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Biology

肾毒素显微注射斑马鱼到模型急性肾损伤

doi: 10.3791/54241 Published: July 17, 2016

Summary

从肾毒素,其中包括药品,从抗生素对化疗药物产生的肾损伤,可导致复杂的疾病,其发病机制尚未完全清楚。这个协议演示斑马鱼如何可以用于这些条件下,它可以被应用到的肾脏保护措施的识别疾病建模。

Abstract

肾脏是容易暴露在他们从血液中过滤化学物质伤害。这会导致与在肾功能和临床症状称为急性肾损伤(AKI)的发展迅速下降有关器官损伤。药剂用于治疗的医疗情况,从细菌感染到癌症,当单独给药或与其它药物组合,可以发起AKI。斑马鱼是一个有用的动物模型来研究对肾功能的化学作用在体内 ,因为它们形成由那些保守与高等脊椎动物,包括人类在内的肾功能单位的胚胎肾。此外,斑马鱼可以用于执行遗传和化学屏幕,这提供机会以阐明AKI的细胞和分子方面和开发治疗策略如肾保护分子的鉴定。在这里,我们将演示如何显微注射入斑马鱼胚胎可以用作用于肾毒素研究一个范例。

Introduction

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AKI是肾功能可能导致灾难性的健康后果1的突然损失。 AKI是一个显著的医疗保健问题,全世界由于约20%的住院患者中的发病率很高,在重症监护的情况下30-50%甚至更高的速率和老人,以及50-70%的1-3死亡率。不幸的是,AKI的发病率不断上升,预计未来十年进一步升级,部分原因是由于多种因素的多样性,可诱发急性肾损伤,包括手术后应激,缺血和接触到的肾毒性,如抗生素和化疗药物4。

AKI涉及肾脏内突细胞损伤,在肾,这是必要的功能单元,并且是由一个血液过滤器和排出尿进入中央集合管1的分段小管通常发生。当肾的一个显著数目是AKI过程中被损坏,直接影响包括从循环通过从死亡和垂死的细胞1由于阻塞肾单位在废弃物清除中断,并减少或废除流体流动。随着时间的推移,肾小管阻塞可导致肾整,永久地降低了肾功能1退化。在肾脏生理改变以下的AKI也涉及复杂的炎性事件,可导致慢性结疤1。

尽管有这些成果,肾有一定能力的AKI的进行重构肾小管上皮细胞5,6后接受再生。虽然出现了肾再生的分子越来越了解,该机制仍然在许多方面难以捉摸和必要继续调查7。在何种程度AKI导致永久性肾损害也仍然不明。目前的研究表明,对肾脏的再生潜能是最高以下AKI的较不严重的情况下,而更明显或反复发作导致慢性肾脏病(CKD)和终末期肾病(ESRD),需要救生移植或透析8,9-高潮。此外,个人从CKD已经患有处于收缩AKI 8,9的严重发作的风险更大。两者合计,很明显,持续的基础和临床研究是至关重要的理解,治疗和预防AKI。

研究与动物模型已经在欣赏AKI 10期间发生的本地和环境的改变的进展工具。为了扩大这种认识以及开发新的疗法,斑马鱼的动物模型已经在以各种方式11,12使用。斑马鱼肾脏的肾单位,在胚胎和成人两种,显示与哺乳动物13-16高度保护。另外,在泽肾上皮损伤brafish类似于高等脊椎动物,由此肾小管细胞的局部破坏之后是管内增殖和肾结构17-19的重建过程。在胚胎,但是,从像顺铂的肾毒性广泛肾小管损伤与杀伤力20,21相关联。相比之下,成年斑马鱼生存AKI并表现在肾脏实质性的再生能力。例如,在暴露于氨基糖苷类抗生素庆大霉素,斑马鱼再生肾小管上皮损伤,增加新的肾单位以及22-24。虽然这些庆大霉素引起的AKI的研究提供了宝贵的资料,了解来自不同的肾毒性肾功能损害仍然至关重要升值的影响,并应对不同类型的损害25。

