Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54241
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

Nyreskader afholdt fra nefrotoksiner, som omfatter lægemidler, der spænder fra antibiotika til kemoterapeutika, kan resultere i komplekse sygdomme, hvis patogenese forbliver ufuldstændigt forstået. Denne protokol viser, hvordan zebrafisk kan anvendes til sygdom modellering af disse forhold, som kan anvendes til identifikation af renoprotective foranstaltninger.

Abstract

Nyrerne er modtagelige for skade fra eksponering for kemikalier, de filtrerer fra blodbanen. Dette kan føre til orgel skade i forbindelse med et hurtigt fald i nyrefunktion og udvikling af det kliniske syndrom kendt som akut nyreskade (AKI). Farmakologiske midler anvendt til behandling af medicinske omstændigheder spænder fra bakteriel infektion til kræft, når det administreres individuelt eller i kombination med andre lægemidler, kan initiere AKI. Zebrafisk er en nyttig dyremodel til at undersøge de kemiske virkninger på nyrefunktionen in vivo, da de udgør et embryonisk nyre bestående af nephron funktionelle enheder, som er konserverede med højere hvirveldyr, herunder mennesker. Endvidere kan zebrafisk udnyttes til at udføre genetiske og kemiske skærme, som giver mulighed for at belyse de cellulære og molekylære facetter af AKI og udvikle terapeutiske strategier såsom identifikation af nephroprotective molekyler. Her udviser vi hvordan mikroinjektion ind izebrafisk embryo kan anvendes som et paradigme for nephrotoxin studier.

Introduction

AKI er en brat tab af nyrefunktion, som kan føre til ødelæggende sundhedsmæssige konsekvenser 1. AKI er en betydelig sundhedspleje problem på verdensplan på grund af sin høje forekomst på ca. 20% blandt hospitalsindlagte patienter, med endnu højere 30-50% i kritiske tilfælde pleje og ældre, og dødelighed på 50-70% 1-3. Desværre har forekomsten af ​​AKI været stigende og forventes at eskalere yderligere i det næste årti, dels på grund af mangfoldigheden af ​​faktorer, der kan fremkalde AKI, som omfatter postoperativ stress, iskæmi, og udsættelse for nefrotoksiner såsom antibiotika og kemoterapeutiske lægemidler 4.

AKI indebærer pludselig cellulære skader i nyrerne, almindeligt forekommende i nefroner, som er de væsentlige funktionelle enheder, og er sammensat af en blod-filter og en segmenteret tubulus der dræner urin i centrale indsamling kanaler 1. Når et betydeligt antal nefroner erbeskadiget under AKI, de umiddelbare virkninger omfatter en afbrydelse i affald clearance fra kredsløbet, og reduceret eller ophævet flow væske gennem nefroner grundet obstruktion fra døde og døende celler 1. Over tid, kan rørformede obstruktion føre til degeneration af hele nefroner, der permanent reducerer nyrefunktionen 1. Fysiologiske ændringer i nyrerne efter AKI involverer også komplicerede inflammatoriske begivenheder, der kan føre til kronisk ardannelse 1.

På trods af disse resultater, nefroner har nogen kapacitet til at undergå regeneration efter AKI der genopretter den tubulære epitel 5,6. Mens der har været en stigende molekylær forståelse af nephron regenerering, mekanismerne forblive undvigende i mange henseender og nødvendiggør fortsatte efterforskning 7. I hvilken grad AKI resulterer i permanent nyreskade også fortsat ukendt. Aktuel forskning tyder den regenerative potentiale for nyren erhøjeste følgende mindre alvorlige tilfælde af AKI, mens mere udtalte eller gentagne episoder føre til kronisk nyresygdom (CKD), og kulminerer i terminal nyresygdom (ESRD), der kræver livreddende transplantation eller dialyse 8,9. Derudover individer allerede lider CKD er på et endnu større risiko for at pådrage sig en alvorlig episode af AKI 8,9. Tilsammen er det klart, at fortsat grundforskning og klinisk forskning er afgørende for at forstå, behandle og forebygge AKI.

