Summary
lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.
Abstract
I reni sono suscettibili di nuocere dall'esposizione a sostanze chimiche che filtrano dal flusso sanguigno. Questo può portare a lesioni d'organo associata ad un rapido declino della funzione renale e lo sviluppo della sindrome clinica nota come danno renale acuto (AKI). agenti farmacologici usati per trattare le circostanze mediche che vanno da un'infezione batterica al cancro, quando somministrato singolarmente o in combinazione con altri farmaci, possono avviare AKI. Zebrafish sono un modello animale utile per studiare gli effetti chimici sulla funzione renale in vivo, in quanto costituiscono un rene embrionale composto di unità funzionali nefrone che sono conservati con vertebrati superiori, compreso l'uomo. Inoltre, zebrafish può essere utilizzata per eseguire schermi genetici e chimici, che offrono opportunità per chiarire gli aspetti cellulari e molecolari di AKI e sviluppare strategie terapeutiche, come l'identificazione di molecole nefroprotettivo. Qui, dimostriamo come microiniezione nelzebrafish può essere utilizzato come un paradigma per gli studi nefrotossina.
Introduction
Aki è una perdita improvvisa della funzione renale che può portare a conseguenze per la salute devastanti 1. AKI è un problema sanitario rilevante in tutto il mondo a causa della sua elevata incidenza di circa il 20% tra i pazienti ospedalizzati, con tassi ancora più elevati di 30-50% nei casi di terapia intensiva e gli anziani, e il tasso di mortalità del 50-70% 1-3. Purtroppo, la prevalenza di AKI è in aumento e si prevede a crescere ulteriormente nel prossimo decennio, in parte a causa della diversità dei fattori che possono indurre AKI, che includono stress post-operatorio, ischemia, e l'esposizione a nefrotossine come antibiotici e farmaci chemioterapici 4.
AKI comporta danni cellulari improvvisa all'interno del rene, che si verificano comunemente in nefroni, che sono le unità funzionali essenziali, e sono composti da un filtro del sangue e un tubulo segmentato che drena l'urina in collettori centrali 1. Quando un numero significativo di nefroni sonodanneggiato durante AKI, gli effetti immediati di una interruzione della clearance rifiuti dalla circolazione, e il flusso del fluido ridotta o abolita attraverso nefroni a causa di ostruzione da cellule morte e morenti 1. Nel corso del tempo, l'ostruzione tubolare può portare alla degenerazione di intere nefroni, che riduce in modo permanente la funzione renale 1. Alterazioni fisiologiche nel rene seguenti AKI coinvolgono anche eventi infiammatori complessi che possono portare a cicatrici cronica 1.
Nonostante questi risultati, nefroni hanno una certa capacità di subire rigenerazione dopo AKI che ricostituisce il 5,6 tubolare dell'epitelio. Mentre vi è stata una comprensione molecolare crescente di rigenerazione nefrone, i meccanismi rimangono sfuggente in molti aspetti e impongono prosecuzione degli accertamenti 7. La misura in cui AKI si traduce in un danno renale permanente rimane sconosciuta. La ricerca attuale suggerisce il potenziale rigenerativo per il rene è lapiù alto dopo meno gravi casi di AKI, mentre gli episodi più pronunciati o ripetute portano alla malattia renale cronica (CKD) e culminano nella malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che richiede il trapianto salva-vita o la dialisi 8,9. Inoltre, gli individui già affetti da insufficienza renale cronica sono ad un ancora più elevato rischio di contrarre una grave episodio di AKI 8,9. Nel loro insieme, è chiaro che ha continuato la ricerca di base e clinica è fondamentale per comprendere, trattare e prevenire AKI.
