon | böcek tuzlu | 20E çözelti için çözücü | |
| deneme 1 | 0 Gün | 15/15 | 15/15 | 14/15 |
| 1.gün | 15/15 | 14/15 | 13/15 | |
| Day5 | 14/15 | 13/15 | 11/15 | |
| day7 | 14/15 | 12/15 | 9/15 | |
| deneme 2 | 0 Gün | 15/15 | 15/15 | 15/15 |
| 1.gün | 15/15 | 13/15 | 15/15 | |
| Day5 | 15/15 | 11/15 | 12/15 | |
| day7 | 14/15 | 10/15 | 12/15 |
Tablo 2: 20E çözüm için çözücü enjekte arıların yaşama oranı. On beş işçi her bir deney grubu hazırlanmıştır.
| Günlük uygulama sonrası | aseton | methopiren | |
| deneme 1 | gün 0 | 7/7 | 8/8 |
| 7. gün | 7/7 | 6/8 | |
| deneme 2 | gün 0 | 7/7 | 8/8 |
| 7. gün | 7/7 | 8/8 |
Tablo 3:. Ile methopiren yedi sekiz işçiler her deney grubunda hazırlanmıştır tedavi arıların yaşama oranı.
| Gün enjeksiyondan sonra | hiçbir enjeksiyon | Aseton / Arı tuzlu su (1: 4) |
| gün 0 | 15/15 | 15/15 |
| 1.gün | 15/15 | 6/15 |
| gün 3 | 15/15 | 5/15 |
| 5. gün | 15/15 | 4/15 |
| 7. gün | 15/15 | 4/15 |
Tablo 4: (1: 4). Çözelti onbeş işçi her bir deney grubu için hazırlanır aseton / arı salin enjekte arıların yaşama oranı. Aseton / arı tuzlu su (1: 4) solüsyonu alt karın içine enjekte edilmiştir. Arı tuz bileşimi 130 mM NaCI, 6 mM KCI, 4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 160 mM sakaroz, 25 mM glükoz ve 10 mM HEPES (pH 7.0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek kohort koloniler hazırlanması
Burada işçi arıların rolü kayması ile ilişkili HPG fizyolojisi analizi için tek kohort koloniler hazırlamak için önceki çalışmamızda 16 kullanılan protokol nitelendirdi. Prosedürler 1.6-1.7 ve Şekil 2'de açıklanan kriterleri karşılayıp Hemşire arılar ve erken silaj tek kohort koloniler (Tablo 1) gözlendi. HPG sınıflandırılması referans olarak devletler Şekil 2'de fotoğraf yararlı olacaktır. işçi davranışı ve HPG gelişimi hem dayalı Kriterleri tipik koloniler halinde hemşire arılar veya silaj tanımlamak için geçerlidir. Yavaş yavaş yiyecek arama için hemşirelik rol kayması, bu koloniler halinde ilerler: o toplayıcı davranış kademeli olarak rol kayması 2 sırasında artırırken hemşirelik davranış harcanan zaman miktarı giderek azalır. Böylece, işçileri o sadece toplamak için zor olurduSadece davranışsal kriterlere göre hemşirelik veya yağmalama gerçekleştirin. HPGler içinde mrjp2 ve Hbg3 ifadesi işçilerin rolü ile ilişkili olduğu sonucu açıkça Burada açıklanan protokol tek kohort kolonileri hemşire arılar ve erken toplayıcılar (Şekil 3) HPG fizyolojisini incelemek için kabul edilebilir olduğunu gösterir. işçi davranışı ve HPG gelişimi hem dayalı Kriterleri de tek kohort kolonileri hemşire arılar ve erken silaj tanımlanmasında geçerli olabilir. HPGler ek olarak, baş diğer ekzokrin bezler rol kayması ile birlikte fizyolojik değişikliklere uğrarlar. Örneğin, alarm feromon 2-heptanon 2 sentezine kuluçka gıda yağlı asitlerin sentezi ile ilgili çene bezi değişikliklerin işlevi. Burada açıklanan protokol böylece HPGler dışındaki ekzokrin bezlerin rolü ile ilişkili fizyolojisini incelemek için adapte edilebilir.