Forskning med dyremodeller har været medvirkende til at værdsætte progression af lokale og miljømæssige forandringer, der opstår i løbet af AKI 10. At udvide denne forståelse samt udvikle nye behandlinger har zebrafisk dyremodel været ansat i en række forskellige måder 11,12. De nefroner af zebrafisk nyre, i både embryo og voksne, viser en høj grad af bevaring med pattedyr 13-16. Endvidere nephron epitelial skade i zebrafish ligner processen i højere hvirveldyr, hvorved den lokale ødelæggelse af rørformede celler efterfulgt af intratubulær proliferation og reetablering af nephron arkitektur 17-19. I embryonet imidlertid omfattende tubulus skader fra de nefrotoksiner som cisplatin er forbundet med letalitet 20,21. Til sammenligning zebrafisk voksne overlever AKI og udviser væsentlige regenererende kapaciteter i nyren. For eksempel, efter udsættelse for aminoglykosid antibiotikum gentamicin, zebrafisk regenerere tubulus epitelial skader og vokse nye nefronenheder samt 22-24. Mens disse gentamicin-induceret AKI undersøgelser har givet uvurderlige oplysninger, forståelse nyreskade fra forskellige nefrotoksiner fortsat kritisk at værdsætte virkningerne og reaktion på forskellige typer af skader 25.

Zebrafisken embryo, på grund af sin størrelse, gennemsigtighed, og genetisk medgørlighed, har mange fordele for nephrotoxin undersøgelser <sup> 25, hvor der anvendes fremgangsmåden til mikroinjektion 20,21 at administrere molekylet (er) for undersøgelsen. Nefroner er dannet af 24 timer efter befrugtning (HPF) og begynder at filtrere blod ved ca. 48 HPF 26,27. Således er den hurtige dannelse og funktion af det embryoniske nyre letter eksperimentel analyse. Men processen med mikroinjektion har tekniske udfordringer, og der kan være en stejl indlæringskurve at beherske teknikken. I denne video artiklen beskriver vi, hvordan du udfører mikroinjektioner og giver tips til fejlfinding for at øge hastigheden af ​​succesfulde injektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurerne for at arbejde med zebrafisk embryoner er beskrevet i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Notre Dame.

