Summary
الإصابات الكلوية تكبدها من nephrotoxins، والتي تشمل الأدوية التي تتراوح بين المضادات الحيوية لمبحث المعالجة الكيميائية، يمكن أن يؤدي إلى اضطرابات معقدة التي لا تزال غير مفهومة تماما المرضية. يوضح هذا البروتوكول كيف الزرد يمكن استخدامها للنمذجة مرض من هذه الشروط، والتي يمكن تطبيقها لتحديد التدابير renoprotective.
Abstract
الكلى هي عرضة للضرر من التعرض للمواد الكيميائية التي يتم ترشيحها من مجرى الدم. هذا يمكن أن يؤدي إلى إصابة الجهاز يرتبط مع انخفاض سريع في وظائف الكلى وتطوير متلازمة سريرية المعروفة باسم قصور كلوي حاد وكالة (آكي). استخدام وكلاء الدوائية لعلاج الحالات الطبية التي تتراوح بين العدوى البكتيرية إلى السرطان، وعندما تدار بشكل فردي أو في تركيبة مع أدوية أخرى، يمكن الشروع AKI. الزرد هي نموذج حيواني مفيد لدراسة تأثيرات المواد الكيماوية على وظيفة الكلى في الجسم الحي، كما أنها تشكل الكلى الجنينية يتكون من وحدات وظيفية كليون التي يتم حفظها مع الفقاريات العليا، بما في ذلك البشر. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الزرد لأداء شاشات الوراثية والكيميائية، والتي توفر فرصا لإلقاء الضوء على جوانب الخلوية والجزيئية لAKI ووضع استراتيجيات علاجية مثل تحديد جزيئات nephroprotective. هنا، علينا أن نظهر كيف microinjection فيويمكن استخدام الأجنة الزرد كنموذج للدراسات سم كلوي.
Introduction
آكي هو خسارة مفاجئة من وظيفة الكلى الذي يمكن أن يؤدي إلى عواقب صحية وخيمة 1. AKI قضية الرعاية الصحية كبيرة في جميع أنحاء العالم بسبب الإصابة في ارتفاع ما يقرب من 20٪ من المرضى في المستشفيات، مع معدلات أعلى من 30-50٪ في حالات الرعاية الحرجة وكبار السن، ومعدلات وفيات من 50-70٪ 1-3. للأسف، وانتشار آكي يتزايد، ومن المتوقع أن تزيد من تصعيد على مدى العقد المقبل، ويرجع ذلك جزئيا إلى تنوع العوامل التي يمكن أن تحدث AKI، والتي تشمل الإجهاد ما بعد الجراحة، نقص التروية، والتعرض لnephrotoxins مثل المضادات الحيوية و أدوية العلاج الكيميائي 4.
AKI ينطوي على تلف الخلايا المفاجئ في الكلى، والتي تحدث عادة في النيفرون، والتي هي وحدات وظيفية أساسية، وتتألف من تصفية الدم وأنبوب صغير مجزأة التي تستنزف البول في المسالك جمع المركزية 1. عندما عددا كبيرا من النيفرون همتضررت خلال AKI، وتشمل الآثار المباشرة انقطاع في إزالة النفايات من الدورة الدموية، وخفض أو إلغاؤها تدفق السوائل من خلال النيفرون بسبب عرقلة من الميتة والخلايا 1. مع مرور الوقت، يمكن أن انسداد أنبوبي يؤدي إلى انحطاط النيفرون بأكملها، مما يقلل من وظيفة الكلى 1 بشكل دائم. تشمل التعديلات الفسيولوجية في الكلى التالية آكي أيضا أحداث التهابات المعقدة التي يمكن أن تؤدي إلى تندب المزمن 1.