斑马鱼胚胎,由于其大小,透明度和遗传易处理性,对肾毒素的研究很多好处<SUP> 25,其中,用于管理调查的分子(多个)注射20,21的方法。肾是由24小时受精后(HPF)形成,并开始约48 HPF 26,27来过滤血液。因此,胚胎肾的迅速形成和功能便于实验分析。然而,显微注射的过程中具有技术挑战,并有可能是一个陡峭的学习曲线,以掌握该技术。在这个视频文章中,我们将介绍如何执行显微注射​​,并以提高成功的注射速度提供故障排除技巧。

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Protocol

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对于在本协议中所描述斑马鱼胚胎工作的过程被机构动物护理和使用委员会在Notre Dame大学的批准。

1.溶液的制备

  1. 通过在RT混合73.0克氯化钠,3.15克氯化钾,9.15克CaCl 2,并在5升蒸馏水9.95克硫酸镁 ,并存储使E3胚胎介质的50倍原液。
  2. 对于斑马鱼胚胎的培养中,稀释的E3胚胎媒体库存的50倍原液用蒸馏水1X工作液,再加入200微升的0.05%的亚甲基蓝的每1升1倍的E3作为杀菌剂,并储存在RT。
  3. 40毫升50×E3库存与0.06毫克PTU组合使E3胚胎媒体与0.003%1-苯基-2-硫脲(PTU)一个色素沉着封闭溶液。然后使体积到总共2L的蒸馏水。
  4. 炒出的E3 / PTU O / N在室温得到PTU粉成溶液。然后存储E3 /在PTURT。
    注意:E3 / PTU具有大约一周的保质期,和更老的解决方案将是在斑马鱼幼体阻断色素发展不太有效。
  5. 通过加入1g三卡因到500毫升蒸馏水使0.2%三卡因(MS-222)的麻醉剂溶液并用1M Tris,pH值9.5将pH调节至7.2。
  6. 制备通过将1×E3(无亚甲蓝)的溶液中,使用于成像的2%的甲基纤维素溶液中,用0.2%三卡因加入在4℃1/10体积。
    注意:甲基纤维素溶液是用来轻轻稳定显微镜活胚胎厚,透明的溶液。操作被执行后的胚胎可以在1×E3洗涤以溶解甲基纤维素不损伤动物并在同一检体后续阶段使显微镜。
  7. 时冷却至4℃,剧烈搅拌在搅拌盘1倍E3 /三卡因溶液逐步添加甲基适量同时继续纤维素粉末剧烈搅拌。逐渐将粉末添加到该溶液中,以防止不溶性甲基纤维素聚集体的形成。
  8. 所有的粉末混合到2%甲基纤维素/ E3 /三卡因溶液后,搅拌在4℃冷室O / N复合材料解决方案。
    注:低温是最好的粉末溶解完全。如果一个晚上后,解决的办法是不明确的,搅拌额外的工作日和/或第二O / N。
  9. 从2%甲基纤维素/ E3 /三卡因溶液,等分试样的混合物在4℃下30分钟或高达2小时除去气泡进入以高速(12 000 XG)2.4毫升管和旋转。
  10. 放置在4℃的2%甲基纤维素/ E3 /三卡因溶液长期储存。
    注意:在此之前,用法,等份应预先温热至RT用于与斑马鱼标本工作。

2.工具的制备

  1. 准备一个胚胎操纵的工具,用于采购订单sitioning胚胎显微注射,通过连接在一个5“直解剖针的端部的凝胶加载提示,并用胶带或强力胶固定。
  2. 首先将火准备用针管注射拔针头,抛光10厘米硼硅玻璃长丝放入仪器,并拧紧处理安全硼硅玻璃。
  3. 拉硼硅玻璃时尚细锥形针。使用以下设置:加热540,拉245,速度200和125的时间。
  4. 培养皿内放置针,上橡皮泥条暂停,以保护他们的针尖,并保持覆盖,防止灰尘堆积的菜。
  5. 完成制备用于显微注射的针,用剃刀刀片或细镊子边缘切针的拔出端以创建一个尖锐的角注射针尖的直径为约0.05-0.1毫米。
  6. 为了使显微注射托盘,准备在一个10 1.5%琼脂糖/ E3溶液0毫升锥形瓶中,并通过在微波的E3加热到沸腾,然后允许在室温冷却约10分钟,溶解琼脂糖。
  7. 倒入冷却的琼脂糖/ E3溶液放入培养皿,使基础具有大约0.5cm的深度。当这已固化的倾具有大约0.3厘米的深度的第二层,并插入预制胚胎以及模具和允许琼脂糖在RT固化。
    注意:当插入模具插入顶层琼脂/ E3层,将所述模具放入琼脂以一个角度以减少气泡的数目。
  8. 当整个注射托盘已成立,抬预制胚胎以及塑造出缓慢而小心地使用scoopula,然后填写与E3的解决方案和存储的菜在4℃。