1. Fremstilling af opløsninger

  1. Lav en 50x stamopløsning af E3 embryo medier ved at blande 73,0 g NaCl, 3,15 g KCI, 9,15 g CaCl2, og 9,95 g MgSO4 i 5 liter destilleret vand, og opbevar ved stuetemperatur.
  2. For dyrkning af zebrafisk embryoner, fortyndes 50x stamopløsningen af ​​E3 foster medier lager til en 1x arbejdsopløsning med destilleret vand, hvorefter der tilsættes 200 pi 0,05% methylenblåt til hver en liter 1x E3 til at fungere som et fungicid, og opbevares ved RT.
  3. Foretag en pigmentering blokerende opløsning af E3 embryo medier med 0,003% 1-phenyl-2-thiourinstof (PTU) ved at kombinere 40 ml af 50x E3 lager med 0,06 mg PTU. Derefter bringe volumenet til i alt 2 l med destilleret vand.
  4. Omrør E3 / PTU O / N ved stuetemperatur for at få den PTU pulver til opløsning. Derefter opbevares E3 / PTU vedRT.
    Bemærk: E3 / PTU har en holdbarhed på ca. en uge, og ældre løsninger vil være mindre effektiv til at blokere pigmentering udvikling i zebrafisk larver.
  5. Afgiv et bedøvelsesmiddel opløsning af 0,2% tricaine (MS-222) ved tilsætning af 1 g tricaine til 500 ml destilleret vand og pH indstilles til 7,2 med 1 M Tris, pH 9,5.
  6. Forbered at lave en 2% methylcelluloseopløsning til billeddannelse ved at anbringe en opløsning af 1x E3 (ingen methylenblåt), med 1/10 volumen 0,2% tricaine tilsat ved 4 ° C.
    Bemærk: Den methylcelluloseopløsning er en tyk, klar opløsning, der bruges til forsigtigt at stabilisere levende embryoner til mikroskopi. Efter manipulationer udføres embryonerne kan vaskes i 1x E3 at opløse methylcellulose uden at skade dyret og muliggør mikroskopi på efterfølgende led i samme prøve.
  7. Når afkølet til 4 ° C, omrøres 1x E3 / tricaine løsning kraftigt på en røre plade og gradvist tilsæt passende mængde af methylcellulose pulver samtidig med at røre kraftigt. Gradvist tilsættes pulveret til opløsningen for at forhindre dannelse af uopløselige methylcelluloseskiver aggregater.
  8. Efter alt pulveret blandes i 2% methylcellulose / E3 / tricaine opløsning, omrøre den sammensatte opløsning i 4 ° C koldt rum O / N.
    Bemærk: Den kolde temperatur er bedst for fuldt opløsning af pulveret. Hvis opløsningen ikke er klar efter en nat, omrøres i yderligere arbejdsdag og / eller en anden O / N.
  9. For at fjerne luftbobler fra 2% methylcellulose / E3 / tricaine løsning, portion blandingen i 1,5 ml rør og centrifugering ved høj hastighed (12.000 xg) ved 4 ° C i 30 min eller op til 2 timer.
  10. Placer 2% methylcellulose / E3 / tricaine løsning ved 4 ° C for langtidsopbevaring.
    Bemærk: Før brug, alikvoter bør være præ-opvarmet til stuetemperatur for at arbejde med de zebrafisk prøver.

2. Udarbejdelse af værktøjer

  1. Forbered et foster manipulator værktøj, der anvendes til positioning embryoner til mikroinjektion, ved at fastgøre en gel lastning spids på enden af ​​en 5 "straight dissekere nål, og fastgør med tape eller superlim.
  2. Forbered mikroinjektion nåle ved hjælp af en nål aftrækker, ved først at placere en brand poleret 10 cm borosilikatglas med glødetråd i instrumentet og sikre borosilikatglas ved at stramme håndtagene.
  3. Træk borosilikatglas til mode fin-koniske nåle. Brug følgende indstillinger: varme 540, træk 245, hastighed 200, og tid 125.
  4. Placer nåle inde i en petriskål, suspension dem på en stribe af modellervoks til at beskytte nålen tips, og holde fadet dækket for at forhindre ophobning af støv.
  5. For at afslutte forberede nål til mikroinjektioner, bruge et barberblad eller fine tænger kant til at skære den løftes ende af nålen for at skabe en skarp kantet injektion spids med en diameter på ca. 0,05-0,1 mm.
  6. For at gøre det mikroinjektion bakke, udarbejde en 1,5% agarose / E3 opløsning i en 100 ml Erlenmeyerkolbe og opløses agarosen ved opvarmning af E3 i kog i en mikrobølgeovn tillad derefter til afkøling ved stuetemperatur i ca. 10 min.
  7. Hæld den afkølede agarose / E3 opløsning i en petriskål til at gøre et fundament med en dybde på ca. 0,5 cm. Når dette er størknet hæld et andet lag med en dybde på ca. 0,3 cm, og sæt den præfabrikerede embryo godt skimmel og tillade agarose at størkne ved stuetemperatur.
    Bemærk: Ved indsættelse af formen ind i topagar / E3 lag, anbringelse af formen i agaren i en vinkel for at reducere antallet af luftbobler.
  8. Når hele mikroinjektion bakke har sat, løfte præfabrikerede foster godt forme ud langsomt og forsigtigt med en scoopula, derefter udfylde fadet med E3-opløsning og opbevares ved 4 ° C.