La ricerca con modelli animali è stato determinante per apprezzare la progressione delle alterazioni locali e ambientali che si verificano durante AKI 10. Per espandere questa comprensione e sviluppare nuove terapie, il modello animale zebrafish è stato impiegato in una varietà di modi 11,12. I nefroni del rene zebrafish, sia l'embrione e adulti, mostrano un alto grado di conservazione con i mammiferi 13-16. Inoltre, lesioni epiteliali nefrone in zebrafish assomiglia al processo di vertebrati superiori, per cui la distruzione locale del cellule tubulari è seguita da proliferazione intratubulare e ristabilimento di architettura nefrone 17-19. Nell'embrione, però, ingenti danni tubulo dalle nefrotossine come cisplatino è associata a letalità 20,21. In confronto, gli adulti zebrafish sopravvivono AKI e mostrano capacità rigenerative sostanziali nel rene. Ad esempio, dopo l'esposizione al gentamicina antibiotici aminoglicosidi, zebrafish rigenerare tubulo danno epiteliale e far crescere nuove unità nefrone così 22-24. Mentre questi studi AKI gentamicina indotta hanno fornito preziose informazioni, la comprensione danno renale da diversi nefrotossine rimane fondamentale per apprezzare gli effetti e la risposta a diversi tipi di danni 25.
L'embrione zebrafish, a causa della sua dimensione, trasparenza, e trattabilità genetica, ha molti vantaggi per gli studi nefrotossina <sup> 25, in cui il metodo di microiniezione 20,21 viene utilizzato per gestire la molecola (s) per indagini. Nefroni sono formate da 24 ore dopo la fecondazione (HPF) e cominciano a filtrare il sangue di circa il 48 HPF 26,27. Così, la rapida formazione e la funzione del rene embrionale facilita analisi sperimentale. Tuttavia, il processo di microiniezione ha sfide tecniche e non ci può essere una ripida curva di apprendimento per padroneggiare la tecnica. In questo articolo il video, si descrive come eseguire microiniezioni e fornire suggerimenti sulla risoluzione dei problemi al fine di migliorare il tasso di iniezioni di successo.
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Protocol
Le procedure per lavorare con embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Università di Notre Dame.
1. preparazione di soluzioni
- Fare una soluzione 50x magazzino di E3 mezzi dell'embrione mescolando 73,0 g di NaCl, 3,15 g KCl, 9.15 g CaCl 2, e 9,95 g MgSO 4 a 5 L di acqua distillata, e conservare a temperatura ambiente.
- Per la coltura di embrioni di zebrafish, diluire la soluzione 50x magazzino di E3 mezzi embrione stock ad una soluzione di lavoro 1x con acqua distillata, quindi aggiungere 200 ml di 0,05% blu di metilene per ogni 1 L di 1x E3 di agire come fungicida, e conservare a RT.
- Fare una soluzione pigmentazione blocco di E3 mezzi embrione con 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) mediante la combinazione di 40 ml di 50x E3 azione con 0,06 mg PTU. Quindi portare il volume a un totale di 2 L con acqua distillata.
- Mescolare la O E3 / PTU / N a temperatura ambiente per ottenere la polvere PTU in soluzione. Poi memorizzare l'E3 / PTU aRT.
Nota: L'E3 / PTU ha una durata di circa una settimana, e le soluzioni più anziani saranno meno efficace nel bloccare lo sviluppo pigmentazione nelle larve zebrafish. - Effettuare una soluzione anestetica del 0,2% Tricaine (MS-222) aggiungendo 1 g di Tricaine a 500 ml di acqua distillata e regolare il pH a 7,2 con 1 M Tris, pH 9,5.
- Preparare per ottenere una soluzione di metilcellulosa 2% per l'imaging ponendo una soluzione di 1x E3 (senza blu di metilene), con 1/10 volume di 0,2% Tricaine aggiunto a 4 ° C.