3.胚胎制备方法

  1. 通过将分隔成交配室设立斑马鱼交配坦克,并与系统中的水满。
  2. 放置一个鱼分频器的S每侧UCH每个交配室包含一雌一雄鱼,并覆盖每个配合腔。
  3. 第二天早晨,取出分隔,使产卵。
  4. 检查鱼后约30分钟,并返回成年人水族馆后,通过传递配合水箱水通过细筛网过滤工具收集他们的胚胎。
  5. 倒置滤网过培养皿和E3冲洗收集胚胎。
  6. 在28.5°CO / N孵育胚胎。
  7. 当胚胎已达到24-26体节阶段26,倒出大部分E3介质中,然后dechorionate加入100微升的50毫克/毫升的链霉蛋白酶胚胎的每个培养皿大约15温育在室温(23℃)的菜分钟。
    注意:这将需要约24-25小时,从受精的时间,如果他们被收集在方式描述并在28.5℃培养O / N胚胎达到24-26体节阶段。
  8. 装满菜E3然后轻轻漩涡撞出从胚胎绒毛膜。
  9. 倒出E3 /链霉,用25毫升新鲜E3漂洗菜。重复冲洗步骤去除所有链霉。
  10. 要阻止色素沉着的发展,倒出E3并用25毫升新鲜的E3 / PTU的时候胚胎已经达到24小时受精后更换。
    注意:对于实验跨越数日,每日更换一次新鲜的媒体E3 / PTU解决方案,以保持干净的菜。

4.肾毒素显微注射的解决方案

  1. 关于注射的当天,制备用适当的车辆控制沿着所需肾毒素溶液。
  2. 涡流或轻轻混匀,以确保药物(s)是/都是在溶液中,检查水柱的管和顶部的两侧。
    注意:肾毒素溶液可以制备成含有荧光缀合的葡聚糖的痕量监测显微注射效率和也在subseq评估肾清除uent时间点20,28。
  3. 通过螺纹细凝胶加载提示到针的后部装入〜2-3微升肾毒素的修整显微注射针和用一块胶带的垂直暂停针以使该溶液通过重力来填充修整针尖。
  4. 一旦针尖是满的,固定在显微加载针。
  5. 通过将矿物油的液滴到微米滑动测试注射体积和注射进油来评价液滴尺寸。 500复注射体积的直径为0.1毫米。
  6. 除去从培养箱胚的培养皿,并通过加入约5mL的0.2%三卡因的对胚胎菜麻醉。
  7. 为了确保完全麻醉,轻轻地用胚胎操纵工具的尖端碰触胚胎。缺乏运动的指示充分麻醉。
  8. 麻醉成功后,转移胚胎到注塑模具用TRANSF呃吸管。
  9. 机动每个胚胎成不同以及模具放置头井使得行李箱沿凹陷休息和尾巴竖起走出抑郁的最深处的区域。
  10. 将填充进针显微和针尖位置,旁边是一个胚胎。
  11. 轻轻地向前移动操纵杆针头插入尾容器并踩下脚踏板提供显微注射。
    注:成功注入可以通过观察液体来衡量进入流通。另外,用荧光结合的葡聚糖的nephrotoxicant的共注射使研究者来验证到程序随后成功注入。
  12. 轻轻地向后拉操纵杆,从胚胎中取出针。
  13. 注射后,将胚胎转移到一个干净的菜和冲洗以除去三卡因,并用新鲜的E3 / PTU替换。
  14. 孵育胚胎到所需的时间点到驴小号的形态,其可通过摄影在甲基纤维素安装介质,或处理根据需要被记录为实验分析。
    注:胚胎的复苏应该评估,以确定个人的水肿,其中常见的指示肾损伤的百分比。