وعلى الرغم من هذه النتائج، النيفرون لديها بعض القدرة على الخضوع لتجديد بعد AKI أن reconstitutes 5،6 ظهارة أنبوبي. في حين كان هناك تفاهم الجزيئي المتزايد للتجديد كليون، تبقى آليات بعيد المنال في كثير من التحيات وتستلزم واصلت التحقيق 7. يبقى الدرجة التي ينتج AKI في تلف الكلى الدائم أيضا غير معروف. وتشير الأبحاث الحالية إمكانات التجدد لالكلى هيأعلى التالية الحالات الأقل شدة من AKI، في حين حلقات أكثر وضوحا أو المتكررة تؤدي إلى مرض الكلى المزمن (CKD) وتبلغ ذروتها في نهاية مرحلة المرض الكلوي (الداء الكلوي بمراحله الأخيرة) يتطلب زرع المنقذة للحياة أو غسيل الكلى 8،9. بالإضافة إلى ذلك، الأشخاص الذين يعانون بالفعل من كد هم في خطر أعلى للإصابة حاده حلقة من AKI 8،9. مجتمعة، فمن الواضح أن استمرار البحوث الأساسية والسريرية أمر حيوي لفهم ومعالجة ومنع AKI.
وكانت الأبحاث مع نماذج حيوانية مفيدة في تقدير تطور التغيرات المحلية والبيئية التي تحدث أثناء AKI 10. لتوسيع هذا الفهم، وكذلك تطوير علاجات جديدة، وقد تم استخدام نموذج حيواني الزرد في مجموعة متنوعة من الطرق 11،12. النيفرون في الكلى الزرد، في كل من جنين وتعليم الكبار، وعرض على درجة عالية من الحفظ مع الثدييات 13-16. وعلاوة على ذلك، والإصابة الظهارية كليون في زيbrafish يشبه العملية في الفقاريات العليا، التي يعقب تدمير المحلي الخلايا الأنبوبية التي كتبها الانتشار داخل النبيبات وإعادة الهندسة المعمارية كليون 17-19. في الجنين، ومع ذلك، يرتبط تلف أنبوب صغير واسعة من nephrotoxins مثل سيسبلاتين مع الفتك 20،21. وعلى سبيل المقارنة، البالغين الزرد البقاء على قيد الحياة AKI وتظهر قدرات التجدد الموضوعية في الكلى. على سبيل المثال، بعد التعرض لجنتاميسين المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد، الزرد تجديد أنبوب صغير الضرر الظهارية وتنمو وحدات كليون جديدة فضلا 22-24. في حين أن هذه الدراسات آكي الناجم عن جنتاميسين تقديم معلومات لا تقدر بثمن، فهم تلف الكلى من nephrotoxins المتنوعة أمرا حاسما في تقدير التأثيرات والاستجابة لأنواع مختلفة من الضرر 25.
الجنين الزرد، نظرا لحجمها، والشفافية، وقابلية الإستطراق الجيني، له فوائد عديدة للدراسات سم كلوي <سوب> 25، حيث يتم استخدام طريقة حقن مكروي 20،21 لإدارة جزيء (ق) للتحقيق فيها. تتشكل النيفرون بنسبة 24 آخر ساعة الإخصاب (HPF) والبدء في تصفية الدم قبل ما يقرب من 48 HPF 26،27. وهكذا، وتشكيل السريع وظيفة الكلى الجنينية يسهل التحليل التجريبي. ومع ذلك، فإن عملية حقن مكروي ديها تحديات تقنية ويمكن أن يكون هناك منحنى التعلم حاد لاتقان هذه التقنية. في هذه المقالة الفيديو، ونحن تصف كيفية تنفيذ إبر دقيقة جدا، وتقديم نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها من أجل تعزيز معدل الحقن الناجحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على إجراءات للعمل مع الأجنة الزرد الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة نوتردام.
1. إعداد حلول
- جعل حل 50X الأسهم وسائل الإعلام الجنين E3 عن طريق خلط 73.0 غرام كلوريد الصوديوم، 3.15 ز بوكل، 9.15 غ CaCl 2، و9.95 ز MgSO 4 في 5 لتر من الماء المقطر، وتخزينها في RT.