Nota: La soluzione metilcellulosa è una soluzione di spessore, chiaro che viene utilizzato per stabilizzare delicatamente embrioni vivi per la microscopia. Dopo l'esecuzione manipolazioni gli embrioni possono essere lavati in 1x E3 di sciogliere la metilcellulosa senza ferire l'animale e consentendo la microscopia in fasi successive nello stesso campione. - Quando raffreddato a 4 ° C, mescolare la soluzione 1x E3 / Tricaine energicamente su un piatto mescolare e aggiungere gradualmente la giusta quantità di metilepolvere di cellulosa, pur continuando a mescolare energicamente. Aggiungere gradualmente la polvere alla soluzione per evitare la formazione di aggregati insolubili metilcellulosa.
- Dopo tutta la polvere viene miscelato nella soluzione di metilcellulosa / E3 / tricaine 2%, mescolare la soluzione composita in C stanza fredda 4 ° O / N.
Nota: La temperatura fredda è migliore per sciogliere completamente la polvere. Se la soluzione non è chiara dopo una notte, agitare per una giornata lavorativa supplementare e / o un secondo O / N. - Per rimuovere le bolle d'aria dalla soluzione / tricaine E3 2% metilcellulosa /, un'aliquota il composto in provette da 1,5 ml e girano ad alta velocità (12.000 xg) a 4 ° C per 30 minuti o fino a 2 ore.
- Mettere la soluzione / E3 / Tricaine metilcellulosa 2% a 4 ° C per una conservazione a lungo termine.
Nota: Prima di utilizzo, le aliquote devono essere pre-riscaldato a temperatura ambiente per lavorare con i campioni di zebrafish.
2. Preparazione di strumenti
- Preparare uno strumento embrione manipolatore, utilizzato per Podi posizionamento a embrioni per la microiniezione, allegando una punta di caricamento del gel sulla punta di un ago da dissezione dritto 5 ", e fissare con nastro adesivo o colla.
- Preparare aghi microiniezione con un estrattore ago, dalla prima immissione un fuoco lucido 10 centimetri in vetro borosilicato con filamento nello strumento e fissare il vetro borosilicato stringendo le maniglie.
- Tirare il vetro borosilicato alla moda aghi fine-conici. Utilizzare le seguenti impostazioni: riscaldare 540, tirare 245, velocità 200, e il tempo 125.
- Luogo aghi all'interno di una capsula di Petri, li sospensione su una striscia di plastilina per proteggere le punte degli aghi, e mantenere il piatto coperto per evitare l'accumulo di polvere.
- Per finire di preparare l'ago per microiniezioni, utilizzare un bordo lama di rasoio o pinza sottile per tagliare l'estremità tirato dell'ago per creare una punta tagliente iniezione angolare con un diametro di circa 0,05-0,1 mm.
- Per rendere il vassoio microiniezione, preparare un 1,5% di agarosio soluzione / E3 in un 100 ml beuta e sciogliere l'agarosio riscaldando il E3 a ebollizione in una microonda indi si lascia raffreddare a temperatura ambiente per circa 10 min.
- Versare la soluzione di agarosio / E3 raffreddato in una capsula Petri di fare una fondazione con una profondità di circa 0,5 CM. Quando questo è solidificato versare un secondo strato con una profondità di circa 0,3 cm ed inserire lo stampo embrione ben prefabbricati e consentire l'agarosio solidificare a temperatura ambiente.
Nota: Quando si inserisce lo stampo nello strato / E3 superiore agar, ponendo lo stampo in agar con un angolo di diminuire il numero di bolle d'aria. - Quando l'intero vassoio microiniezione ha fissato, sollevare l'embrione prefabbricata ben modellare lentamente e accuratamente con un scoopula, quindi riempire il piatto con la soluzione E3 e conservare a 4 ° C.
3. Preparazione Embrione
- Impostare serbatoi accoppiamento zebrafish inserendo divisori nelle camere di accoppiamento e riempire con acqua del sistema.
- Posizionare un pesce su ciascun lato del divisore such che ciascuna camera di accoppiamento contiene una femmina e uno di pesce di sesso maschile, e coprire ciascuna camera di accoppiamento.
- La mattina seguente, togliere i divisori per consentire la deposizione delle uova.