n Başarılı koleksiyonKoloniler hazırlanır zaman tek kohort kolonilerden URSE arılar ve erken silaj yeni ortaya çıkan bir işçi yeterli sayıda koleksiyonu bağlıdır. Yeni ortaya çıkan bir işçi sayısının düşük toplanır, hemşire arılar ve erken silaj yeterli toplamak zor olurdu. Ayrıca, kraliçeler durumu başarılı örnek toplanması için bir başka önemli noktadır. Büyük bir karın Queens bu kraliçeler genellikle yumurtalıkların geliştirdik çünkü yumurtlayarak için iyidir. Böylece, işçilerin emek kuluçka sürekli kraliçe tarafından sağlanan çünkü etkili bir şekilde tek kohort kolonilerinde bile bölünmüş olduğu düşünülmektedir. Hiçbir yavru verilirse, o tek kohort kolonileri hemşire arıları toplamak için zor olurdu. silaj bazen yanlış koloni dönmek çünkü nihayet, afiş boya kullanarak işçileri işaretleme, işçiler tek kohort koloniler toplanan sağlamak için gereklidir. etkin bir şekilde büyümüş de küçülmüş silaj toplamak için, boya izleri olmalıMümkün olduğunca çok sayıda işçi (tek kohort koloni başına 900'den fazla yeni ortaya çıkan işçiler) uygulanır. genellikle uçucu organik bileşikler içeren bir yağ bazlı mürekkep, arılar arasındaki kimyasal iletişimi kesebileceği çünkü markalama su bazlı mürekkep kullanılması tavsiye edilebilir. su bazlı mürekkep işaretleri deney sırasında çok solmaz vermedi.
hormon tedavisi
Biz de HPG fizyolojisi (mrjp2 ve Hbg3 ifade) hakkında ekdisonla etkisini incelemek üzere işçilerin kafalarına 20E enjekte etmek için protokol nitelendirdi. Böcek tuz veya 20E çözümü için çözücü enjekte arıların hayatta kalma oranı 20E püskürtme deneyi (Tablo 2 benimsenebilir bir püskürtme ucu ve 20E, çözücü kullanarak protokol enjeksiyon burada tarif edilen işaret, bir sonraki analiz için yeterli ). Ayrıca, HPGler gen ifadesinin karşılaştırması20E ile muamele arı ve kontrol arılar arasına enjekte 20E mrjp2 HPG fonksiyonu ile ilgili her ikisi de Hbg3, (Şekil 5) ekspresyonunu değiştirdiğini göstermektedir. Bu sonuç, burada açıklanan protokol HPG fizyolojisi üzerindeki ekdisonla etkilerini incelemek için yararlı olacağını ve bu mandibuler bezleri gibi baş diğer ekzokrin bezleri, incelenmesi için kabul edilebilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, enjeksiyon yöntemi diğer kimyasal enjekte edilmesi için adapte edilebilir. Örneğin, burada açıklanan protokol gen yok etme deneyleri için kafalarına çift zincirli RNA çözümler enjekte edilmesi için uygun olacaktır.
20E ek olarak, bir JH analogudur metopren, uygulanması için bir protokol tarif. Metopren, genellikle karın uygulanır. Öte yandan, metopren, burada işçilerin başına uygulandı. Hemen hemen metopren veya aseton topikal uygulama ile arılar tedaviden 7 gün sonra hayatta, Kafalara 5 ul metopren veya aseton çözeltisinin bu uygulamayı düşündüren işçi sağkalım oranı (Tablo 3) üzerinde çok az etkisi vardır. Ayrıca, methoprene- ve aseton ile muamele edilmiş arılar arasında HPGler içinde mrjp2 ve Hbg3 ifade karşılaştırması metopiren uygulaması mrjp2 ekspresyonunu inhibe eden ve Hbg3 ekspresyonu (Şekil 6) geliştirdiğini gösterir. Bu sonuçlar Burada açıklanan protokol böyle baş HPGler olarak ekzokrin bezlerin fizyolojisi üzerine metopren etkilerini analiz etmek için uygun olduğunu göstermektedir.