- لزراعة الأجنة الزرد، وتمييع الحل 50X الأسهم من الأسهم وسائل الاعلام الجنين E3 إلى حل العمل 1X بالماء المقطر، ثم يضاف 200 ميكرولتر من 0.05٪ الميثيلين الأزرق إلى كل 1 لتر من 1X E3 ليكون بمثابة فطريات، وتخزينها في RT.
- جعل حل تصبغ منع وسائل الإعلام الجنين E3 مع 0.003٪ 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) عن طريق الجمع بين 40 مل من الأسهم 50X E3 مع PTU 0.06 ملغ. ثم جعل حجم ما مجموعه 2 L مع الماء المقطر.
- تحريك E3 / PTU O / N في RT للحصول على مسحوق PTU إلى حل. ثم تخزين E3 / PTU فيRT.
ملاحظة: E3 / PTU لديه الصلاحية لمدة أسبوع تقريبا، وسوف الحلول القديمة تكون أقل فعالية في منع تطوير تصبغ في يرقات الزرد. - تقديم حل مخدر من 0.2٪ تريكين (MS-222) وذلك بإضافة 1 غرام من تريكين إلى 500 مل من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع 1 M تريس، ودرجة الحموضة 9.5.
- الاستعداد لتقديم حل ميثيل 2٪ للتصوير عن طريق وضع حل 1X E3 (لا الميثيلين الأزرق)، مع حجم ال 10/01 من 0.2٪ وأضاف تريكين في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: الحل ميثيل هو الحل سميكة، والواضح أن تستخدم لتحقيق الاستقرار بلطف الأجنة الحية للفحص المجهري. بعد يتم تنفيذ التلاعب الأجنة يمكن غسلها في 1X E3 بحل ميثيل دون إصابة الحيوان وتمكين المجهري في مراحل لاحقة في نفس العينة. - عندما تبرد إلى 4 درجات مئوية، وإثارة الحل 1X E3 / تريكين بقوة على طبق من ضجة وإضافة تدريجيا كمية مناسبة من الميثيلمسحوق السليلوز في حين تواصل اثارة بقوة. تدريجيا إضافة مسحوق إلى حل لمنع تشكيل المجاميع ميتيل غير قابلة للذوبان.
- بعد يتم خلط كل مسحوق في 2٪ محلول ميتيل / E3 / تريكين، وإثارة الحل المركب في 4 درجات مئوية الغرفة الباردة O / N.
ملاحظة: درجات الحرارة الباردة هو أفضل لإذابة تماما مسحوق. إذا كان هذا الحل ليس واضحا بعد ليلة واحدة، وإثارة لساعات العمل الإضافي و / أو O الثاني / N. - لإزالة فقاعات الهواء من 2٪ ميتيل / E3 حل / تريكين، قسامة الخليط في أنابيب 1.5 مل وتدور بسرعة عالية (12،000 x ج) في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو لتصل إلى 2 ساعة.
- ضع 2٪ ميثيل حل / E3 / تريكين في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: قبل الاستخدام وقسامات يجب أن يكون قبل تحسنت إلى RT للعمل مع العينات الزرد.
2. إعداد أدوات
- إعداد أداة الجنين مناور، وتستخدم لحماماتsitioning الأجنة ل microinjection، عن طريق ربط طرف جل التحميل على نهاية 5 "إبرة تشريح التوالي، وآمنة مع الشريط أو superglue.
- إعداد microinjection الإبر باستخدام مجتذب إبرة، عن طريق وضع أول حريق مصقول 10 سم زجاج البورسليكات مع خيوط في الصك وتأمين الزجاج البورسليكات من خلال تشديد المقابض.
- سحب الزجاج البورسليكات لأزياء الإبر غرامة مدبب. استخدام الإعدادات التالية: حرارة 540، وسحب 245، سرعة 200، والوقت 125.
- مكان الإبر داخل طبق بتري، تعليقها على شريط من الصلصال لحماية نصائح إبرة، والحفاظ على طبق مغطى لمنع تراكم الغبار.