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Representative Results

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显微注射站设立包括立体显微镜,显微操纵器和压力调节器( 图1A)。注入板的透优选此过程( 图1B)中,以查看标本。注射针的制备涉及拉适当硼硅酸盐玻璃,然后通过制备用切割和最后背加载针的边缘。最佳地,针尖斜面,而不是在切割过程期间钝( 图1C),这是由急剧斜着切割器械,边缘制成,例如细钳子的切口, 图1D)。这个斜面边缘是关键的,将极大地影响到针轻轻插入斑马鱼的能力。

上注射当天,胚胎使用坚固但柔韧胚胎定位操作工具( 图1E)。对于注射,胚胎操纵,使得该躯干沿注入托盘的侧休息以提供用于随后的注射步骤( 图1F)的杠杆作用。同时注入,应该着眼于胚胎躯干的角度平面的可视化的针插入血管目标,然后观察注射材料进入流通( 图1G)。

斑马鱼胚胎的透明性有助于显微注射过程,并且可以进一步通过PTU的化学处理在24高倍视野增强一个典型的实验时间过程( 图2A)中,以减少色素沉着的发展。这里,胚胎标本被允许通过72 HPF阶段发展,然后要么模拟注射,显微注射用生理盐水车辆,或具有2.5毫克/毫升庆大霉素( 图2A)显微注射。随后现场观察,于一天和两天后喷射进行,使用透射照明用立体显微镜( 图2B)。相比模拟或盐水注射的胚胎中,只有庆大霉素注射个体表现出水肿的发展( 图2B),在这种情况下心包水肿,提示的正常肾功能与先前公布的观测11,20,21相一致的废除。

图1
图1 的显微注射装置和工具。(A)的注入站设置与立体显微镜(左),显微和针保持器(中)和压力调节器(右)。注入板的(B)中透照。 (C)左图:冲裁针。右:斜面切割针。 (D)的FINE钳用于切割针尖。 (E)用于插入和试样放置到注射模具操纵的工具。 (F)胚胎摆着显微注射模具。比例尺= 0.5mm左右。 (G)的针的定位毗邻胚胎用于注射。比例尺= 0.15毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.实验时间表和注射后水肿检测。(A)例肾毒素在斑马鱼实验时间表,在这里应用到庆大霉素研究。胚胎dechorionated并在24小时后受精(HPF)PTU溶液处理。每一天中,PTU溶液倾析,并用新鲜介质替换为小了指示r绿色箭头。在72 HPF,胚胎被麻醉,转移至注射模具中,然后进行如下处理:模拟注射或注射盐水(载体对照)或庆大霉素。在新鲜培养基振兴胚胎后,在1和2天后注射(96和120高倍视野,分别)用于分析和图像采集,观察胚胎。 (B)上图:未注射斑马鱼胚胎。中东:胚胎在72 HPF注射生理盐水。底部:胚胎注射2.5毫克/毫升庆大霉素。比例尺= 0.5毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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治疗药物的不同数量已与AKI 29有关。已经出现了在理解由许多单独的化合物,如氨基糖苷类庆大霉素30和广泛使用的化学治疗顺铂31,32引起的损伤显著研究进展。参与这些条件下一些病理变化,但是,仍正在进行的研究的主题。一个新兴的挑战仍然是如何理解多种药物产生不利影响的患者,高危人群尤其是那些如在重症监护设置和老人29。因此,模式,使关于药物诱导的AKI的效果进一步蜂窝基础的研究服务改善这种状况的检测和欣赏动态药物相互作用中起重要作用。

