Summary
Njurskador som uppstår från nephrotoxins, som omfattar läkemedel som sträcker sig från antibiotika till kemoterapeutika kan leda till komplexa sjukdomar vars patogenes förblir ofullständigt förstådd. Detta protokoll visar hur zebrafisk kan användas för sjukdom modellering av dessa villkor, som kan tillämpas på identifiering av renoprotective åtgärder.
Abstract
Njurarna är känsliga för skada från exponering för kemikalier de filtrerar från blodet. Detta kan leda till organskada i samband med en snabb nedgång i njurfunktion och utveckling av den kliniska syndrom som kallas akut njursvikt (AKI). Farmakologiska medel som används för att behandla medicinska förhållanden som sträcker sig från bakteriell infektion till cancer, när den administreras enskilt eller i kombination med andra läkemedel, kan initiera AKI. Zebrafisk är en användbar djurmodell för att studera kemiska effekter på njurfunktionen in vivo, eftersom de utgör en embryonal njure består av nephron funktionella enheter som är konserverade med högre ryggradsdjur, inklusive människan. Vidare kan zebrafisk användas för att utföra genetiska och kemiska skärmar, som ger möjligheter att belysa de cellulära och molekylära aspekter av AKI och utveckla terapeutiska strategier såsom identifiering av njurskyddande molekyler. Här visar vi hur mikroinjektion izebrafisk embryo kan utnyttjas som ett paradigm för njurskador studier.
Introduction
AKI är en abrupt förlust av njurfunktion som kan leda till förödande konsekvenser för hälsan 1. AKI är en viktig hälsovård fråga över hela världen på grund av dess höga förekomsten av cirka 20% bland inneliggande patienter, med ännu högre hastigheter av 30-50% i kritiska fall vård och äldre, och dödligheten hos 50-70% 1-3. Tyvärr har förekomsten av AKI ökat och förväntas att eskalera ytterligare under det kommande årtiondet, delvis beroende på de olika faktorer som kan inducera AKI, som omfattar postoperativ stress, ischemi, och exponering för nephrotoxins såsom antibiotika och kemoterapeutiska läkemedel 4.
AKI innebär plötslig cellskador i njuren, vanligt förekommande i nefroner, som är de viktigaste funktionella enheter, och består av ett blodfilter och en segmenterad tubuli som dränerar urin i centrala uppsamlingsledningar 1. När ett stort antal nefroner ärskadats under AKI, de omedelbara effekterna inkluderar ett avbrott i clearance avfall från cirkulationen och minskas eller upphävs vätskeflöde genom nephrons på grund av obstruktion från döda och döende celler 1. Med tiden kan rörformiga hinder leda till degeneration av hela nefroner, som permanent minskar njurfunktionen en. Fysiologiska förändringar i njuren efter AKI innebär också komplexa inflammatoriska händelser som kan leda till kronisk ärrbildning en.
Trots dessa resultat, nefroner har viss förmåga att genomgå återhämtning efter AKI som återskapar den rörformiga epitel 5,6. Även om det har varit en ökande molekylär förståelse av nephron regenerering, mekanismerna förblir svårfångade i många avseenden och kräver fortsatt utredning 7. Den grad i vilken AKI resulterar i permanent njurskada är också fortfarande okänd. Aktuell forskning föreslår den regenerativa potential för njuren är denhögsta efter mindre allvarliga fall av AKI, medan mer uttalade eller upprepade episoder leda till kronisk njursjukdom (CKD) och kulminerar i terminal njursjukdom (ESRD) som kräver livräddande transplantation eller dialys 8,9. Dessutom, personer som redan lider av CKD löper ännu större risk att smittas av en allvarlig episod av AKI 8,9. Sammantaget är det uppenbart att en fortsatt grundforskning och klinisk forskning är viktigt att förstå, behandla och förebygga AKI.