- لإنهاء إعداد إبرة للإبر دقيقة جدا، واستخدام شفرة حلاقة أو ملقط غرامة حافة لقطع في نهاية سحبت من الإبرة إلى إنشاء حاد حقن طرف الزاوي التي يبلغ قطرها حوالي 0،05 حتي 0،1 ملم.
- لجعل علبة حقن مكروي، إعداد محلول 1.5٪ الاغاروز / E3 في 100 مل دورق مخروطي سعة وحل الاغاروز عن طريق تسخين E3 ليغلي في الميكروويف ثم يترك ليبرد على RT لمدة حوالي 10 دقيقة.
- من أجل حل الاغاروز / E3 تبرد في طبق بيتري لجعل الأساس وعلى عمق حوالي 0.5 سم. عندما عزز هذا صب طبقة ثانية على عمق حوالي 0.3 سم وإدراج الجاهزة الجنين جيدا العفن، والسماح للالاغاروز ليصلب في RT.
ملاحظة: عند إدخال القالب في أعلى أجار / E3 طبقة، ووضع القالب في أجار في زاوية لخفض عدد من فقاعات الهواء. - وعندما وضعت علبة حقن مكروي كامل، ورفع الجنين الجاهزة العفن جيدا ببطء وبعناية باستخدام سكوبولا، ثم ملء الطبق مع حل E3 وتخزين عند 4 درجات مئوية.
3. الأجنة إعداد
- انشاء خزانات التزاوج الزرد عن طريق وضع فواصل إلى غرف التزاوج وملء مع الماء النظام.
- ضع السمك واحدة على كل جانب من المفرق الصورةاوك أن كل غرفة تحتوي على التزاوج امرأة واحدة والأسماك واحد من الذكور، وتشمل كل غرفة التزاوج.
- في صباح اليوم التالي، وإزالة فواصل لتمكين وضع البيض.
- تحقق السمك بعد ما يقرب من 30 دقيقة، وبعد عودته من البالغين إلى الحوض، وجمع الأجنة عن طريق تمرير الماء من خزان التزاوج من خلال أداة مصفاة سلك شبكة غرامة.
- عكس مصفاة على طبق بيتري وشطف مع E3 لجمع الأجنة.
- احتضان الأجنة في 28.5 درجة CO / N.
- عندما وصلت إلى الأجنة في مرحلة 24-26 الجسيدة 26، صب معظم وسائل الإعلام E3 ثم dechorionate بإضافة 100 ميكرولتر من 50 ملغ / مل pronase إلى كل طبق من الأجنة واحتضان طبق في RT (23 درجة مئوية) لمدة ما يقرب من 15 دقيقة.
ملاحظة: وسوف يستغرق حوالي 24-25 ساعة من وقت حدوث الإخصاب لأجنة للوصول إلى مرحلة 24-26 الجسيدة إن جمعت بطريقة وصفت وحضنت O / N عند 28.5 درجة مئوية. - ملء الطبق معE3 ثم دوامة بلطف لإزاحة chorions من الأجنة.
- صب E3 / pronase وشطف الطبق مع 25 مل من E3 جديدة. كرر الخطوة شطف لإزالة جميع pronase.
- لمنع تطور تصبغ، صب E3 واستبدالها مع 25 مل من جديد E3 / PTU عندما وصلت الأجنة 24 ساعة بعد الإخصاب.
ملاحظة: للحصول على التجارب التي تغطي عدة أيام، يستعاض عن حل E3 / PTU مع وسائل الإعلام الجديدة مرة واحدة يوميا للحفاظ على طبق نظيف.
4. Microinjection من سم كلوي الحل
- في يوم من الحقن، وإعداد حل سم كلوي المطلوب إلى جانب السيطرة على السيارة المناسبة.
- دوامة أو المزيج بلطف لضمان المخدرات (ق) هو / هي في حل، والتحقق من جانبي الأنبوب وأعلى من عمود الماء.