哺乳动物模型,如小鼠和大鼠的工作已经积分建立在肾脏以下AKI细胞变化,卜t的一限制这些系统是直接,实时的观察是由于建筑复杂性和脏器内部的位置的限制。简单地说,肾脏不适用于直接观察,这需要个人被牺牲来分析肾。这些限制可通过使用斑马鱼的胚胎,其形成有与其他脊椎动物,包括人33的保守区段结构中的两个肾的简单肾脏被抵消。斑马鱼发育发生子宫外 ,并有轻微的色素沉着,允许外部线索34的肾器官和响应监测的直接观察。用于分子分析工具,如基因表达的35-37,已经利用具有高分辨率,以确定nephrogenesis 38-40的特性。通过化学遗传学的小分子检测实验操作已经非常成熟的斑马鱼和适用于kidnEY 41-43。事实上,在最近几年,斑马鱼已经被应用到模型的代理从对乙酰氨基酚到真菌毒素和马兜铃酸44-48肾毒性。要注意,也有在斑马鱼胚胎的AKI建模显著的局限性,因为肾结构的在这个阶段中发展的非常简单的是重要的。例如,斑马鱼不适合于寻址肾组织被密集地填充有由一个复杂的基质包含多个间质细胞类型包围肾内多因素的相互作用,在啮齿动物或人的后肾的情况。因此,斑马鱼是最适合AKI期间可视化的自主肾细胞和分子的变化。

这里所描述的显微注射的方法,同时具有陡峭的学习曲线,是研究都发育和疾病状态,包括肾毒性非常有用的。这种技术可以用来对TE圣药物单独使用或组合使用。此外,注射剂可以在宽范围的开发时间点中进行。在斑马鱼幼体进行静脉内显微注射的类似,同样可行的方法已经由COSENTINO 等人 21先前已经描述。在他们的方法之一显著区别,相比,这里描述的方法是,胚胎被注入固定利用保持吸管21。使用保持吸管的是一个可行的替代的注塑模具。研究人员谁寻求实现显微注射作为nephrotoxicant代理交付方式应该意识到这个替代不妨来比较的方法来确定哪些是个人可取,因为学习操纵控股吸管,以免破坏胚胎将涉及实践只是因为它需要实践来成功地操纵和使用简单的注塑模具有凹陷腔体的电磁制动microinjectYOS。

当执行此过程,重要的是制备适当大小的注射针头,和削减对针尖的角度,以优化光滑的入口和出口到胚胎循环。在注射过程中,关键是要监视注射体积以评估样品之间的肾毒素递送的一致性。如果可以的研究者是不确定的量的变化而进行实验来进行用千分尺注射量的定期评估。例如,由于技术的性质,针尖可部分或完全用细胞碎片堵塞。这种并发症可以通过周期性地清除针,以确保所喷射流体的一致性来抵消。此外,像酚红的重要染料可以加入到该混合物中以充当注入的视觉标记和协助监测流体分散49,50。此外,示踪分子的注射可以有助于可视特定细胞群,在注射以下。荧光葡聚糖部分,具体为10 kDa的葡聚糖缀合物的共注射,有许多应用16,17。在这种情况下,荧光强度的评估可以紧跟确认具有最小泄漏成功显微注射的方法进行。强度可使用适当的图像捕捉摄影,然后在随后的时间点复查以测量荧光强度的变化,以便测量肾清除51来测量。另外,在近端小管的葡聚糖的重吸收提供此肾段16,17的功能的代理。

两者合计,有显微注射可以用于调查AKI与斑马鱼,特别是该模型提供了机会,以解决在体内药动学许多方面。因此,一旦掌握,肾​​毒素显微注射入斑马鱼胚胎为研究肾有益的范例。

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Acknowledgments

这项工作由美国国立卫生研究院资助DP2OD008470部分得到了支持。另外,RAM是部分由圣母研究生院的大学提供了资金支持。我们感谢生物科学系,中心斑马鱼研究,中心的员工干细胞与再生医学在Notre Dame大学。我们特别感谢实验室的成员参与有关肾脏生物学及其对这项工作有帮助的反馈讨论。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
 (microinjection tray) 150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Micrometer Ted Pella, Inc. 2280-24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. 547636 (2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).
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McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).More

McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).

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