Başarılı hormon tedavisi tedavi arıların hayatta kalma oranına bağlıdır. Buzdolabında Düşük sıcaklık maruz arıları anestezi için uygun olabilir. Arılar düşük hayatta kalma oranı neden buz üzerinde ıslak alacak çünkü buz üzerinde anestezi tavsiye edilmez. Ayrıca, enjeksiyon yöntemi canlı arılar tutmak için bir başka önemli noktası olabilir. Bu, m önemlidirEnjeksiyon ucu uzun ve ince, ve enjeksiyon yoluyla arılar hasarı en aza indirmek için kesici kullanılarak bir sivri uçlu onu şekillendirmek için AKE. Metopren için çözücü aseton olumsuz arı sağkalım (Tablo 4) etkiler çünkü Ancak, enjeksiyon yöntemi, HPG fizyolojisi üzerindeki metopren etkilerini inceleyen için uygun olmayabilir. Buna ek olarak, burada açıklanan enjeksiyon yöntemi, enjeksiyondan sonra yeniden başlatıldığında enjekte arılar koloniler dışında olacak gibi kolonideki davranışsal analiz için uygun olmayabilir. hafif yaralanma ile işçiler koloniler dışında olabilir. Bu hormon uygulama ya da oral uygulama gibi diğer yöntemler, davranış analizi için uygun olabilir.
Tek kohort koloni işçi bal arılarının 10,11 işbölümünün düzenlenmesi incelemek için kullanılır olmuştur. Buna ek olarak, jüvenil hormon ile tedavi davranışı ve beyin functi incelenmesinde kullanılmaktadıremeğin 11 bölümü ile ilgili üzerinde. Ancak, tek kohort kolonilerinin hazırlanması ve JH ile tedavi hem de ayrıntılı protokoller daha önce böyle detaylı bir şekilde temin edilmemiştir. Son zamanlarda, işbölümünde ekdisonla önemi giderek tanınan hale gelmektedir ve her ikisi de JH emek ve ekdisonla bölünme düzenleme 23 önerilmektedir. Tek kohort koloniler ve JH gibi hormon tedavisi ve bu makalede açıklanan ekdisonla başarılı bir hazırlık için ayrıntılı protokoller işçi fizyolojisinin çalışmada ilerlemesine katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | Marker pen for the application of marks to bees |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma Aldrich | H5142 | |
| Methoprene | Sigma Aldrich | 33375 | |
| Breeding case insect | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| Electromotion mixier | ISO | 23M-R25 | homogenization of tissue |
| TRIZol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | the reagent for total RNA extraction |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT reagent kit | Takara | RR037A | the reagent for reverse transcription |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | the reagent for real-time PCR |
| LightCycle 1.2 Instrument | Roche | 12011468001 | the instrument for real-time PCR |
| LightCycle Capillaries (20μl) | Roche | 4929292001 | the material for real-time PCR |
References
- Wilson, E. O. The insect societies. , Harvard university press. (1971).
- Winston, M. L. The biology of the honey bee. , Harvard university press. (1987).
- Lindauer, M. Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).
- Sakagami, S. Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L. I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).
- Kubo, T., et al. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L. Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).
- Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L). Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).
- Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L. Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).
- Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change. Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).
- Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies. Science. 246 (4926), 109-112 (1989).
- Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee. Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).
- Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. Influence of gene action across different time scales on behavior. Science. 296 (5568), 741-744 (2002).
- Lehman, H. K., et al. Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).
- Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes). PLoS One. 6 (7), e22195 (2011).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302 (5643), 296-299 (2003).
- Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors. PLoS One. 10 (6), e0130206 (2015).
- Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain. Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).
- Takeuchi, H., et al. Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain. Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).
- Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L). Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).
- Yamane, T., Miyatake, T. Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).
- Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor. J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).
- Danforth, B. N., Ji, S. Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects. Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).
- Pandey, A., Bloch, G. Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees. Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).