ملاحظة: الحلول سم كلوي يمكن أن تكون على استعداد لتحتوي على كميات ضئيلة من ديكستران مترافق fluorescently لمراقبة كفاءة حقن مكروي وأيضا تقييم التصفية الكلوية في subseqالوقت uent يشير 20،28. - تحميل إبرة حقن مكروي قلص مع ~ 2-3 ميكرولتر من سم كلوي بواسطة خيوط غرامة طرف جل التحميل في الجزء الخلفي من الإبرة وتعليق الإبرة عموديا مع قطعة من الشريط للسماح للحل لملء طرف الإبرة قلص عن طريق الجاذبية.
- مرة واحدة في رأس الإبرة هو الكامل، وتأمين إبرة تحميلها في micromanipulator.
- اختبار حجم حقن مكروي عن طريق وضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرون وحقن في الزيت لتقييم حجم القطيرات. وحجم الحقن من 500 رر التي يبلغ قطرها 0.1 ملم.
- إزالة طبق من الأجنة من الحاضنة، وتخدير عن طريق إضافة حوالي 5 مل من 0.2٪ تريكين إلى الطبق الجنين.
- لضمان التخدير الكامل، المس بلطف الجنين مع غيض من أداة الجنين مناور. قلة الحركة يشير تخدير كاف.
- بعد التخدير الناجح، ونقل الأجنة إلى حقن القالب مع transfإيه ماصة.
- مناورة كل جنين في بئر مختلفة من العفن وضع الرأس في أعمق منطقة مثل جيدا أن جذع تقع على طول الاكتئاب والذيل العصي حتى من الاكتئاب.
- ادخال الإبرة شغل في micromanipulator وموقف طرف الإبرة بجانب الجنين.
- إدراج بلطف إبرة في الإناء ذيل بتحريك عصا التحكم إلى الأمام، وتضغط على دواسة القدم لتقديم حقن مكروي.
ملاحظة: حقن الناجح يمكن قياس من خلال مشاهدة السائل يدخل الدورة الدموية. وعلاوة على ذلك، وشارك في حقن nephrotoxicant مع ديكستران مترافق fluorescently تمكن الباحث للتحقق من نجاح الحقن لاحق لهذا الإجراء. - سحب بلطف مرة أخرى على عصا التحكم لإزالة الإبرة من الجنين.
- بعد الحقن، ونقل الأجنة إلى طبق نظيف وشطف لإزالة تريكين واستبدالها مع الطازجة E3 / PTU.
- احتضان الجنين الى نقطة الوقت المطلوب لالحميرالصورة التشكل، والتي يمكن أن تكون موثقة عن التصوير في ميثيل سائل الإعلام المتصاعدة، أو عملية التحليل التجريبي كما تريد.
ملاحظة: يجب تقييم استرداد الأجنة لتحديد نسبة الأفراد الذين يعانون من وذمة، مما يدل عادة الإصابة الكلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
محطة حقن مكروي اقامة يتضمن مجهر تشريحي، micromanipulator ومنظم ضغط (الشكل 1A). تضوء من لوحة حقن هو الأفضل لعرض العينات خلال هذا الإجراء (الشكل 1B). إعداد إبرة الحقن ينطوي على سحب الزجاج البورسليكات المناسب، تليها إعداد حافة مع قطع والخلفية تحميل إبرة في نهاية المطاف. على النحو الأمثل، ومشطوف طرف الإبرة وليس فظة (الشكل 1C)، قطع التي يتم إجراؤها من قبل تتحين الفرصة بشكل حاد حافة أداة القطع، مثل ملقط غرامة، أثناء عملية القطع (1D الشكل). هذه الحافة مشطوف أمر بالغ الأهمية، وسوف تؤثر بشكل كبير على القدرة على إدراج بلطف الإبرة في الزرد.
في يوم من الحقن، وتمركزت أجنة باستخدام الجنين قوي لكن لين العريكةأدوات التلاعب (الشكل 1E). للحقن، وناور الأجنة، مثل أن الجذع استراح على طول الجانب من علبة الحقن لتوفير ضغط للخطوة اللاحقة حقن (الشكل 1F). في حين حقن، ينبغي للمرء أن التركيز الطائرة نظر حول الجذع الجنينية لتصور وجهة الأوعية الدموية لإدخال إبرة ومن ثم مراقبة المواد حقن تدخل الدورة الدموية (الشكل 1G).
شفافية الجنين الزرد تسهل إجراء حقن مكروي، ويمكن تعزيزه عن طريق العلاج الكيميائي PTU في 24 HPF للتخفيف من تطوير تصبغ خلال دورة زمنية تجريبي نموذجي (الشكل 2A). هنا، سمح العينات الجنين لتطوير خلال المرحلة 72 HPF، ثم إما وهمية حقن، microinjected مع سيارة المالحة، أو microinjected مع 2.5 ملغ / مل الجنتاميسين (الشكل 2A).وقد أجريت المراقبة الحية لاحقة في يوم ويومين آخر الحقن، وذلك باستخدام الإضاءة تضوء مع مجهر تشريحي (الشكل 2B). مقارنة الأجنة وهمية أو المالحة حقن، أظهر فقط الأفراد حقن جنتاميسين تطوير وذمة (الشكل 2B)، في هذه الحالة ذمة التامور، مما يدل على إلغاء وظائف الكلى طبيعية تتفق مع الملاحظات التي تم نشرها مسبقا 11،20،21.
الشكل 1. أجهزة وأدوات حقن مكروي. (A) محطة حقن اقامة مع مجهر تشريحي (يسار)، micromanipulator وحامل إبرة (وسط) ومنظم الضغط (إلى اليمين). (ب) تضوء من لوحة الحقن. (C) اليسار: بلانت قطع إبرة. الحق: مشطوف قطع إبرة. (D) Fاستخدم ملقط المعهد الوطني للإحصاء لخفض نصائح إبرة. (E) أدوات التلاعب تستخدم لادخال ووضع العينات في القالب حقن. (F) الأجنة المحتشدة في قالب حقن مكروي. شريط مقياس = 0.5 مم. (G) لتحديد المواقع من الإبرة إلى جانب جنين للحقن. شريط مقياس = 0.15 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التجريبية جدول زمني وحقن آخر ذمة فحص (أ) مثال سم كلوي زمني التجريبي في الزرد، تطبيق هنا لدراسة جنتاميسين. تم dechorionated الأجنة وتعامل مع حل PTU في 24 مشاركة ساعة الإخصاب (HPF). كل يوم، وكان يصب على حل PTU واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة كما يتضح من smalleص الأسهم الخضراء. في 72 HPF، تم تخدير الأجنة، ونقل إلى حقن القالب وبعد ذلك تعامل على النحو التالي: وهمية حقن أو حقن إما المالحة (السيطرة على السيارة) أو الجنتاميسين. بعد إحياء الأجنة في وسائل الإعلام الجديدة، لوحظت الأجنة في 1 و 2 أيام بعد الحقن (96 و 120 HPF، على التوالي) للتحليل والحصول على الصور. (ب) الأعلى: uninjected الجنين الزرد. الأوسط: الجنين حقن في 72 HPF مع المياه المالحة. أسفل: الجنين حقن مع 2.5 ملغ / مل الجنتاميسين. شريط مقياس = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ارتبطت عدد متنوع من العوامل العلاجية مع آكي 29. كانت هناك التقدم في البحوث كبيرة في فهم الضرر الناجم عن العديد من المركبات الفردية، مثل أمينوغليكوزيد جنتاميسين (30) وسيسبلاتين العلاج الكيميائي المستخدمة على نطاق واسع 31،32. بعض التغيرات المرضية المتورطين في هذه الظروف، ومع ذلك، لا تزال موضع دراسة مستمرة. لا تزال واحدة التحدي الناشئ فهم كيفية عمل عقاقير متعددة تؤثر سلبا على المرضى، لا سيما في السكان المعرضة للخطر مثل تلك الموجودة في أماكن الرعاية الحرجة وكبار السن 29. وهكذا، ونماذج التي تمكن مزيد من الدراسات على أساس الخلوية حول آثار آكي المخدرات التي يسببها تؤدي دورا هاما في تحسين الكشف عن هذا الشرط وتقدير المخدرات التفاعلات الحيوية.