- Controllare il pesce dopo circa 30 minuti, e dopo il ritorno gli adulti per l'acquario, raccogliere i loro embrioni facendo passare l'acqua della vasca di accoppiamento attraverso una multa strumento colino rete metallica.
- Invertire il filtro su una capsula di Petri e risciacquare con E3 per raccogliere gli embrioni.
- Incubare gli embrioni a 28,5 ° CO / N.
- Quando embrioni hanno raggiunto la fase 24-26 somite 26, decantare maggior parte dei media E3 e poi dechorionate aggiungendo 100 ml di 50 mg / ml pronase per ogni piatto di embrioni e incubando il piatto a RT (23 ° C) per circa 15 min.
Nota: Ci vorranno circa 24-25 ore dal momento della fecondazione per gli embrioni di raggiungere la fase 24-26 somite se sono raccolti nel modo descritto e incubata O / N a 28,5 ° C. - Riempire il piatto conE3 e poi miscelare delicatamente per rimuovere i chorions dagli embrioni.
- Decantare il E3 / pronasi e sciacquare il piatto con 25 ml di E3 fresco. passo risciacquo Ripetere per rimuovere tutti Pronasi.
- Per bloccare lo sviluppo di pigmentazione, decantare il E3 e sostituire con 25 ml di fresco E3 / PTU quando gli embrioni hanno raggiunto 24 ore dopo la fecondazione.
Nota: Per gli esperimenti che abbracciano diversi giorni, sostituire la soluzione E3 / PTU con mezzi freschi una volta al giorno per mantenere il piatto pulito.
4. la microiniezione di soluzione nefrotossina
- Il giorno dell'iniezione, preparare la soluzione nefrotossina desiderata con il controllo del veicolo appropriato.
- Vortex o mescolare gentilmente per garantire il farmaco (s) è / sono in soluzione, controllando i lati del tubo e superiore della colonna d'acqua.
Nota: Le soluzioni nefrotossina possono essere preparati per contenere tracce di fluorescente destrano coniugato a monitorare l'efficienza microiniezione e anche valutare la clearance renale a Collpunti di tempo confluente 20,28. - Caricare un ago microiniezione rifinito con ~ 2-3 ml di nefrotossina infilando una punta fine caricamento del gel nella parte posteriore dell'ago e di sospendere l'ago verticalmente con un pezzo di nastro per consentire la soluzione per riempire la punta dell'ago rifilato dalla forza di gravità.
- Una volta che la punta dell'ago è pieno, garantire l'ago caricato nel micromanipolatore.
- Testare il volume microiniezione mettendo una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e iniettare nell'olio per valutare la dimensione delle gocce. Un volume di iniezione di 500 pl ha un diametro di 0,1 mm.
- Rimuovere il piatto di embrioni dal termostato, e anestetizzare con l'aggiunta di circa 5 ml di 0,2% Tricaine al piatto dell'embrione.
- Per garantire la completa anestesia, toccare delicatamente embrione con la punta dello strumento dell'embrione manipolatore. La mancanza di movimento indica anestesia sufficiente.
- Dopo anestesia successo, il trasferimento di embrioni allo stampo di iniezione con un trasfER pipetta.
- Manovri ogni embrione in una diversa e dello stampo mettendo la testa nella zona più profonda del pozzo in modo che il tronco appoggia lungo la depressione e la coda sporge dalla depressione.
- Inserire l'ago riempito in micromanipolatore e posizionare la punta dell'ago accanto ad un embrione.
- inserire delicatamente l'ago nel vaso coda spostando il joystick in avanti e premere il pedale del piede per fornire la microiniezione.
Nota: iniezione di successo può essere desunta dal guardando il liquido entrare circolazione. Inoltre, co-iniezione della nephrotoxicant con fluorescente destrano coniugato consente al ricercatore di verificare iniezione di successo successivamente alla procedura. - Delicatamente tirare indietro il joystick per rimuovere l'ago dall'embrione.
