Summary
lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor.
Abstract
Os rins são suscetíveis a danos causados por exposição a produtos químicos que filtram da corrente sanguínea. Isso pode levar a lesões de órgãos associada a um rápido declínio da função e desenvolvimento da síndrome clínica conhecida como lesão renal aguda (LRA) renal. Os agentes farmacológicos usados para tratar condições médicas que variam de infecção bacteriana para cancro, quando administrados individualmente ou em combinação com outras drogas, pode iniciar LRA. Os peixes-zebra são um modelo animal útil para o estudo dos efeitos químicos sobre a função renal, in vivo, uma vez que formam um rim embrionário composta de unidades de nefrónios funcionais que são conservados com vertebrados superiores, incluindo seres humanos. Além disso, o peixe-zebra pode ser utilizado para realizar telas genéticos e químicas, que fornecem oportunidades para elucidar as facetas celulares e moleculares de AKI e desenvolver estratégias terapêuticas tais como identificação de moléculas nefroprotector. Aqui, demonstramos como microinjeção noembrião do peixe-zebra pode ser utilizado como um paradigma para estudos nefrotoxina.
Introduction
LRA é uma perda abrupta da função renal que pode conduzir a consequências devastadoras saúde 1. AKI é uma questão importante de saúde em todo o mundo devido à sua alta incidência de aproximadamente 20% entre os pacientes hospitalizados, com taxas ainda maiores de 30-50% em casos de cuidados críticos e os idosos, e as taxas de mortalidade de 50-70% 1-3. Infelizmente, a prevalência de AKI tem vindo a aumentar e está projetado para aumentar ainda mais durante a próxima década, em parte devido à diversidade de fatores que podem induzir AKI, que incluem stress pós-operatório, isquemia e exposição a nefrotoxinas como antibióticos e 4 fármacos quimioterapêuticos.
LRA envolve dano celular súbita dentro do rim, que ocorre comumente na nefrónios, que são as unidades funcionais essenciais, e são constituídos por um filtro de sangue e um túbulo segmentada que drena a urina em condutas de recolha central 1. Quando um número significativo de néfrons sãodanificada durante LRA, os efeitos imediatos incluem uma interrupção na depuração de resíduos a partir da circulação, e reduzida ou abolida através de fluxo de fluido nefrónios devido à obstrução de células mortas e moribundas 1. Ao longo do tempo, a obstrução tubular pode levar à degeneração de nefrónios inteiras, o que reduz de forma permanente da função renal 1. Alterações fisiológicas no rim seguintes AKI também envolvem eventos inflamatórios que podem levar a cicatrizes crônica 1.
Apesar destes resultados, néfrons têm alguma capacidade de se submeter a regeneração após AKI que reconstitui a 5,6 epitélio tubular. Embora tenha havido uma compreensão molecular crescente de regeneração néfron, os mecanismos são ainda imperceptíveis em muitos aspectos e necessitam continuou investigação 7. O grau em que LRA resulta em dano renal permanente também permanece desconhecida. A investigação actual sugere o potencial de regeneração para o rim é omaior seguinte casos menos graves de AKI, enquanto episódios mais pronunciados ou repetidas levar à doença renal crônica (DRC) e culminam com doença renal terminal (DRT) que requer transplante ou diálise 8,9 salva-vidas. Além disso, os indivíduos que já sofrem de doença renal crônica têm um risco ainda maior de contrair um episódio grave de AKI 8,9. Tomados em conjunto, é claro que continuou pesquisa básica e clínica é vital para compreender, tratar e prevenir a AKI.
A pesquisa com modelos animais tem sido fundamental para apreciar a progressão de alterações locais e ambientais que ocorrem durante AKI 10. Para expandir este entendimento, bem como desenvolver novas terapias, o modelo animal peixe-zebra foi empregada em uma variedade de formas 11,12. Os nefrónios do rim do peixe-zebra, tanto no embrião e do adulto, apresentam um elevado grau de conservação com mamíferos 13-16. Além disso, lesão epitelial nephron em zebrafish se assemelha ao processo em vertebrados superiores, em que a destruição local de células tubulares é seguida pela proliferação intratubular e restabelecimento da arquitectura nefrónios 17-19. No embrião, no entanto, grandes danos túbulo das nefrotoxinas como cisplatina está associado com letalidade 20,21. Em comparação, os adultos de peixe-zebra sobreviver AKI e exibem capacidades regenerativas substantivas no rim. Por exemplo, após a exposição ao antibiótico aminoglicósido gentamicina, peixe-zebra regenerar dano epitelial dos túbulos e crescer novas unidades de nefrónios bem como 22-24. Embora esses estudos LRA induzida por gentamicina ter fornecido informações valiosas, entendendo dano renal de diversas nefrotoxinas permanece crítica para apreciar os efeitos e resposta a diferentes tipos de danos 25.