العمل مع نماذج الثدييات مثل الماوس والفئران كانت جزءا لا يتجزأ من تحديد التغيرات الخلوية في الكلى التالية AKI، بور الحد واحد مع هذه الأنظمة هو أن الملاحظة المباشرة، في الوقت الحقيقي يقتصر نظرا لتعقيد المعماري والموقع الداخلي للهيئة. وببساطة، فإن الكلى غير قابل للملاحظة المباشرة، وهو ما يتطلب أن تتم التضحية الأفراد لتحليل الكلى. هذه القيود يمكن مواجهتها باستخدام الأجنة الزرد، والتي تشكل الكلى بسيط اثنين من النيفرون أن يكون لها هيكل قطاع محفوظ مع الفقاريات الأخرى، بما في ذلك البشر 33. تحدث تنمية الزرد الرحم السابقين ومع تصبغ طفيفة، مما يسمح للمراقبة المباشرة للتوالد الكلوي ورصد الاستجابات للمنبهات الخارجية 34. وقد تم استخدام أدوات التحليل الجزيئي، مثل التعبير الجيني 35-37، مع ارتفاع القرار لتحديد ملامح تكون الكلية 38-40. التلاعب التجريبية لاختبار الجزيئات الصغيرة من خلال الوراثة الكيميائية راسخة في الزرد وتنطبق على kidnإرنست و يونغ 41-43. في الواقع، في السنوات الأخيرة، طبقت الزرد لنموذج الكلوية وكلاء تتراوح بين acetominophen إلى السموم الفطرية وحمض aristolochic 44-48. من المهم أن نلاحظ أن هناك أيضا قيود كبيرة على النمذجة AKI في الجنين الزرد، بسبب بساطة جدا من هيكل الكلوي في هذه المرحلة من التنمية. على سبيل المثال، ليست مناسبة الزرد لمعالجة التفاعلات متعددة العوامل داخل أنسجة الكلى التي تعج النيفرون التي تحيط بها سدى معقد يحتوي على العديد من أنواع الخلايا الخلالية، كما هو الحال في القوارض أو الكلوة التالية الإنسان. وبالتالي، هي الأنسب الزرد إلى تصور التغيرات الخلوية والجزيئية مستقلة في كليون خلال AKI.
طريقة حقن مكروي وصف هنا، في حين وجود منحنى التعلم حاد، مفيد جدا لدراسة الدولتين التنموية والمرض بما في ذلك nephrotoxins. هذه التقنية يمكن استخدامها لالشركة المصرية للاتصالاتالمخدرات الحادي منفردة أو مجتمعة. بالإضافة إلى ذلك، والحقن لا يمكن أن يؤديها خلال مجموعة واسعة من نقطة زمنية التنمية. غير أن طريقة قابلة للحياة على قدم المساواة مماثل لأداء إبر دقيقة جدا عن طريق الوريد في يرقات الزرد وقد وصفت من قبل كوسنتينو، وآخرون. 21. واحد تمييز كبير في منهجيتها، بالمقارنة مع الأساليب المذكورة هنا، هو أن الجنين ليتم حقنه ويجمد باستخدام ماصة عقد 21. استخدام ماصة عقد هو بديل قابل للتطبيق لحقن القالب. الباحثون الذين يسعون لتنفيذ حقن مكروي باعتباره طريقة التسليم للعملاء nephrotoxicant يجب أن يكون على بينة من هذا البديل وقد ترغب في مقارنة الأساليب لتحديد أي هو الأفضل شخصيا، كما تعلم التعامل مع ماصة عقد حتى لا يضر الجنين سيشمل الممارسة مثلما يتطلب ممارسة على المناورة بنجاح وmicroinject باستخدام حقن القالب بسيط مع تجويف الاكتئاب لEMBRيوس.