Forskning med djurmodeller har varit avgörande för att uppskatta utvecklingen av lokala och miljöförändringar som inträffar under AKI 10. För att utvidga denna förståelse samt utveckla nya terapier, har zebrafisk djurmodell använts i en mängd olika sätt 11,12. Nephrons av zebrafisk njure, i både embryot och vuxna, visar en hög grad av bevarande med däggdjur 13-16. Vidare, nephron epitel skada i zebrafish liknar processen i högre ryggradsdjur, varvid den lokala förstörelse av tubulära celler följs av Intratubulär spridning och återupprättande av nephron arkitektur 17-19. I embryot är emellertid omfattande tubuli skador från de nephrotoxins såsom cisplatin associerade med letalitet 20,21. Som jämförelse, zebrafisk vuxna överleva AKI och uppvisar materiella regenerativa kapacitet i njuren. Till exempel, efter exponering för aminoglykosidantibiotika gentamicin, zebrafisk regenerera tubuli epitelskada och växa nya nefronenheter samt 22-24. Även om dessa gentamicin-inducerad AKI studier har gett värdefull information, att förstå njurskada från olika nephrotoxins förblir avgörande för att uppskatta effekterna och svar på olika typer av skador 25.
Zebrafisk embryo, på grund av sin storlek, transparens, och genetisk spårbarhet, har många fördelar för njurskador studier <sup> 25, där metoden för mikroinjektion 20,21 används för att administrera molekylen (er) för utredning. Nefroner bildas med 24 timmar efter befruktning (HPF) och börjar att filtrera blodet med cirka 48 HPF 26,27. Således, den snabba bildningen och funktionen av den embryonala njur underlättar experimentell analys. Men processen för mikroinjektion har tekniska utmaningar och det kan vara en brant inlärningskurva att behärska tekniken. I denna video artikeln beskriver vi hur du utför microinjections och ge felsökningstips för att öka graden av framgångsrika injektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerna för att arbeta med zebrafisk embryon som beskrivs i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Notre Dame.
1. Beredning av lösningar
- Gör en 50x stamlösning av E3 embryo media genom att blanda 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 och 9,95 g MgSO 4 i 5 L av destillerat vatten, och förvara vid RT.
- För odling av zebrafisk embryon, späda 50x stamlösning av E3 embryo media lager till en 1x arbetslösning med destillerat vatten och tillsätt sedan 200 pl 0,05% metylenblått till varje 1 liter 1x E3 att fungera som en fungicid, och förvara vid RT.
- Gör en pigmente blockerande lösningen av E3 embryo medium med 0,003% 1-fenyl-2-tiourea (PTU) genom att kombinera 40 ml av 50x E3 lager med 0,06 mg PTU. Sedan föra volymen till totalt 2 L med destillerat vatten.
- Rör om E3 / PTU O / N vid RT för att få PTU pulver i lösning. Sedan lagra E3 / PTU påRT.
Obs! E3 / PTU har en hållbarhet på cirka en vecka, och äldre lösningar kommer att vara mindre effektiva på att blockera pigmente utveckling i zebrafisk larver. - Göra en anestetisk lösning av 0,2% Tricaine (MS-222) genom tillsättning av 1 g Tricaine till 500 ml destillerat vatten och justera pH till 7,2 med 1 M Tris, pH 9,5.
- Förbereda sig för att göra en 2% metylcellulosalösning för avbildning genom att placera en lösning av 1x E3 (ingen metylenblått), med 10/01: e volym av 0,2% Tricaine sattes vid 4 ° C.
Anmärkning: metylcellulosalösning är en tjock, klar lösning som används för att försiktigt stabilisera levande embryon för mikroskopi. Efter manipulationer utförs embryona kan tvättas i 1x E3 att upplösa metylcellulosa utan att skada djuret och möjliggör mikroskopi vid efterföljande steg i samma prov. - När kyls till 4 ° C, rör om 1x E3 / Tricaine lösning kraftigt på en omrörningsplatta och gradvis lägga lämplig mängd metylcellulosapulver samtidigt som man fortsätter att röra kraftigt. Gradvis lägga pulvret till lösningen för att förhindra bildning av olösliga metylcellulosa aggregat.
- När allt pulvret blandas in i den 2% metylcellulosa / E3 / tricaine lösning, rör om den sammansatta lösningen i 4 ° C kallt rum O / N.
Obs: Den kalla temperaturen är bäst för fullständigt upplösning av pulvret. Om lösningen inte är klar efter en natt, rör om under ytterligare en arbetsdag och / eller en andra O / N. - För att ta bort luftbubblor från 2% metylcellulosa / E3 / tricaine lösning, prov blandningen i 1,5 ml rör och snurra med hög hastighet (12.000 xg) vid 4 ° C under 30 minuter eller upp till två timmar.