- Dopo l'iniezione, trasferire gli embrioni per un piatto pulito e risciacquare per rimuovere il Tricaine e sostituirlo con fresco E3 / PTU.
- Incubare l'embrione fino al punto desiderato tempo di asinis morfologia, che può essere documentata dalla fotografia in metilcellulosa mezzo di montaggio, o di un processo per l'analisi sperimentale, se lo desideri.
Nota: Il recupero di embrioni deve essere valutato per determinare la percentuale di individui con edema, che indica comunemente danno renale.
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Representative Results
Una stazione di microiniezione istituito comprende uno stereomicroscopio, micromanipolatore e regolatore di pressione (Figura 1A). Transilluminazione della piastra iniezione è preferibile visualizzare campioni durante questa procedura (Figura 1B). Preparazione dell'ago iniezione coinvolge tirando il vetro borosilicato appropriata, seguita preparando il bordo con taglio e back-caricare l'ago fine. In modo ottimale, la punta dell'ago è smussato anziché smorzare (Figura 1C), un taglio che è fatta da forte pesca il bordo dello strumento di taglio, come ad esempio i pinza sottile, durante la procedura di taglio (Figura 1D). Questo bordo smussato è fondamentale e influisce notevolmente la capacità di inserire delicatamente l'ago nel pesce zebra.
Il giorno di iniezione, gli embrioni sono stati posizionati con embrione robusto ma flessibilestrumenti di manipolazione (Figura 1E). Per l'iniezione, gli embrioni sono stati manovrati, tale che il torso riposato lungo il lato del vassoio iniezione di fornire leva per la successiva fase di iniezione (Figura 1F). Mentre l'iniezione, si dovrebbe concentrarsi piano di vista sul torso embrionali per visualizzare la destinazione vascolare per l'inserimento dell'ago e quindi osservare il materiale iniettato entrare nella circolazione (Figura 1G).
La trasparenza dell'embrione zebrafish facilita la procedura microiniezione, e può essere ulteriormente migliorata mediante trattamento chimico PTU a 24 HPF per ridurre lo sviluppo di pigmentazione durante un tipico andamento temporale sperimentale (Figura 2A). Qui, i campioni di embrioni sono stati autorizzati a sviluppare attraverso la fase 72 HPF, poi erano o finto iniettato, microiniezione con veicolo salina, o microiniezione con 2,5 mg / ml gentamicina (Figura 2A).La successiva osservazione dal vivo è stato condotto in uno e due giorni dopo l'iniezione, con illuminazione transilluminazione con uno stereomicroscopio (Figura 2B). Rispetto agli embrioni iniettati false o salini, solo gli individui gentamicina-iniettato mostrato lo sviluppo di edema (Figura 2B), in questo caso edema pericardico, suggerendo un'abrogazione di funzionalità renale normale coerente con osservazioni precedentemente pubblicati 11,20,21.
Figura 1. apparecchi e strumenti di microiniezione. (A) stazione di iniezione impostato con stereomicroscopio (a sinistra), micromanipolatore e porta aghi (al centro) e regolatore di pressione (a destra). (B) transilluminazione della piastra di iniezione. (C) A sinistra: l'ago taglio smussato. A destra: smussato taglio ago. (D) Fforcipe ine utilizzati per tagliare punte degli aghi. (E) strumenti di manipolazione utilizzati per inserire e posizionare i campioni nello stampo ad iniezione. (F) Gli embrioni vestita di stampo microiniezione. Barra di scala = 0,5 mm. (G) Posizionamento dell'ago accanto all'embrione iniettabile. Barra di scala = 0,15 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. sperimentale timeline e l'edema iniezione dopo test. (A) Esempio nefrotossina linea temporale sperimentale in zebrafish, qui applicata ad uno studio di gentamicina. Gli embrioni sono stati dechorionated e trattati con una soluzione di PTU a 24 ore dopo la fecondazione (HPF). Ogni giorno, la soluzione PTU è stata decantata e sostituito con mezzi freschi come indicato dalla smaller frecce verdi. Al 72 HPF, gli embrioni sono stati anestetizzati, trasferito in uno stampo ad iniezione e poi trattato come segue: finto iniettato o iniettato soluzione salina (controllo del veicolo) o gentamicina. Dopo ravvivare gli embrioni in mezzi freschi, gli embrioni sono stati osservati a 1 e 2 giorni dopo l'iniezione (96 e 120 HPF, rispettivamente) per l'analisi e l'acquisizione delle immagini. (B) In alto: uninjected zebrafish. Medio: embrione iniettato a 72 HPF con soluzione salina. In basso: embrione iniettato con 2,5 mg / ml gentamicina. Barra di scala = 0,5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un svariato numero di agenti terapeutici sono stati associati con AKI 29. Ci sono stati notevoli progressi della ricerca nella comprensione del danno indotto da molti composti individuali, come la gentamicina aminoglicosidi 30 e il cisplatino chemioterapico ampiamente usato 31,32. Alcuni cambiamenti patologici coinvolti in queste condizioni, tuttavia, rimangono oggetto di studio in corso. Una sfida emergente rimane la comprensione di come più farmaci influenzano negativamente i pazienti, soprattutto quelli in popolazioni ad alto rischio come quelli in ambito di terapia intensiva e gli anziani 29. Così, i modelli che consentono ulteriori studi basati cellulari sugli effetti del farmaco-indotta AKI servono un ruolo importante nel migliorare la rilevazione di questa condizione e apprezzare interazioni farmacologiche dinamiche.
Il lavoro con i modelli di mammiferi come il topo e nel ratto sono state parte integrante di stabilire cambiamenti cellulari nel rene seguenti AKI, but uno limitativo con questi sistemi è che l'osservazione in tempo reale diretta è limitata a causa della complessità architetturale e la posizione interna dell'organo. In poche parole, il rene non è disponibile per l'osservazione diretta, che richiede che gli individui siano sacrificati per analizzare il rene. Queste limitazioni possono essere contrastati utilizzando embrioni di zebrafish, che formano un semplice rene di due nefroni che hanno una struttura dei segmenti conservata con altri vertebrati, inclusi gli esseri umani 33. Sviluppo Zebrafish verifica ex utero e con pigmentazione minore, permettendo l'osservazione diretta di organogenesi e il monitoraggio delle risposte renale a stimoli esterni 34. Strumenti per l'analisi molecolare, come l'espressione genica 35-37, sono stati utilizzati con alta risoluzione per determinare le caratteristiche di nefrogenesi 38-40. manipolazioni sperimentali per le prove di piccole molecole attraverso la genetica chimiche sono ben stabiliti in zebrafish e applicabili al kidney 41-43. Infatti, negli ultimi anni, zebrafish sono stati applicati per modellare nefrotossicità di agenti che vanno da acetominophen alle micotossine e acido aristolochico 44-48. È importante notare che ci sono anche importanti limitazioni alle AKI modellazione nell'embrione zebrafish, a causa della semplicità della struttura renale in questa fase di sviluppo. Ad esempio, zebrafish non sono adatti ad affrontare le interazioni multifattoriali all'interno del tessuto renale che è densamente ricco di nefroni che sono circondate da uno stroma complessa che contiene più tipi di cellule interstiziali, come è il caso nella roditori o metanefro umani. Così, zebrafish sono più adatti per la visualizzazione di modifiche autonome cellulari e molecolari nel nefrone durante AKI.