عند تنفيذ هذا الإجراء، فمن الأهمية بمكان لإعداد إبر الحقن بحجم مناسب، وخفض زاوية على طرف إبرة لتحسين سلاسة دخول والخروج إلى الدورة الدموية الجنينية. أثناء إجراء الحقن، فمن الأهمية بمكان لمراقبة حجم الحقن لتقييم اتساق تسليم سم كلوي بين العينات. التقييم الدوري للحجم الحقن مع ميكرومتر يمكن أن يؤديها إذا كان الباحث غير مؤكد حول التغييرات في حجم أثناء تنفيذ التجربة. على سبيل المثال، ويرجع ذلك إلى طبيعة تقنية، رأس الإبرة يمكن جزئيا أو كليا تسد مع الحطام الخلوي. هذه المضاعفات يمكن مواجهة ذلك عن طريق إزالة الإبرة بشكل دوري لضمان اتساق السائل طرد. بالإضافة إلى ذلك، صبغة حيوية مثل الفينول الأحمر يمكن أن تضاف إلى الخليط ليكون بمثابة علامة بصرية الحقن والمساعدة في رصد انتشار السوائل 49،50. وعلاوة على ذلك، يمكن حقن جزيئات التتبع أن تساعد فيتصور السكان خلية معينة، وبعد الحقن. للمشاركة في حقن جزيئات ديكستران الفلورسنت، وتحديدا 10 كيلو دالتون تقارن ديكستران، لديها عدد من التطبيقات 16،17. في هذه الحالة، وتقييم كثافة الفلورسنت لا يمكن أن يؤديها على الفور باتباع الإجراء لتأكيد حقن مكروي ناجحة مع الحد الأدنى من التسرب. ويمكن قياس كثافة استخدام المناسب التصوير الفوتوغرافي التقاط صورة ومن ثم إعادة النظر في نقاط زمنية لاحقة لقياس التغير في كثافة الفلورسنت وذلك لقياس التصفية الكلوية 51. وعلاوة على ذلك، استيعاب للديكستران في النبيبات الدانية ويقدم وكيل حصول على وظائف من هذا القطاع كليون 16،17.
أخذت معا، وهناك العديد من الطرق التي حقن مكروي يمكن استخدامها لتحقيق AKI مع الزرد، لا سيما ويوفر هذا النموذج الفرصة لمعالجة الدوائية في الجسم الحي. وهكذا، يتقن مرة واحدة، Microinjection من nephrotoxinsفي الجنين الزرد تقدم نموذجا مفيدا للدراسات الكلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المنحة DP2OD008470 المعاهد الوطنية للصحة. بالإضافة إلى ذلك، كان مدعوما من ذاكرة الوصول العشوائي في جزء من الأموال المقدمة من جامعة نوتردام مدرسة نوتردام العليا. نشكر الموظفين من قسم العلوم البيولوجية، ومركز للبحوث اسماك الزرد، ومركز للخلايا الجذعية والطب التجديدي في جامعة نوتردام. نخص بالشكر أعضاء مختبر لإشراك مناقشات حول علم الأحياء الكلى وتغذية راجعة مفيدة على هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning: | |||
| 60 mm x 15 mm | VWR | 25373-085 | |
| 100 mm x 15 mm | VWR | 25373-100 | |
| (microinjection tray) 150 mm x 15 mm | VWR | 25373-187 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Micrometer | Ted Pella, Inc. | 2280-24 |
References
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
- Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
- Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
- Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
- Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
- Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
- Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
- Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
- Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
- Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
- McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
- Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
- Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
- Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
- Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
- Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
- Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
- McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
- Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
- Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
- Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
- Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
- Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).