3. Embryo Forberedelse

  1. Opsætning zebrafisk parring tanke ved at placere skillevægge i parring kamre og fyld med systemet vand.
  2. Placer en fisk på hver side af deleren such at hver parring kammer indeholder en kvindelig og en mandlig fisk, og dækker hver parring kammer.
  3. Den næste morgen, fjerne dividers at aktivere gydning.
  4. Kontroller fisk efter ca 30 min, og efter hjemkomsten voksne til akvariet, indsamle deres embryoner ved at føre parring akvarium vand gennem en finmasket trådnet si værktøj.
  5. Vend si over en petriskål og skyl med E3 at indsamle embryoner.
  6. Inkuberes embryoner ved 28,5 ° CO / N.
  7. Når embryoer har nået 24-26 somite fase 26, dekanteres fleste af E3 medier og derefter dechorionate ved tilsætning af 100 pi 50 mg / ml pronase til hver skål af embryoner og inkubering af skålen ved stuetemperatur (23 ° C) i ca. 15 min.
    Bemærk: Det vil tage ca. 24-25 timer fra tidspunktet for befrugtning for at embryonerne at nå 24-26 somite tidspunkt, hvis de indsamles på den beskrevne måde og inkuberet O / N ved 28,5 ° C.
  8. Fyld fadet medE3 og derefter bland forsigtigt for at fjerne de chorions fra embryoner.
  9. Dekanteres E3 / pronase og skyl skål med 25 ml frisk E3. Gentag skylletrin for at fjerne al pronase.
  10. For at blokere udviklingen af ​​pigmentering, dekanteres E3 og erstatte med 25 ml frisk E3 / PTU når embryonerne har nået 24 timer efter befrugtning.
    Bemærk: Til forsøg spænder over flere dage, udskifte E3 / PTU løsning med friske medier en gang dagligt for at holde fadet rent.

4. mikroinjektion af nephrotoxin Solution

  1. På dagen for injektion, forberede den ønskede nephrotoxin løsning sammen med passende kontrol køretøj.
  2. Vortex eller blandes forsigtigt at forsikre lægemiddel (er) er / er i opløsning, kontrol af sider af røret og toppen af ​​vandsøjlen.
    Bemærk: nephrotoxin løsninger kan være parat til at indeholde spormængder af fluorescens-konjugeret dextran til at overvåge mikroinjektion effektivitet og også vurdere renal clearance på subseqgelige tid peger 20,28.
  3. Læg en trimmet mikroinjektion nål med ~ 2-3 pi af nephrotoxin ved at skrue en fin gel lastning spids ind i bagsiden af ​​nålen og suspendere nålen lodret med et stykke tape til at lade opløsningen for at fylde den trimmede nålespids af tyngdekraften.
  4. Når nålespidsen er fuld, fastgøre lastet nål i mikromanipulator.
  5. Test mikroinjektion volumen ved at placere en dråbe af mineralsk olie på en mikrometer objektglas og injicere i olien for at evaluere dråbestørrelsen. Et injektionsvolumen på 500 pl har en diameter på 0,1 mm.
  6. Fjern fadet af embryoner fra inkubatoren, og bedøver ved at tilsætte ca. 5 ml 0,2% tricaine til embryo parabol.
  7. For at sikre fuldstændig bedøvelse, blidt røre embryo med spidsen af ​​embryonet manipulator værktøjet. Manglende bevægelse indikerer tilstrækkelig bedøvelse.
  8. Efter vellykket bedøvelse, overføre embryoer til sprøjtestøbning med en transfare pipette.
  9. Manøvrere hver embryo i en anden brønd af formen placere hovedet i den dybeste område af brønden, således at stammen hviler langs depression og halen stikker op af depression.
  10. Sæt den fyldte nål ind i mikromanipulator og positionere nålespidsen siden et foster.
  11. Sæt forsigtigt nålen ind i halen fartøj ved at bevæge joysticket fremad og trykke fodpedalen at levere mikroinjektion.
    Bemærk: Vellykket injektion kan måles ved at se væsken ind cirkulation. Yderligere, co-injektion af nephrotoxicant med fluorescens-konjugeret dextran giver forskeren at verificere vellykket injektion efter proceduren.
  12. Træk forsigtigt tilbage på joysticket for at fjerne nålen fra embryoet.
  13. Efter injektion, overføre embryoner til et rent fad og skyl at fjerne tricaine og erstatte med frisk E3 / PTU.
  14. Inkubér embryonet til det ønskede tidspunkt at vurderes morfologi, som kan dokumenteres ved fotografering i methylcellulose montering medier, eller proces til eksperimentel analyse som ønsket.
    Bemærk: Inddrivelse af embryoner bør vurderes for at bestemme den procentdel af personer med ødem, som almindeligvis indikerer nyreskade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En mikroinjektion station oprettet indbefatter et stereomikroskop, mikromanipulator og trykregulatoren (figur 1A). Gennemlysning af injektionspladen er at foretrække at se prøver under denne procedure (figur 1B). Forberedelse af kanylen indebærer at trække den relevante borosilikatglas, efterfulgt af at forberede kanten med opskæring og endelig rygbelastende nålen. Optimalt er nålespidsen affaset stedet blunt (figur 1C), et snit, der er lavet af stærkt vinkling kanten af den skærende instrument, såsom de fine pincet, under skæringen procedure (Figur 1D). Denne skrå kant er kritisk og vil i høj grad påvirke evnen til forsigtigt indsætte nålen ind i zebrafisk.