Il metodo della microiniezione qui descritto, pur avendo una ripida curva di apprendimento, è molto utile per studiare entrambi gli stati di sviluppo e di malattia tra nefrotossine. Questa tecnica può essere utilizzata per TEst farmaci singolarmente o in combinazione. Inoltre, iniezioni possono essere eseguite durante una vasta gamma di punti di tempo di sviluppo. Un simile metodo altrettanto valida per eseguire microiniezioni endovenosa nelle larve zebrafish è stato precedentemente descritto da Cosentino, et al. 21. Una distinzione significativa nella loro metodologia, rispetto ai metodi qui descritti, è che l'embrione da iniettare viene immobilizzato utilizzando una pipetta tenuta 21. L'uso di una pipetta holding è una valida alternativa allo stampo di iniezione. I ricercatori che cercano di implementare microiniezione come metodo di consegna per gli agenti nephrotoxicant dovrebbe essere a conoscenza di questa alternativa e può desiderare di confrontare i metodi per identificare quale è personalmente preferibile, come imparare a manipolare la pipetta partecipazione in modo da non danneggiare l'embrione coinvolgerà pratica come richiede pratica di manovrare con successo e microinject utilizzando uno stampo semplice iniezione di una cavità depressione per la embryo.
Quando si esegue questa procedura, è fondamentale per preparare aghi da iniezione di dimensioni appropriate, e per tagliare l'angolo sulla punta dell'ago per ottimizzare l'ingresso regolare e l'uscita nella circolazione embrionale. Durante la procedura di iniezione, è fondamentale per controllare il volume di iniezione di valutare la coerenza della consegna nefrotossina tra i campioni. valutazione periodica del volume di iniezione con un micrometro può essere eseguita se il ricercatore è incerta sulle variazioni di volume durante l'esecuzione di un esperimento. Ad esempio, a causa della natura della tecnica, la punta dell'ago può parzialmente o interamente intasare con detriti cellulari. Questa complicanza può essere contrastato deselezionando l'ago periodicamente per garantire la coerenza del fluido espulso. Inoltre, un colorante vitale come rosso fenolo può essere aggiunto alla miscela di agire come marcatore visivo dell'iniezione e assistere nel monitoraggio dispersione fluida 49,50. Inoltre, le iniezioni di molecole traccianti possono aiutare avisualizzazione specifiche popolazioni cellulari, dopo l'iniezione. Per la co-iniezione di frazioni destrano fluorescenti, in particolare 10 kDa destrano coniugato, ha un numero di applicazioni 16,17. In questo caso, la valutazione di intensità della fluorescenza può essere eseguita immediatamente dopo la procedura per confermare microiniezione successo con perdite minime. L'intensità può essere misurata utilizzando appropriate photography cattura di immagini e quindi riesaminato in successivi intervalli di tempo per misurare la variazione di intensità fluorescente in modo da misurare clearance renale 51. Inoltre, il riassorbimento del destrano nel tubulo prossimale fornisce un proxy per la funzionalità di questo segmento nefrone 16,17.
Nel loro insieme, ci sono molti modi in cui microiniezione può essere utilizzato per indagare AKI con il pesce zebra, in particolare per quanto questo modello offre l'opportunità di affrontare la farmacocinetica in vivo. Così, una volta imparato, la microiniezione di nefrotossinenell'embrione zebrafish fornisce un paradigma utile per gli studi renali.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione DP2OD008470 NIH. Inoltre, la RAM è stato sostenuto in parte da fondi messi a disposizione dalla University of Notre Dame Graduate School. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche, il Centro per la ricerca Zebrafish, e il Centro per le cellule staminali e la medicina rigenerativa presso l'Università di Notre Dame. Ringraziamo in modo particolare i membri del laboratorio per impegnarsi discussioni circa la biologia di rene e il loro utile feedback su questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning: | |||
| 60 mm x 15 mm | VWR | 25373-085 | |
| 100 mm x 15 mm | VWR | 25373-100 | |
| (microinjection tray) 150 mm x 15 mm | VWR | 25373-187 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Micrometer | Ted Pella, Inc. | 2280-24 |
References
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
- Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
- Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
- Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
- Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
- Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
- Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
- Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
- Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
- Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
- McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
- Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
- Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
- Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
- Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
- Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
- Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
- McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
- Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
- Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
- Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
- Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
- Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).