O embrião de peixe-zebra, devido ao seu tamanho, transparência e rastreabilidade genética, tem muitos benefícios para estudos nefrotoxina <sup> 25, em que o método de microinjecção 20,21 é utilizado para administrar a molécula (s) para a investigação. Néfrons são formados por 24 horas após a fertilização (hpf) e começar a filtrar o sangue por cerca de 48 hpf 26,27. Assim, a rápida formação e a função do rim embrionário facilita a análise experimental. No entanto, o processo de microinjeção tem desafios técnicos e não pode haver uma curva de aprendizagem para dominar a técnica. Neste artigo de vídeo, que descrevem como realizar e proporcionar microinjections dicas de resolução de problemas, a fim de aumentar a taxa de sucesso de injecções.
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Protocol
Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Notre Dame.
1. Preparação de Soluções
- Adicione uma solução de estoque de 50x E3 meios embrião por mistura de 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2, e 9,95 g de MgSO4 em 5 L de água destilada, e armazenamento à temperatura ambiente.
- Para a cultura de embriões de peixe-zebra, dilui-se a solução 50x estoque de E3 estoque meios embrião para uma solução de trabalho de 1 x com água destilada, depois adicionar 200 mL de 0,05% de azul de metileno para cada uma L de 1x E3 para actuar como um fungicida, e armazenar a RT.
- Adicione uma solução de bloqueio de pigmentação E3 meios embrião com 0,003% de 1-fenil-2-tioureia (PTU) através da combinação de 40 ml de solução stock 50x E3 com 0,06 mg PTU. Em seguida, levar o volume a um total de 2 L com água destilada.
- Agita-se a O E3 / PTU / N à temperatura ambiente para obter o pó PTU na solução. Em seguida, armazenar o E3 / PTU naRT.
Nota: O E3 / PTU possui uma vida útil de aproximadamente uma semana, e as soluções mais antigas vai ser menos eficaz em bloquear o desenvolvimento de pigmentação em larvas de peixe-zebra. - Adicione uma solução anestésica de 0,2% tricaina (MS-222) por adição de 1 g de tricaina a 500 ml de água destilada e ajustar o pH a 7,2 com Tris 1 M, pH 9,5.
- Prepare-se para fazer uma solução de metilcelulose a 2% para imagiologia por colocação de uma solução de 1x E3 (sem azul de metileno), com 1/10 do volume de 0,2% tricaina adicionado a 4 ° C.
Nota: A solução de metilcelulose é uma solução de espessura, claro que é usado para estabilizar suavemente embriões vivos para microscopia. Depois de manipulações são realizados os embriões podem ser lavados em 1x E3 para dissolver a metilcelulose sem ferir o animal e permitindo a microscopia em fases posteriores na mesma amostra. - Quando arrefecida a 4 ° C, agita-se a solução 1x E3 / tricaina vigorosamente numa placa de agitação e adicionar gradualmente a quantidade apropriada de cloridrato depó de celulose, continuando a agitar vigorosamente. Gradualmente adicionar o pó à solução para prevenir a formação de agregados insolúveis de metilcelulose.
- Depois que todo o pó é misturado na solução de metilcelulose / E3 / tricaina 2%, agita-se a solução de composto em 4 ° C, a sala de frio S / N.
Nota: A temperatura fria é melhor para dissolver completamente o pó. Se a solução não for límpida após uma noite, agita-se durante um dia de trabalho adicional e / ou um segundo S / N. - Para remover as bolhas de ar a metilcelulose a 2% / solução / tricaina E3, aliquota-se a mistura em tubos de 1,5 ml e giram a alta velocidade (12.000 xg) a 4 ° C durante 30 min ou até 2 horas.
- Coloque a solução / E3 / tricaina metilcelulose a 2% a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
Nota: Antes do uso, alíquotas deve ser pré-aquecido até à temperatura ambiente para trabalhar com os espécimes de peixe-zebra.
2. Preparação de Ferramentas
- Prepare uma ferramenta embrião manipulador, usado para positioning embriões para microinjecção, anexando uma ponta de carga do gel na ponta de uma "agulha de dissecação 5 linear e seguro com fita ou supercola.
- Prepare agulhas microinjeção usando um extrator de agulhas, colocando primeiro um fogo polido 10 centímetros de vidro de borosilicato com filamento no instrumento e fixe o vidro de borosilicato, apertando os punhos.
- Puxe o vidro de borosilicato de moda finas agulhas-cônicos. Utilize as seguintes definições: aquecer 540, puxe 245, velocidade 200 e 125 tempo.
- Coloque as agulhas dentro de uma placa de Petri, suspendendo-os em uma tira de massa de modelar para proteger as pontas das agulhas, e manter o prato coberto para evitar o acúmulo de poeira.
- Para terminar de preparar a agulha para microinjeções, use uma borda lâmina de barbear ou uma pinça fina para cortar o final puxou da agulha para criar uma ponta de injecção angular afiada com um diâmetro de cerca de 0,05-0,1 mm.
- Para fazer com que o tabuleiro de microinjecção, preparar uma solução de 1,5% de agarose / E3 em um 100 ml frasco Erlenmeyer e dissolver a agarose por aquecimento a E3 a uma fervura num forno de microondas, em seguida, deixa-se arrefecer à temperatura ambiente durante cerca de 10 min.
- Verter a solução de agarose / E3 arrefecida para uma placa de Petri de fazer uma base com uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm. Quando isso tiver solidificado derramar uma segunda camada com uma profundidade de aproximadamente 0,3 cm, e inserir o molde pré-fabricado e embrião bem permitir que a agarose solidificar à temperatura ambiente.
Nota: Quando da inserção do molde para a camada / E3 de agar de topo, colocando o molde em agar em um ângulo para diminuir o número de bolhas de ar. - Quando a bandeja toda a microinjecção definiu, levante o embrião pré-fabricada bem moldar para fora lentamente e com cuidado usando um scoopula, em seguida, encher o prato com solução E3 e armazenar a 4 ° C.
3. Preparação de Embriões
- Configurar tanques de acasalamento de peixe-zebra, colocando divisórias em câmaras de acasalamento e encha com água do sistema.
- Coloque um peixe de cada lado da divisória such que cada câmara de acasalamento contém uma fêmea e um macho peixes, e cubra cada uma das câmaras de acasalamento.
- Na manhã seguinte, retire os divisores para permitir a desova.
- Verifique o peixe depois de aproximadamente 30 minutos, e depois de voltar os adultos para o aquário, recolher os seus embriões, passando a água do tanque de acasalamento por meio de uma ferramenta de filtro fino de arame.
- Inverter a peneira sobre uma placa de Petri e enxaguar com E3 para recolher os embriões.
- Incubar os embriões a 28,5 ° CO / N.
- Quando os embriões atingiram o estádio de 24-26 somito 26, decanta-se a maior parte dos meios de comunicação e, em seguida, E3 dechorionate por adição de 100 ul de 50 mg / mL de pronase para cada prato de embriões e incubando o prato à TA (23 ° C) durante aproximadamente 15 min.
Nota: Vai levar cerca de 24-25 horas a partir do momento da fertilização para os embriões para chegar à fase 24-26 somite se forem recolhidas através do método descrito e incubadas O / N a 28,5 ° C. - Encha o prato comE3 e, em seguida, agite cuidadosamente para desalojar os córions dos embriões.
- Decantar o E3 / pronase e lavar o prato com 25 ml de E3 fresco. Repita etapa de lavagem para remover toda a pronase.
- Para bloquear o desenvolvimento da pigmentação, decantar o E3 e substituir com 25 ml de fresco E3 / PTU quando os embriões tenham atingido 24 horas após a fertilização.
Nota: Para experiências abrangendo vários dias, substitua a solução E3 / PTU com meios frescos uma vez por dia para manter o prato limpo.
4. Solução de Microinjeção nefrotoxina
- No dia da injecção, preparar a solução nefrotoxina desejado, juntamente com o controlo de veículo apropriado.
- Vortex ou misturar suavemente para assegurar a droga (s) é / são em solução, verificando os lados do tubo e o topo da coluna de água.
Nota: As soluções nefrotoxina pode estar preparado para conter pequenas quantidades de dextrano conjugado fluorescente para monitorar a eficiência de microinjeção e também avaliar a depuração renal em subseqtempo uentes aponta 20,28. - Carregar uma agulha de microinjecção aparado com ~ 2-3 ul da nefrotoxina enfiando uma ponta de carregamento de gel fina na parte de trás da agulha e suspender a agulha na vertical, com um pedaço de fita para permitir que a solução para encher a extremidade da agulha cortada por gravidade.
- Uma vez que a ponta da agulha está cheio, fixar a agulha carregada no micromanipulador.
- Testar o volume microinjecção, colocando uma gota de óleo mineral para uma lâmina de micrómetro e injectar no óleo a avaliar o tamanho de gotícula. Um volume de injecção de 500 pl tem um diâmetro de 0,1 mm.
- Remover o prato de embriões a partir do incubador, e anestesiar por adição de cerca de 5 ml de 0,2% tricaina ao prato embrião.
- Para garantir anesthetization completa, tocar suavemente embrião com a ponta da ferramenta embrião manipulador. A falta de movimento indica anesthetization suficiente.
- Após anestesia com sucesso, transferir embriões para o molde de injecção com um transfpipeta er.
- Manobrar cada embrião dentro de um poço diferente do molde colocando a cabeça na área mais profunda do poço de tal forma que o tronco repousa ao longo da depressão e da cauda fura acima fora da depressão.
- Inserir a agulha introduzida no micromanipulador e posicionar a ponta da agulha ao lado de um embrião.
- Gentilmente inserir a agulha para dentro do vaso cauda movendo o joystick para a frente e pressionar o pedal para entregar a microinjecção.
Nota: injeção de sucesso pode ser medido observando o líquido entra na circulação. Além disso, a co-injecção do nephrotoxicant com dextrano conjugado por fluorescência permite que o pesquisador para verificar a injecção subsequente de sucesso para o procedimento. - Gentilmente puxe o joystick para remover a agulha do embrião.
- Após a injeção, transferir os embriões para um prato limpo e lavar para remover o tricaina e substituir com frescos E3 / PTU.
- Incubar o embrião para o ponto de tempo desejado para avaliars morfologia, a qual pode ser documentadas por fotografia em meios de montagem de metilcelulose, ou um processo para a análise experimental como desejado.
Nota: Recuperação de embriões devem ser avaliadas para determinar a percentagem de indivíduos com edema, que normalmente indica lesão renal.
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Representative Results
Uma estação de microinjecção configurar inclui um estereomicroscópio, micromanipulador e regulador de pressão (Figura 1A). Transiluminação da placa de injecção é preferível para visualizar amostras durante este procedimento (Figura 1B). Preparação da agulha de injecção implica puxar o vidro de borosilicato apropriado, seguida por preparação da borda de corte e, finalmente, com back-carregar a agulha. Optimamente, a ponta da agulha é chanfrado, em vez de ponta romba (Figura 1C), um corte que é feito por dobrar fortemente o bordo do instrumento de corte, tais como os fórceps finos, durante o procedimento de corte (Figura 1D). Esta borda chanfrada é crítico e irá afectar grandemente a capacidade de inserir a agulha suavemente para o peixe-zebra.
No dia da injecção, os embriões foram posicionados utilizando embrião resistente, mas flexívelFerramentas de manipulação (Figura 1E). Para a injecção, os embriões foram manobrado, de modo que o tronco descansado ao longo do lado da bandeja de injecção para proporcionar força de alavanca para a etapa de injecção subsequente (Figura 1F). Enquanto a injeção, deve-se concentrar o avião de vista sobre o tronco embrionárias para visualizar o destino vascular para a inserção da agulha e, em seguida, observar o material injetado entrar na circulação (Figura 1G).
A transparência do embrião do peixe-zebra facilita o procedimento de micro-injecção, e pode ser ainda melhorada através de tratamento químico PTU em 24 HPF para diminuir o desenvolvimento de pigmentação durante um curso de tempo experimental típico (Figura 2A). Aqui, as amostras de embriões foram deixados a desenvolver-se através da etapa 72 hpf, em seguida, ou foram injectados simulada, microinjectados com veículo de solução salina, ou micro-injectados com 2,5 mg / ml de gentamicina (Figura 2A).Vivo de observação subsequente foi conduzida a um e dois dias após a injecção, utilizando transiluminação de iluminação com um estereomicroscópio (Figura 2B). Em comparação com os embriões injectados simulados ou soro fisiológico, só os indivíduos injectados com gentamicina mostrou o desenvolvimento de edema (Figura 2B), neste caso o edema pericárdico, sugerindo uma revogação da funcionalidade renal normal consistente com as observações previamente publicadas 11,20,21.
Figura 1. Aparelho de microinjeção e ferramentas. (A) Estação de injeção configurado com lupa (à esquerda), micromanipulador e suporte de agulha (meio) e regulador de pressão (à direita). (B) transiluminação da placa de injecção. (C) Esquerda: agulha de corte Blunt. Direita: chanfrada agulha de corte. (D) Ffórceps ine usada para cortar pontas de agulha. (E) ferramentas de manipulação usados para inserir e posicionar os espécimes para dentro do molde de injeção. (F) Embriões dispostas no molde microinjeção. Barra de escala = 0,5 mm. (L) Posicionamento de agulha ao lado do embrião para injecção. Barra de escala = 0,15 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. ensaio cronograma e edema pós-injecção Experimental. (A) Exemplo nefrotoxina cronograma experimental no peixe-zebra, aqui aplicada a um estudo de gentamicina. Os embriões foram dechorionated e tratou-se com solução PTU às 24 horas após a fertilização (HPF). Cada dia, a solução foi decantada e o PTU substituído com meio fresco tal como indicado pela Smaller setas verdes. Às 72 hpf, anestesiaram-se os embriões, transferidos para um molde de injecção e, em seguida, tratados como se segue: simulada injectados ou injectados, quer solução salina (controlo de veículo) ou de gentamicina. Após reviver os embriões em meio fresco, os embriões foram observadas em 1 e 2 dias após a injecção (96 e 120 HPF, respectivamente) para a análise e a aquisição de imagem. (B) superior: embrião de peixe-zebra não injectados. Meio: embriões injectados às 72 HPF com a solução salina. Resumindo: embriões injectados com 2,5 mg / ml de gentamicina. Barra de escala = 0,5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um número diverso de agentes terapêuticos têm sido associados com LRA 29. Tem havido avanços significativos na compreensão de investigação do dano induzido por muitos compostos individuais, tais como a gentamicina aminoglicósido 30 e a cisplatina quimioterapêutico largamente utilizado 31,32. Algumas alterações patológicas envolvidos nestas condições, no entanto, continuar a ser objecto de estudo em curso. Um desafio emergente continua a compreensão de como múltiplas drogas afectar negativamente os pacientes, especialmente aqueles em populações de alto risco, tais como aqueles em ambientes de cuidados críticos e idosos 29. Assim, modelos que permitem que novos estudos baseados celulares sobre os efeitos do LRA induzida por drogas servir um papel importante na melhoria da detecção desta condição e apreciar interações medicamentosas dinâmicos.
Trabalhar com modelos de mamíferos como ratos e ratinhos têm sido parte integrante para estabelecer as alterações celulares no rim seguintes AKI, but uma limitação com estes sistemas é que a observação, em tempo real directa é limitada devido à complexidade de arquitectura e localização interna do órgão. Simplificando, o rim não está disponível para observação directa, o que exige que os indivíduos ser sacrificado para analisar o rim. Essas limitações podem ser combatidos através da utilização de embriões de peixe-zebra, que formam um rim simples de dois néfrons que têm uma estrutura segmento conservado com outros vertebrados, incluindo seres humanos 33. Desenvolvimento Zebrafish ocorre ex utero e com menor pigmentação, permitindo a observação direta de organogénese e monitorização das respostas renal a estímulos externos 34. Ferramentas para análise molecular, tais como a expressão do gene 35-37, têm sido utilizados com alta resolução para determinar as características de nefrogênese 38-40. manipulações experimentais para o ensaio de moléculas pequenas através da genética químicas estão bem estabelecidas no peixe-zebra e aplicável ao kidney 41-43. Com efeito, nos últimos anos, peixe-zebra foram aplicados para modelar a nefrotoxicidade de agentes que vão de acetominofeno com micotoxinas e ácido aristolochic 44-48. É importante notar que também existem limitações significativas à modelagem LRA no embrião do peixe-zebra, por causa da própria simplicidade da estrutura renal, nesta fase do desenvolvimento. Por exemplo, peixe-zebra não são adequados para tratamento das interacções multifactoriais no tecido renal que está densamente com nefrónios que estão rodeadas por um estroma complexo que contém vários tipos de células intersticiais, como é o caso no roedor ou metanefros humanos. Assim, peixe-zebra são mais adequados para a visualização de alterações celulares e moleculares autônomos no néfron durante AKI.
O método de microinjeção aqui descrito, ao ter uma curva de aprendizagem, é muito útil para o estudo de ambos os estados de desenvolvimento e doença, incluindo nefrotoxinas. Esta técnica pode ser usada para de tedrogas st isolados ou em combinação. Além disso, as injecções podem ser realizadas durante uma larga gama de pontos do tempo de desenvolvimento. Um método semelhante, igualmente viável para a realização de micro-injecções intravenosas em larvas de peixe-zebra foi previamente descrito por Cosentino, et ai. 21. Uma diferença significativa na sua metodologia, em comparação com os métodos descritos aqui, é que o embrião a ser injectada é imobilizado utilizando uma pipeta de 21 exploração. A utilização de uma pipeta de realização é uma alternativa viável para o molde de injecção. Pesquisadores que procuram implementar microinjeção como um método de entrega de agentes nephrotoxicant deve estar ciente desta alternativa e pode querer comparar os métodos para identificar qual é pessoalmente preferível, como aprender a manipular a pipeta de exploração de modo a não danificar o embrião vai envolver prática da mesma forma que requer prática para manobrar com sucesso e microinject usando um molde de injeção simples, com uma cavidade de depressão para o embryos.
Ao realizar este procedimento, é crítico para preparar as agulhas de injecção de tamanho apropriado, e para cortar o ângulo na ponta da agulha para optimizar entrada suave e saída para a circulação embrionário. Durante o processo de injecção, é crítico para monitorizar o volume de injecção para avaliar a consistência da entrega nefrotoxina entre amostras. avaliação periódica do volume de injeção com um micrômetro pode ser realizada se o pesquisador está incerto sobre mudanças no volume durante a execução de um experimento. Por exemplo, devido à natureza da técnica, a ponta da agulha pode parcialmente ou totalmente entupir com detritos celulares. Esta complicação pode ser combatido, limpando a agulha periodicamente para assegurar a consistência do fluido ejectado. Além disso, um corante vital como vermelho de fenol pode ser adicionado à mistura para actuar como um marcador visual da injecção e ajudar a controlar a dispersão de fluido 49,50. Além disso, as injecções de moléculas marcadoras podem auxiliar navisualizando as populações de células específicas, a seguir à injecção. Para a co-injecção de dextrano porções fluorescentes, especificamente de 10 kDa de conjugados de dextrano, tem um número de aplicações 16,17. Neste caso, a avaliação da intensidade de fluorescência pode ser realizada imediatamente a seguir o procedimento para confirmar a microinjecção de sucesso com perdas mínimas. A intensidade pode ser medido usando a fotografia de captura de imagem apropriada e, em seguida, reexaminados em pontos de tempo posteriores para medir a alteração da intensidade de fluorescência de modo a medir a depuração renal 51. Além disso, a reabsorção do dextrano no túbulo proximal fornece um proxy para a funcionalidade deste segmento nefrónio 16,17.
Tomados em conjunto, há muitas maneiras que microinjecção podem ser utilizados para investigar LRA com o peixe-zebra, tanto mais que este modelo proporciona uma oportunidade para dirigir farmacocinética in vivo. Assim, uma vez dominado, microinjeção de nefrotoxinasno embrião do peixe-zebra fornece um paradigma útil para estudos renais.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo DP2OD008470 concessão NIH. Além disso, RAM foi apoiado em parte por fundos fornecidos pela Universidade de Notre Dame Graduate School. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, o Centro de Zebrafish Research, e do Centro de Células Estaminais e Medicina Regenerativa na Universidade de Notre Dame. Agradecemos especialmente os membros do laboratório para envolver discussões sobre a biologia rim e seu feedback útil sobre este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning: | |||
| 60 mm x 15 mm | VWR | 25373-085 | |
| 100 mm x 15 mm | VWR | 25373-100 | |
| (microinjection tray) 150 mm x 15 mm | VWR | 25373-187 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Micrometer | Ted Pella, Inc. | 2280-24 |
References
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
- Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
- Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
- Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
- Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
- Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
- Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
- Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
- Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
- Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
- McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
- Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
- Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
- Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
- Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
- Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
- Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
- McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
- Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
- Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
- Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
- Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
- Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).