På dagen for injektionen, blev embryoer positioneret ved hjælp robust men bøjelig embryomanipulation værktøjer (figur 1E). Til injektion, blev embryoer manøvreres, således, at torso hvilede langs siden af injektionen bakken skal fungere som løftestang for den efterfølgende injektion trin (figur 1F). Mens injektion, bør man fokusere plan syn på embryonale torso at visualisere det vaskulære destination for nål indsættelse og derefter observere det injicerede materiale ind i omløb (figur 1G).

Gennemsigtigheden af zebrafisk embryo letter mikroinjektion procedure, og kan forbedres yderligere ved PTU kemisk behandling ved 24 HPF at mindske udviklingen af pigmentering i løbet af en typisk eksperimentel tidsforløb (figur 2A). Her blev embryo prøver lov at udvikle gennem 72 HPF fase, derefter blev enten mock injiceret, mikroinjiceres med saltvand køretøj eller mikroinjiceres med 2,5 mg / ml gentamicin (figur 2A).Efterfølgende levende observation blev udført ved en og to dage efter injektion, ved hjælp af gennemlysning belysning med et stereomikroskop (figur 2B). Sammenlignet med mock og saltholdigt injicerede embryoner, viste kun gentamicin-injicerede individer udvikling af ødem (figur 2B), i dette tilfælde perikardiel ødem, hvilket tyder på en ophævelse af normal nyre funktionsniveau, der med tidligere publicerede observationer 11,20,21.