- Placera 2% metylcellulosa / E3 / Tricaine lösning vid 4 ° C under långtidsförvaring.
Obs: Före användning, portioner bör förvärmas till RT för att arbeta med de zebrafisk prover.
2. Beredning av verktyg
- Förbered ett embryo manipulator verktyg, som används för popositionering embryon för mikroinjektion, genom att fästa en gel lastning tips på slutet av en 5 "rakt dissekera nål och fäst med tejp eller superlim.
- Förbered mikroinjektion nålar med hjälp av en nål avdragare, genom att först placera en brand polerad 10 cm borsilikatglas med filament in i instrumentet och säkra borsilikatglas genom att dra åt handtagen.
- Dra borsilikatglas att utforma fina avsmalnande nålar. Använd följande inställningar: värme 540, dra 245, hastighet 200, och tiden 125.
- Placera nålar inuti en petriskål, suspenderande dem på en remsa av modellera för att skydda nålen tips, och hålla skålen täckas för att förhindra dammansamling.
- För att avsluta förbereder nålen för microinjections, använda ett rakblad eller fin pincett kant att skära drog änden av nålen för att skapa en skarp vinkel injektion spets med en diameter på ungefär 0,05 till 0,1 mm.
- För att göra den mikroinjektion facket, förbereda en 1,5% agaros / E3 lösning i en 100 ml Erlenmeyerkolv och lös agarosen genom upphettning av E3 till en koka i en mikrovågsugn då låt svalna vid rumstemperatur under cirka 10 minuter.
- Häll den kylda agaros / E3-lösning i en petriskål för att göra ett fundament med ett djup av ca 0,5 cm. När detta har stelnat pour ett andra skikt med ett djup av ca 0,3 cm och för in den prefabricerade embryo väl mögel och tillåta agarosen att stelna vid RT.
Anmärkning: När du sätter formen in i toppagar / E3 skikt, placera formen i ägarn med en vinkel för att minska antalet luftbubblor. - När hela mikroinjektion facket har satt, lyft prefabricerade embryot väl forma ut långsamt och försiktigt med hjälp av en Spatel, sedan fylla skålen med E3-lösning och förvara vid 4 ° C.
3. Embryo Framställning
- Ställ in zebrafisk parning tankar genom att placera delarna i parningskammare och fyll med systemvattnet.
- Placera en fisk på vardera sidan av avdelaren sUCH att varje parning kammare innehåller en hona och en hane fisk, och täcker varje parning kammare.
- Nästa morgon, ta bort avdelare för att möjliggöra lek.
- Kontrollera fisken efter ca 30 minuter, och när han återvände de vuxna i akvariet, hämta sina embryon genom att parning tank vatten genom en fin tråd-mesh sil verktyg.
- Invertera silen över en petriskål och skölj med E3 för att samla upp embryon.
- Inkubera embryon vid 28,5 ° CO / N.
- När embryona har nått 24-26 somit steget 26, dekantera de flesta av de E3 media och sedan dechorionate genom tillsats av 100 pl av 50 mg / ml pronas till varje skål av embryon och inkubering av skålen vid RT (23 ° C) under ca 15 min.
Obs: Det tar ungefär 24-25 timmar från tiden för befruktning för embryona för att nå 24-26 somit steget om de uppbärs på det beskrivna sättet och inkuberades O / N vid 28,5 ° C. - Fyll skålen medE3 och sedan snurra försiktigt för att få bort de chorions från embryon.
- Häll av E3 / pronas och skölj skålen med 25 ml färskt E3. Upprepa sköljningssteg för att avlägsna alla pronas.
- Att blockera utvecklingen av pigmentering, dekantera E3 och ersätt med 25 ml färskt E3 / PTU när embryona har nått 24 h efter befruktning.
Obs: För experiment spänner flera dagar, byt ut E3 / PTU lösning med färskt medium en gång dagligen för att hålla skålen ren.
4. Mikroinjektion av njurskador Lösning
- På dagen för injektion, framställa den önskade nefrotoxin lösning tillsammans med en lämplig kontrollbärare.
- Vortex eller blanda försiktigt för att försäkra drogen (s) är / är i lösning, kontroll sidorna av röret och övre delen av vattenmassan.
Obs: nefrotoxin lösningar kan framställas för att innehålla spårmängder av fluorescerande konjugerade dextran för att övervaka mikroinjektion effektivitet och även utvärdera njurclearance på subsequent tidpunkter 20,28. - Ladda ett trimmat mikroinjektion nål med ~ 2-3 mikroliter av nefrotoxin genom att trä en fin gel loading spets på baksidan av nålen och avbryta nålen vertikalt med en bit tejp för att tillåta lösningen att fylla den trimmade nålspetsen genom gravitation.
- När nålspetsen är fullt säkra den laddade nålen i mikromanipulator.
- Testa mikroinjektion volymen genom att placera en droppe mineralolja på en mikrometer slide och injicera i oljan för att utvärdera den droppstorleken. En injektionsvolym av 500 pl har en diameter på 0,1 mm.
- Avlägsna skålen av embryon från inkubatorn, och söva genom att tillsätta ca 5 ml av 0,2% Tricaine till embryot skålen.
- För att säkerställa fullständig anesthetization, försiktigt röra embryo med spetsen av embryot manipulator verktyget. Brist på rörelse indikerar tillräcklig bedövning.
- Efter lyckad anesthetization, överföra embryon till sprutform med en transfER pipett.
- Manövrera varje embryo till en annan brunn av formen att placera huvudet i den djupaste området av brunnen, så att stammen vilar längs depression och svansen sticker upp ur depression.
- Sätt den fyllda nålen i mikromanipulator och placera nålspetsen bredvid ett embryo.
- Försiktigt in nålen i svansen kärlet genom att föra joysticken framåt och trycka ned fotpedalen för att leverera mikroinjektion.
Obs: Lyckad injektion kan mätas genom att titta på vätskan börjar cirkulera. Vidare, co-injektion av nephrotoxicant med fluorescent konjugerat dextran möjliggör för forskaren att verifiera lyckad injektion efter förfarandet. - Dra försiktigt tillbaka på styrspaken för att ta bort nålen från embryot.
- Efter injektion, överföra embryon till en ren skål och skölj ta bort Tricaine och ersätta med färsk E3 / PTU.
- Inkubera embryot till önskad tidpunkt att bedömas morfologi, som kan dokumenteras genom fotografering i metylcellulosa montering media, eller process för experimentell analys som önskas.
Notera: Utvinning av embryon bör bedömas för att bestämma andelen individer med ödem, som vanligtvis tyder på njurskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mikroinjektion station inrättas inkluderar en stereo, mikromanipulator och tryckregulator (Figur 1A). Genomlysning av insprutningsplattan är att föredra att se prover under denna procedur (Figur 1B). Framställning av injektionsnålen involverar att dra den lämpliga borsilikatglas, följt av framställning av den kant med skärande och slutligen back-loading nålen. Optimalt är nålspetsen avfasade snarare än trubbiga (Figur 1C), ett snitt som är gjord av kraftigt vinkla kanten av skärinstrumentet, såsom fin pincett, under skärförfarandet (Figur 1D). Detta avfasad kant är kritisk och kommer att kraftigt påverka förmågan att försiktigt in nålen i zebrafisk.
På dagen för injektionen, var embryon placerade med hjälp av robust men smidig embryomanipulation verktyg (Figur 1E). För injektionen var embryon manövreras, så att bålen vilade längs sidan av injektionsfacket för att ge hävstång för efterföljande insprutningssteget (figur 1F). Medan du injicerar, bör man fokusera plan med tanke på den embryonala torso att visualisera vaskulära destination för nålinförande och sedan observera det injicerade materialet in i cirkulationen (figur 1G).
Insynen i zebrafisk embryot underlättar mikroinjektion förfarande, och kan förbättras ytterligare genom PTU kemisk behandling vid 24 HPF för att minska utvecklingen av pigmente under en typisk experiment tidsförloppet (Figur 2A). Här fick embryo exemplar får utvecklas genom 72 HPF scenen, var då antingen mock injiceras injiceras med saltlösning fordon, eller injiceras med 2,5 mg / ml gentamicin (Figur 2A).Efterföljande levande observation genomfördes vid en och två dagar efter injektion, med hjälp av genomlysning belysning med ett stereomikroskop (figur 2B). Jämfört med håna eller salthaltigt injicerade embryon, endast gentamicin-injicerade individer visade utvecklingen av ödem (figur 2B), i detta fall perikardiell ödem, vilket tyder på en upphävande av normal njure funktioner överensstämmer med tidigare publicerade observationer 11,20,21.