figur 1
Figur 1. Mikroinjektion apparater og redskaber. (A) Injektion station oprettet med stereomikroskop (venstre), mikromanipulator og nåleholder (midten) og trykregulatoren (højre). (B) gennemlysning af injektionen plade. (C) Venstre: Blunt cut nål. Til højre: Skrå cut nål. (D) Foffline-pincet bruges til at skære needle tips. (E) Manipulation værktøjer, der anvendes til at indsætte og placere enheder i sprøjtestøbeformen. (F) Embryoner klædt i mikroinjektion formen. Scale bar = 0,5 mm. (G) Positionering af nålen ved siden af embryo til injektion. Scale bar = 0,15 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Eksperimentel tidslinjen og efter injektion ødem assay. (A) Eksempel nephrotoxin eksperimentel tidslinje i zebrafisk, her anvendt på en gentamicin undersøgelse. Embryoner blev dechorionated og behandlet med PTU opløsning ved 24 timer efter befrugtning (HPF). Hver dag blev PTU opløsningen dekanteret og erstattet med frisk medium som angivet ved Smaller grønne pile. På 72 HPF blev embryoer bedøvet, overført til en indsprøjtning skimmel og derefter behandlet som følger: mock injiceres eller injiceres enten saltvand (køretøj kontrol) eller gentamicin. Efter genoplive embryoner i frisk medium blev embryonerne observeret efter 1 og 2 dage efter injektion (96 og 120 HPF henholdsvis) til analyse og billedoptagelse. (B) Top: ikke-injiceret zebrafisk embryo. I midten: embryo injiceret ved 72 HPF med saltvand. Nederst: embryo injiceret med 2,5 mg / ml gentamicin. Scale bar = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En mangfoldig række af terapeutiske midler er blevet forbundet med AKI 29. Der har været en betydelig forskningsindsats fremskridt i forståelsen af skader fremkaldt af mange individuelle forbindelser, såsom aminoglykosid gentamicin 30 og udbredte kemoterapeutiske cisplatin 31,32. Nogle patologiske forandringer, der er involveret i disse forhold, dog fortsat genstand for igangværende studie. En emergent udfordring er stadig at forstå, hvordan flere lægemidler påvirker patienterne, især dem i højrisikogrupper som dem i kritiske behandlingsområder og ældre 29. Således modeller, der muliggør yderligere cellebaserede undersøgelser om virkningerne af narkotika-induceret AKI tjener en vigtig rolle i at forbedre afsløring af denne tilstand og værdsætte dynamiske lægemiddelinteraktioner.

Arbejde med mammale modeller som mus og rotter har været integreret til at etablere cellulære ændringer i nyren efter AKI, but én begrænsning med disse systemer er, at direkte, real-time observation er begrænset på grund af den arkitektoniske kompleksitet og indre placering af organet. Kort sagt, nyrerne er ikke tilgængelig for direkte observation, hvilket nødvendiggør, at enkeltpersoner ofres for at analysere nyren. Disse begrænsninger kan modvirkes ved hjælp af zebrafisk embryoner, der danner en enkel nyre af to nefroner, der har en konserveret segment struktur med andre hvirveldyr, herunder mennesker 33. Zebrafisk udvikling sker ex utero og med mindre pigmentering, der giver mulighed for direkte observation af renal organogenese og overvågning af reaktioner på eksterne signaler 34. Værktøjer til molekylær analyse, såsom genekspression 35-37, er blevet anvendt med høj opløsning til bestemmelse funktionerne i nephrogenesis 38-40. Eksperimentelle manipulationer til test af små molekyler gennem kemiske genetik er veletablerede i zebrafisk og gælder for kidney 41-43. Ja, i de seneste år, zebrafisk er blevet anvendt til at modellere nefrotoksicitet af midler spænder fra acetominophen til mykotoksiner og aristolochiasyre 44-48. Det er vigtigt at bemærke, at der også er betydelige begrænsninger til AKI modellering i zebrafisk foster, på grund af den meget enkle renal struktur på dette trin i udviklingen. For eksempel er zebrafisk ikke egnet til at løse multifaktorielle interaktioner inden nyrevæv, som er tæt pakket med nefroner der er omgivet af en kompleks stroma, som indeholder flere interstitielle celletyper, som det er tilfældet i gnavere eller mennesker metanephros. Således er zebrafisk bedst egnet til at visualisere autonome cellulære og molekylære ændringer i nephron under AKI.