Figur 1. Mikroinjektion apparater och verktyg. (A) Injektion station inrättas med stereomikroskop (till vänster), mikromanipulator och nålhållaren (mitten) och tryckregulator (höger). (B) genomlysning av insprutningsplattan. (C) Vänster: Blunt skära nål. Höger: Beveled skära nål. (D) Fine pincett används för att skära nålspetsar. (E) Manipulation verktyg som används för att sätta in och placera proverna i sprutformen. (F) Embryon klädd i mikroinjektion mögel. Skalstreck = 0,5 mm. (G) Positionering av nål intill embryot för injektion. Skala bar = 0,15 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Experimentell tidslinje och efter injektionen ödem analysen. (A) Exempel nefrotoxin experimentell tidslinje i zebrafisk, här tillämpas på en gentamicin studie. Embryon dechorionated och behandlades med PTU lösning vid 24 h efter befruktning (HPF). Varje dag då ett PTU lösningen dekanterades och ersattes med färskt medium som indikeras av smaller gröna pilar. Vid 72 HPF ades embryon bedövades, överfördes till en sprutform och behandlades sedan på följande sätt: mock injiceras eller insprutas antingen saltlösning (vehikelkontroll) eller gentamicin. Efter att återuppliva embryona i färskt medium, var embryona observerades vid 1 och 2 dagar efter injektion (96 och 120 HPF, respektive) för analys och bildförvärv. (B) Top: icke-injicerade zebrafisk embryo. USA: embryo injiceras vid 72 HPF med koksaltlösning. Nederst: embryo injicerades med 2,5 mg / ml gentamicin. Skala bar = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett varierat antal terapeutiska medel har förknippats med AKI 29. Det har skett betydande forskningsframsteg att förstå den skada som induceras av många enskilda föreningar, såsom aminoglykosiden gentamicin 30 och används i stor utsträckning kemoterapeutiska cisplatin 31,32. Vissa patologiska förändringar som är involverade i dessa villkor är dock fortfarande föremål för pågående studien. En framväxande utmaningen är fortfarande att förstå hur flera läkemedel påverkar negativt patienter, särskilt i högriskgrupper, såsom de i inställningar intensivvårds och äldre 29. Således modeller som gör ytterligare cellulära baserade studier om effekterna av läkemedelsinducerad AKI tjäna en viktig roll för att förbättra upptäckten av detta tillstånd och uppskatta dynamiska läkemedelsinteraktioner.
Arbetet med däggdjurs modeller som mus och råtta har varit en integrerad del etablera cellförändringar i njurarna efter AKI, but en begränsning med dessa system är att direkt, i realtid observation är begränsad på grund av den arkitektoniska komplexitet och inre placeringen av orgeln. Enkelt uttryckt är inte tillgänglig för direkt observation, vilket kräver att individer offras för att analysera njuren njuren. Dessa begränsningar kan motverkas med hjälp av zebrafisk embryon, som bildar en enkel njure av två nefroner som har en konserverad segment struktur med andra ryggradsdjur, inklusive människan 33. Zebrafisk utveckling sker ex livmodern och med mindre pigmentering, vilket möjliggör direkt observation av njur organogenes och övervakning av svar på externa signaler 34. Verktyg för molekylär analys, såsom genuttryck 35-37, har använts med hög upplösning för att bestämma egenskaperna hos nephrogenesis 38-40. Experimentella manipulationer för testning av små molekyler genom kemisk genetik är väl etablerade i zebrafisk och som gäller för den kidney 41-43. Faktum är att under de senaste åren, zebrafisk har använts för att modellera nefrotoxicitet av agenter som sträcker sig från acetominofen till mykotoxiner och aristolochiasyra 44-48. Det är viktigt att notera att det finns också betydande begränsningar AKI modellering i zebrafisk embryot, på grund av den mycket enkla njurstrukturen vid detta skede i utvecklingen. Till exempel, är zebrafisk inte lämpade för att ta itu med multifaktoriella interaktioner inom njurvävnad som är tätt packad med nefroner som är omgivna av en komplex stroma som innehåller flera interstitiella celltyper, såsom är fallet i gnagare eller humana metanefros. Således, zebrafisk är bäst lämpade att visualisera autonoma cellulära och molekylära förändringar i nephron under AKI.
Metoden för mikroinjektion beskrivs här, samtidigt som en brant inlärningskurva, är mycket användbar för att studera både utvecklings- och sjukdomstillstånd, inklusive nephrotoxins. Denna teknik kan användas till test läkemedel ensamma eller i kombination. Dessutom kan injektioner utföras under ett brett spektrum av utveckling tidpunkterna. En liknande, lika gångbar metod för att utföra intravenösa microinjections i zebrafisk larver har tidigare beskrivits av Cosentino, et al. 21. En betydande skillnad i deras metod, jämfört med de metoder som beskrivs här, är att embryot som skall injiceras immobiliseras med användning av en anläggning pipett 21. Användningen av en anläggning pipett är ett lönsamt alternativ till formsprutan. Forskare som vill införa mikroinjektion som en leveransmetod för nephrotoxicant medel bör vara medvetna om detta alternativ och kanske vill jämföra metoder för att identifiera vilka är personligen föredra att lära sig att manipulera innehavet pipetten för att inte skada embryot kommer att innebära praktik precis som det kräver övning att framgångsrikt manövrera och mikroinjicera hjälp av en enkel injektion mögel med en fördjupning hålighet för EMBRyos.
När du utför den här proceduren, är det viktigt att förbereda lagom stora injektionsnålar, och för att minska vinkeln på nålspetsen att optimera smidig på- och avstigning i embryonala cirkulationen. Under injektionen, är det viktigt att övervaka injektionsvolym för att bedöma enhetligheten i nefrotoxin leverans mellan prover. Regelbunden utvärdering av injektionsvolym med en mikrometer kan utföras om forskaren är osäker på förändringar i volym när de utför ett experiment. Till exempel på grund av arten av den teknik, nålspetsen kan delvis eller helt täppa med cellrester. Denna komplikation kan motverkas genom att rensa nålen regelbundet för att säkerställa konsekvens av den utstötta vätskan. Dessutom kan en vitala färgämnet som fenolrött tillsättas till blandningen för att fungera som en visuell markör för injektionen och hjälpa till att övervaka fluid dispersal 49,50. Vidare kan injektioner av spårmolekyler hjälpa till vidvisualisera specifika cellpopulationer, efter injektionen. För samtidig injektion av fluorescerande dextrandelar, specifikt 10 kDa dextran-konjugat, har ett antal applikationer 16,17. I detta fall kan utföras utvärdering av fluorescensintensiteten omedelbart följa förfarandet för att bekräfta framgångsrik mikroinjektion med minimalt läckage. Intensiteten kan mätas med hjälp av lämpliga bildfångst fotografi och sedan omprövas vid efterföljande tidpunkter för att mäta förändringen i fluorescensintensiteten för att mäta njurclearance 51. Vidare återupptag av dextran i proximala tubuli ger en proxy för funktionaliteten i denna nephron segment 16,17.
Sammantaget finns det många sätt att mikroinjektion kan användas för att undersöka AKI med zebrafisk, särskilt eftersom denna modell ger möjlighet att ta upp farmakokinetik in vivo. Således, en gång behärskar, mikroinjektion av nephrotoxinsi zebrafisk embryot ger en användbar paradigm för njurstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NIH bidraget DP2OD008470. Dessutom var RAM stöds delvis av medel från University of Notre Dame Graduate School. Vi tackar staber vid institutionen för Biological Sciences, Centrum för Zebrafish forskning och Centrum för stamceller och regenerativ medicin vid University of Notre Dame. Vi tackar särskilt medlemmarna i labbet för att engagera diskussioner om njur biologi och deras hjälpsamma respons på detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning: | |||
| 60 mm x 15 mm | VWR | 25373-085 | |
| 100 mm x 15 mm | VWR | 25373-100 | |
| (microinjection tray) 150 mm x 15 mm | VWR | 25373-187 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Micrometer | Ted Pella, Inc. | 2280-24 |
References
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
- Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
- Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
- Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
- Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
- Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
- Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
- Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
- Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
- Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
- McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
- Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
- Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
- Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
- Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
- Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
- Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
- McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
- Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
- Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
- Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
- Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
- Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).