Fremgangsmåden til mikroinjektion beskrevet her, og samtidig have en stejl indlæringskurve, er meget nyttigt til at studere både udviklingsmæssige og sygdomstilstande, herunder nefrotoksiner. Denne teknik kan anvendes til test narkotika enkeltvis eller i kombination. Derudover kan injektioner udføres under en lang række udvikling tidspunkter. En lignende, lige så levedygtige fremgangsmåde til udførelse intravenøse mikroinjektioner i zebrafisk larver er tidligere blevet beskrevet af Cosentino, et al. 21. En væsentlig forskel i deres metode, sammenlignet med fremgangsmåderne beskrevet her, er, at embryonet skal injiceres immobiliseres under anvendelse af en bedrift pipette 21. Brugen af ​​en bedrift pipette er et levedygtigt alternativ til injektion skimmel. Forskere, der søger at gennemføre mikroinjektion som leveringsmetode for nephrotoxicant stoffer bør være opmærksomme på dette alternativ og måtte ønske at sammenligne de metoder til at identificere, hvilke er personligt foretrække, som at lære at manipulere den bedrift pipette for ikke at beskadige fosteret vil involvere praksis ligesom det kræver praksis at kunne manøvrere og microinject hjælp af en simpel sprøjtestøbeform med en fordybning hulrum for brodeYOS.

Når du udfører denne procedure, er det afgørende at forberede passende størrelse injektionsnåle, og at skære vinklen på nålespidsen at optimere glat ind- og udstigning i embryonale cirkulation. Under injektionsproceduren, er det vigtigt at overvåge injektionsvolumen at vurdere konsekvensen af ​​nephrotoxin levering mellem prøver. kan udføres periodisk vurdering af injektion volumen med et mikrometer, hvis forskeren er i tvivl om ændringer i volumen, mens de udfører et eksperiment. For eksempel på grund af karakteren af ​​den teknik, kanylespidsen kan helt eller delvist tilstoppe med celleaffald. Denne komplikation kan modvirkes ved at rydde nålen jævne mellemrum for at sikre sammenhæng i den skubbet væske. Derudover kan en vitalfarvestof som phenolrødt tilsættes til blandingen for at virke som en visuel markør af injektionen og hjælp til overvågning fluid spredning 49,50. Endvidere kan injektioner af tracer molekyler hjælpe medvisualisere specifikke cellepopulationer, efter injektionen. For co-injektion af fluorescerende dextran dele, specielt 10 kDa dextrankonjugater, har en række applikationer 16,17. I dette tilfælde kan der gennemføres en vurdering af fluorescensintensitet umiddelbart efter procedure til at bekræfte vellykket mikroinjektion med minimal lækage. Intensiteten kan måles ved anvendelse passende billedoptagelse fotografering og derefter igen undersøgt ved efterfølgende tidspunkter for at måle ændringen i fluorescensintensitet således at måle renal clearance 51. Endvidere reabsorption af dextran i den proximale tubulus giver en proxy for funktionaliteten af dette nephron segment 16,17.

Tilsammen er der mange måder at mikroinjektion kan udnyttes til at undersøge AKI med zebrafisk, især fordi denne model giver mulighed for at gribe farmakokinetik in vivo. Således når beherskes, mikroinjektion af nefrotoksinerind i zebrafisk embryo giver et nyttigt paradigme for renale studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet delvist af NIH tilskud DP2OD008470. Derudover RAM blev delvist understøttet af midler fra University of Notre Dame Graduate School. Vi takker stabe af Biologisk Institut, Center for zebrafisk Research, og Center for stamceller og regenerativ medicin ved University of Notre Dame. Vi takker især medlemmerne af lab for at engagere diskussioner om nyre biologi og deres nyttige feedback på dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
 (microinjection tray) 150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Micrometer Ted Pella, Inc. 2280-24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).

Tags

Medicin zebrafisk nyre nephrotoxin renal clearance akut nyreskade mikroinjektion gentamicin
Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKee, R. A., Wingert, R. A.… More

McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter