Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54241
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

Nyreskader pådratt fra nephrotoxins, som inkluderer legemidler som spenner fra antibiotika til kjemoterapeutika, kan resultere i komplekse lidelser som patogenesen er fortsatt ufullstendig forstått. Denne protokollen viser hvordan sebrafisk kan anvendes for sykdom modellering av disse forhold, som kan brukes til identifisering av renoprotective tiltak.

Abstract

Nyrene er utsatt for skade fra eksponering for kjemikalier de filtrerer fra blodet. Dette kan føre til organskade i forbindelse med en rask nedgang i nyrefunksjonen og utvikling av klinisk syndrom som kalles akutt nyreskade (AKI). Farmakologiske midler brukes til å behandle medisinske forhold som spenner fra bakteriell smitte til kreft, når det gis enkeltvis eller i kombinasjon med andre rusmidler, kan initiere AKI. Sebrafisk er en nyttig dyremodell for å studere de kjemiske virkninger på nyrefunksjonen in vivo, som de danner en embryonisk nyre består av nevronet funksjonelle enheter som er konservert med høyere virveldyr, inkludert mennesker. Videre kan sebrafisk anvendes for å utføre genetiske og kjemiske skjermer, som gir muligheter for å belyse de cellulære og molekylære aspekter av AKI og utvikle terapeutiske strategier som identifikasjon av nephroprotective molekyler. Her viser vi hvordan mikroinjeksjon inn isebrafisk embryo kan benyttes som et paradigme for nyreskade studier.

Introduction

AKI er en brå tap av nyrefunksjon som kan føre til ødeleggende helsemessige konsekvenser 1. AKI er en betydelig helsemessig problem over hele verden på grunn av sin høye forekomsten av ca 20% blant innlagte pasienter, med enda høyere priser på 30-50% i kritiske saker og eldre, og dødeligheten på 50-70% 1-3. Dessverre har utbredelsen av AKI vært økende og er anslått til å eskalere videre over det neste tiåret, delvis på grunn av mangfoldet av faktorer som kan indusere AKI, som inkluderer postoperativ stress, iskemi, og eksponering for nephrotoxins som antibiotika og cellegifter 4.

AKI innebærer plutselige cellular skade i nyrene, vanlig forekommende i nephrons, som er de essensielle funksjonelle enheter, og er omfattet av en blodfilter og en segmentert tubule som drenerer urin i sentrale innsamlingskanaler 1. Når et betydelig antall nephrons finnesskadet under AKI, de umiddelbare effektene inkluderer et avbrudd i avfall klaring fra sirkulasjonen, og redusert eller avskaffet fluidstrømning gjennom nephrons grunnet obstruksjon fra døde og døende celler 1. Over tid kan rørformet obstruksjon føre til degenerasjon av hele nephrons, som permanent reduserer nyrefunksjonen en. Fysiologiske endringer i nyrene følgende AKI også involverer komplekse provoserende hendelser som kan føre til kronisk arrdannelse en.

Til tross for disse resultatene, nephrons har noen kapasitet til å gjennomgå regenerering etter AKI som rekonstruerer rørformet epitel 5,6. Mens det har vært en økende molekyl forståelse av nevronet gjenfødelse, mekanismene forblir unnvikende i mange forhold og behov for fortsatt etterforskning 7. I hvilken grad AKI resulterer i permanent nyreskade er også ukjent. Aktuell forskning antyder den regenerative potensial for nyrene erhøyeste følgende mindre alvorlige tilfeller av AKI, mens mer uttalt eller gjentatte episoder føre til kronisk nyresykdom (CKD) og kulminerer i terminal nyresykdom (ESRD) som krever livreddende transplantasjon eller dialyse 8,9. I tillegg personer som allerede lider av CKD er på et enda høyere risiko for å pådra en alvorlig episode av AKI 8,9. Til sammen er det klart at fortsatt grunnforskning og klinisk forskning er avgjørende for å forstå, behandle og forebygge AKI.

Forskning med dyremodeller har vært medvirkende i å verdsette utviklingen av lokale og miljømessige endringer som oppstår under AKI 10. For å utvide denne forståelsen samt utvikle nye behandlingsformer, har sebrafisk dyremodell vært ansatt i en rekke måter 11,12. Nephrons av sebrafisk nyre, i både embryo og voksne, viser en høy grad av bevaring med pattedyr 13-16. Videre nephron epithelial skade i zebrafish ligner prosessen i høyere virveldyr, hvorved lokal ødeleggelse av rørformede celler fulgt av intratubular proliferasjon og reetablering av nevronet arkitektur 17-19. I embryoet, men omfattende tubuli skader fra nephrotoxins som cisplatin er forbundet med letalitet 20,21. Til sammenligning sebrafisk voksne overleve AKI og stille ut materielle regenerative evner i nyrene. For eksempel, etter eksponering for aminoglykosidantibiotika gentamicin, sebrafisk regenerere tubule epithelial skader og vokse nye nephron enheter samt 22-24. Selv om disse gentamicin-indusert AKI studier har gitt uvurderlig informasjon, forstå nyreskade fra ulike nephrotoxins fortsatt kritisk til å verdsette effekter og respons på ulike typer skader 25.

Sebrafisk embryo, på grunn av sin størrelse, gjennomsiktighet, og genetisk tractability, har mange fordeler for nyreskade studier <sup> 25, der metoden for mikroinjeksjon 20,21 benyttes for å administrere molekylet (e) for undersøkelse. Nephrons er dannet av 24 timer etter befruktning (HPF) og begynner å filtrere blodet med ca 48 HPF 26,27. Således er rask dannelse og funksjon av den embryoniske nyre forenkler eksperimentell analyse. Men prosessen med mikroinjeksjon har tekniske utfordringer, og det kan være en bratt læringskurve for å mestre teknikken. I denne videoen artikkelen beskriver vi hvordan du utfører microinjections og gi feilsøkingstips for å øke frekvensen av vellykkede injeksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrene for arbeid med sebrafisk embryoer som er beskrevet i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Notre Dame.

1. Utarbeidelse av Solutions

  1. Foreta en 50x stamløsning av E3 embryo media ved å blande 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2, og 9,95 g MgSO4 i 5 liter destillert vann, og oppbevar ved RT.
  2. For dyrking av sebrafisk embryoer, fortynne 50x stamløsning av E3 embryo media lager til en 1x arbeidsløsning med destillert vann, deretter legge 200 mL av 0,05% metylenblått til hver 1 liter 1x E3 til å fungere som en soppdreper, og butikken på RT.
  3. Foreta en pigmentering blokkerende oppløsning av E3 embryo media med 0,003% 1-fenyl-2-tiourea (PTU) ved å kombinere 40 ml av 50x E3 lager med 0,06 mg PTU. Deretter bringe volumet til totalt 2 L med destillert vann.
  4. Omrør E3 / PTU O / N ved RT for å få den PTU pulveret i oppløsning. Deretter lagre E3 / PTU påRT.
    Merk: E3 / PTU har en holdbarhet på ca en uke, og eldre løsninger vil være mindre effektiv til å blokkere pigmentering utvikling i sebrafisk larver.
  5. Lage et anestetikum oppløsning av 0,2% Tricaine (MS-222) ved å tilsette 1 g Tricaine til 500 ml destillert vann, og justere pH til 7,2 med 1 M Tris, pH 9,5.
  6. Forberede for å lage en 2% metylcelluloseløsning for avbildning ved å anbringe en oppløsning av 1x E3 (uten metylenblått), sammen med 1/10 volum av 0,2% Tricaine tilsatt ved 4 ° C.
    Merk: metylcelluloseløsning er en tykk, klar oppløsning som brukes til å stabilisere forsiktig levende embryoer for mikroskopi. Etter manipulasjoner utføres embryoene kan vaskes i 1x E3 å oppløse methylcellulose uten å skade dyret og muliggjør mikroskopi ved etterfølgende trinn i den samme prøven.
  7. Når avkjølt til 4 ° C, rør 1x E3 / Tricaine løsning kraftig på oppsikt plate og gradvis legge til riktig mengde av metylcellulose pulver mens du fortsetter å røre kraftig. Tilsett pulveret til oppløsningen for å forhindre dannelsen av uoppløselige aggregater metylcellulose.
  8. Etter at alt pulveret er blandet inn i den 2% metylcellulose / E3 / Tricaine løsning, omrøring av kompositt løsningen i 4 ° C kaldt rom O / N.
    Merk: Den kalde temperaturen er best for fullstendig å oppløse pulveret. Dersom løsningen ikke er klar etter en natt, rør for en ekstra arbeidsdag og / eller andre O / N.
  9. For å fjerne luftbobler fra 2% metylcellulose / E3 / Tricaine løsning, alikvoter av blandingen til 1,5 ml rør og sentrifugering ved høy hastighet (12.000 x g) ved 4 ° C i 30 minutter eller inntil 2 timer.
  10. Plasser 2% metylcellulose / E3 / Tricaine løsning ved 4 ° C for langtidslagring.
    Merk: Før bruk, porsjoner bør forvarmes til RT for å arbeide med sebrafisk prøver.

2. Utarbeidelse av verktøy

  1. Forbered et embryo manipulator verktøy, som brukes til positioning embryoer for mikroinjeksjon, ved å feste en gel lasting tips på slutten av en 5 "straight dissekere nål, og fest med tape eller superlim.
  2. Forbered mikroinjeksjon nåler ved hjelp av en nål avtrekker, ved først å plassere en brann polert 10 cm borsilikatglass med glødetråd inn i instrumentet og fest borsilikatglass ved å stramme håndtakene.
  3. Trekk borsilikatglass til mote fine koniske nåler. Bruk følgende innstillinger: varme 540, pull 245, hastighet 200, og tid 125.
  4. Plasser nåler inne i en petriskål, susp dem på en stripe av modellering leire for å beskytte nålen tips, og holde fatet dekket for å hindre oppsamling av støv.
  5. For å fullføre utarbeidelsen av nål for microinjections, bruke et barberblad eller fine tang kant å kutte trakk enden av nålen for å lage en skarp kantete injeksjon spissen med en diameter på ca 0,05-0,1 mm.
  6. For å gjøre mikroinjeksjon skuffen, utarbeide en 1,5% agarose / E3 løsning i en 100 ml Erlenmeyerkolbe og oppløse agarosen ved oppvarming av E3 til koking i en mikrobølgeovn og deretter la den avkjøles ved romtemperatur i ca. 10 min.
  7. Hell den avkjølte agarose / E3 oppløsning inn i en petriskål for å lage et fundament med en dybde på omtrent 0,5 cm. Når dette har stivnet helle et andre sjikt med en dybde på omtrent 0,3 cm og sette inn den prefabrikkerte embryo vel formen og tillate agarose å stivne ved romtemperatur.
    Merk: Når du setter formen inn i toppagar / E3 lag, å plassere støpeformen inn i agaren i en vinkel for å redusere antallet luftbobler.
  8. Når hele mikroinjeksjon skuffen har satt, løft den prefabrikkerte embryo godt forme ut sakte og forsiktig ut med en scoopula, deretter fylle fatet med E3-løsning og oppbevares ved 4 ° C.

3. Embryo Forberedelse

  1. Sett opp sebrafisk parring tanks ved å plassere skillevegger i parring kamre og fyll med system vann.
  2. Plasser en fisk på hver side av deleren such at hver parring kammer inneholder en kvinnelig og en mannlig fisk, og dekke hver parring kammer.
  3. Neste morgen, fjerne skillevegger for å aktivere gyting.
  4. Sjekk fisken etter ca 30 min, og etter retur de voksne til akvariet, samle sine embryoer ved å sende parings tank vann gjennom en fin maskenett sil verktøyet.
  5. Snu sil over en petriskål og skyll med E3 for å samle embryoer.
  6. Inkuber embryoer ved 28,5 ° CO / N.
  7. Når embryoer har nådd 24-26 somitt trinnet 26, dekanter det meste av E3 media og deretter dechorionate ved tilsetning av 100 ul 50 mg / ml pronase til hver skål av embryoer og inkubering av fatet ved romtemperatur (23 ° C) i omtrent 15 min.
    Merk: Det tar omtrent 24-25 timer fra tidspunktet for befruktning for embryoene å nå 24-26 somitt stadium dersom de er samlet på den beskrevne måte og inkuberes O / N ved 28,5 ° C.
  8. Fyll formen medE3 og deretter virvle forsiktig for å løsne chorions fra embryoer.
  9. Dekanter E3 / pronase og skyll fatet med 25 ml fersk E3. Gjenta skylle skritt for å fjerne all pronase.
  10. Hvis du vil blokkere utviklingen av pigmentering, dekanter E3 og erstatte med 25 ml fersk E3 / PTU når embryoene har nådd 24 timer etter befruktning.
    Merk: For eksperimenter spenner over flere dager, erstatte E3 / PTU løsning med friske media en gang daglig for å holde fatet rent.

4. Mikroinjeksjon av nyreskade Solution

  1. På dagen for injeksjon, forberede den ønskede nyreskade løsning sammen med de aktuelle kjøretøykontroll.
  2. Forsiktig blanding, forsiktig for å sikre stoffet (e) er / er i oppløsning, ved å kontrollere sider av røret og toppen av vannsøylen.
    Merk: nyreskade løsninger kan være forberedt på å inneholde spor av fluorescens-konjugert dekstran å overvåke mikroinjeksjon effektivitet og også vurdere renal clearance på subsequent tid peker 20,28.
  3. Legg i en trimmet mikroinjeksjon nål med ~ 2-3 mL av nyreskade ved å tre en fin gel lasting tips inn på baksiden av nålen og suspen nålen vertikalt med et stykke tape slik at løsningen for å fylle den trimmede nålespissen av tyngdekraften.
  4. Når nålespissen er full, sikre lastet nålen i micromanipulator.
  5. Test mikroinjeksjon volumet ved å plassere en dråpe mineralolje på en mikrometer lysbilde og injisere inn i olje å evaluere dråpestørrelse. Et injeksjonsvolum på 500 pl har en diameter på 0,1 mm.
  6. Fjern parabolen av embryoer fra inkubatoren, og bedøve ved å legge til ca 5 ml 0,2% Tricaine til embryoet parabolen.
  7. For å sikre fullstendig anesthetization, forsiktig berøre embryo med spissen av embryo manipulator verktøyet. Mangel på bevegelse indikerer tilstrekkelig anesthetization.
  8. Etter vellykket anesthetization, overføre embryo til injeksjon mold med en overfer pipette.
  9. Manøvrere hver embryo inn i en annen brønn av formen å plassere et innlegg i det dypeste området av brønnen, slik at stammen hviler langs depresjon og halen stikker opp av fordypningen.
  10. Sett fylt nål inn i micromanipulator og plasser nålespissen ved siden av et embryo.
  11. Forsiktig stikk nålen inn i halen fartøyet ved å flytte joysticken forover og trykk ned pedalen for å levere mikroinjeksjon.
    Merk: Vellykket injeksjon kan måles ved å se væsken angi sirkulasjon. Videre, co-injeksjon av nephrotoxicant med fluorescerende konjugert dekstran gjør at forskeren å bekrefte vellykket injeksjon i etterkant av inngrepet.
  12. Trekk forsiktig tilbake på joysticken for å fjerne nålen fra embryo.
  13. Etter injeksjon, overføre embryoene til en ren tallerken og skyll å fjerne Tricaine og erstatte med frisk E3 / PTU.
  14. Inkuber embryo til ønsket tidspunkt å assess morfologi, som kan dokumenteres ved fotografering i metylcellulose montering media, eller prosessen for eksperimentell analyse som ønsket.
    Merk: Gjenoppretting av embryo bør vurderes for å bestemme andelen av personer med ødem, som vanligvis indikerer nyreskade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En mikroinjeksjon stasjon satt opp inkluderer en stereomikroskop, micromanipulator og trykkregulator (figur 1A). Gjennomlysnings av injeksjons plate er å foretrekke å vise prøvestykker i løpet av denne fremgangsmåten (figur 1B). Forberedelse av injeksjonsnålen innebærer å trekke den aktuelle borsilikatglass, etterfulgt av å forberede kanten med skjæring og endelig tilbake-lasting nålen. Optimalt blir nålespissen avfaset i stedet for sløv (figur 1C), et snitt som er laget av kraftig vinkling kanten av skjæreapparatet, slik som fin pinsett, under skjæreprosedyren (Figur 1D). Denne skrå kanten er kritisk og vil i stor grad påvirke evnen til å forsiktig sette nålen inn i sebrafisk.

På dagen for injeksjon, ble embryoer plassert ved hjelp av solid, men smidig embryomanipulasjon verktøy (figur 1E). For injeksjon ble embryoer manøvrert, slik at overkroppen hvilte langs siden av injeksjons skuffen for å gi leverage for den påfølgende injeksjonstrinn (figur 1F). Mens injisering, bør man fokusere flyet syn på embryonale torso å visualisere det vaskulære reisemål for nålestikk og deretter observere det injiserte materialet går inn i sirkulasjon (figur 1G).

Gjennomsiktigheten av sebrafisk embryo forenkler mikroinjeksjon prosedyren, og kan bli ytterligere forsterket av PTU kjemisk behandling ved 24 HPF å redusere utviklingen av pigmentering under en vanlig eksperimentelle utdanning (figur 2A). Her ble embryo prøvene lov til å utvikle seg gjennom den 72 HPF trinnet, så var enten mock injisert, mikroinjisert med saltvannsbærer, eller mikroinjisert med 2,5 mg / ml gentamicin (figur 2A).Etterfølgende levende observasjon ble utført på en og to dager etter injeksjon, ved hjelp transillumination belysning med en stereomikroskop (figur 2B). Sammenlignet med simulerte eller saltvann injisert embryoer, bare de gentamicin-injisert individer viste utvikling av ødem (figur 2B), i dette tilfellet perikard ødem, noe som tyder på en oppheving av normal nyre funksjonaliteten i samsvar med tidligere publiserte observasjoner 11,20,21.

Figur 1
Figur 1. Mikroinjeksjon apparater og verktøy. (A) Injeksjon stasjon satt opp med stereomikroskop (til venstre), micromanipulator og nåleholder (i midten) og trykkregulatoren (høyre). (B) gjennomlysnings av injeksjonsplaten. (C) Venstre: Blunt cut nål. Høyre: Skrå kutt nål. (D) Fine tang brukes til å kutte nål tips. (E) manipulasjon verktøy som brukes til å sette inn og plassere prøvene inn i injeksjon mold. (F) Embryoet kledd i mikroinjeksjon mold. Scale bar = 0,5 mm. (G) posisjonering av kanylen ved siden av embryo for injeksjon. Scale bar = 0,15 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Eksperimentell tidslinje og postinjeksjons ødem analysen. (A) Eksempel nyreskade eksperimentell tidslinjen i sebrafisk, her brukes på en gentamicin studie. Embryoet ble dechorionated og behandlet med PTU løsning på 24 timer etter befruktning (HPF). Hver dag, det PTU oppløsningen ble dekantert og erstattet med friskt medium som indikert ved smaller grønne pilene. Ved 72 HPF, ble bedøvet embryoer, overført til en sprøytestøpeform, og deretter behandlet som følger: uekte eller injiseres enten saltvann (bærerkontroll) eller gentamicin. Etter å gjenopplive embryoene i frisk media, ble embryoene observert ved 1 og 2 dager etter injeksjon (96 og 120 HPF, henholdsvis) for analyse og bildeopptak. (B) Top: injiserte sebrafisk embryo. Midten: embryo injisert 72 HPF med saltvann. Bunn: embryo injisert med 2,5 mg / ml gentamicin. Scale bar = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et variert antall av terapeutiske midler har vært forbundet med AKI 29. Det har vært betydelige forsknings fremskritt i forståelsen av skaden fremkalt av mange individuelle forbindelser, som for eksempel aminoglykosid gentamicin 30 og den brukte kjemoterapeutiske cisplatin 31,32. Noen patologiske forandringer som er involvert i disse forholdene, men er fortsatt gjenstand for pågående studie. En emergent utfordring er fortsatt å forstå hvordan flere legemidler påvirke pasienter, særlig de i høyrisikogrupper slik som de i kritiske pleie og eldreomsorg 29. Dermed modeller som muliggjør videre mobilnettet basert studier om effekten av legemiddelindusert AKI tjener en viktig rolle i å forbedre deteksjon av denne tilstanden og verdsette dynamiske legemiddelinteraksjoner.

Arbeid med pattedyr modeller som mus og rotter har vært integrert for å etablere celleforandringer i nyre følgende AKI, but en begrensning med disse systemene er at direkte, real-time observasjon er begrenset på grunn av den arkitektoniske kompleksitet og intern plassering av orgelet. Enkelt sagt, er nyrene ikke tilgjengelig for direkte observasjon, noe som nødvendiggjør at enkeltpersoner bli ofret for å analysere nyre. Disse begrensningene kan motvirkes ved hjelp av sebrafisk embryoer, som danner en enkel nyre av to nephrons som har en konservert segmentstruktur med andre virveldyr, inkludert mennesker 33. Sebrafisk utvikling skjer ex utero og med mindre pigmentering, noe som åpner for direkte observasjon av renal organ og oppfølging av tiltak mot eksterne signaler 34. Verktøy for molekylær analyse som genekspresjon 35-37, har blitt utnyttet med høy oppløsning for å bestemme egenskapene til nephrogenesis 38-40. Eksperimentelle manipulasjoner for testing av små molekyler gjennom kjemiske genetikk er godt etablert i sebrafisk og gjelder for kidney 41-43. Faktisk, i de senere år, sebrafisk har blitt brukt til å modellere nefrotoksisitet av agenter som spenner fra acetominofen til mykotoksiner og aristolochic syre 44-48. Det er viktig å merke seg at det finnes også betydelige begrensninger for AKI modellering i sebrafisk embryo, på grunn av den meget enkle nyre struktur på dette stadium i utviklingen. For eksempel er sebrafisk ikke egnet til å ta opp multifaktorielle interaksjoner i nyrevevet som er tettpakket med nephrons som er omgitt av en kompleks stroma som inneholder flere interstitiell celletyper, slik tilfellet er i gnager eller menneskelige metanephros. Dermed er sebrafisk best egnet til å visualisere autonome cellulære og molekylære endringer i nevronet under AKI.

Metoden for mikroinjeksjon beskrevet her, samtidig som de har en bratt læringskurve, er svært nyttig for å studere både utviklings- og sykdomstilstander, inkludert nephrotoxins. Denne teknikken kan brukes til test narkotika enkeltvis eller i kombinasjon. I tillegg kan injeksjonene utføres under et vidt spekter av utvikling tidspunkter. En tilsvarende, like levedyktig fremgangsmåte for å utføre intravenøse microinjections i sebrafisk larver har tidligere blitt beskrevet av cosentino, et al., 21. En vesentlig forskjell i deres metode, sammenlignet med de metoder som er beskrevet her, er at embryoet som skal injiseres er immobilisert ved bruk av en holde pipette 21. Bruken av en holde pipette er et levedyktig alternativ til sprøytestøpeformen. Forskere som søker å gjennomføre mikroinjeksjon som leveringsmåte for nephrotoxicant midler bør være klar over dette alternativet, og kanskje ønsker å sammenligne metoder for å identifisere hvilke er personlig foretrekke, som å lære å manipulere holde pipette for ikke å skade embryoet vil innebære praksis akkurat som det krever øvelse å kunne manøvrere og microinject hjelp av en enkel injeksjon mold med en depresjon hulrom for embryos.

Når du utfører denne prosedyren, er det viktig å forberede riktig størrelse kanyler, og å kutte vinkelen på nålespissen å optimalisere glatt inngang og utgang til embryonale sirkulasjon. Under injeksjonsprosedyren, er det viktig å overvåke injeksjonsvolumet for å vurdere konsistensen av nyreskade leverings mellom prøver. Periodisk vurdering av injeksjonsvolumet med et mikrometer kan utføres hvis forskeren er usikkert om endringer i volum mens du utfører et eksperiment. For eksempel, på grunn av beskaffenheten av teknikken, nålespissen kan helt eller delvis tette med cellulært avfall. Denne komplikasjonen kan motvirkes ved å fjerne nålen jevne mellomrom for å sikre konsistens i slynges ut væsken. I tillegg kan en vital fargestoff som fenolrødt tilsettes til blandingen for å virke som en visuell indikator på injeksjonen, og hjelpe til å overvåke fluidsprednings 49,50. Videre kan injeksjoner av tracer molekyler hjelpevisualisere spesifikke cellepopulasjoner, etter injeksjonen. For co-injeksjon av fluorescerende dekstran rester, spesielt 10 kDa dekstran konjugater, har en rekke bruksområder 16,17. I dette tilfellet, kan evalueringen av fluorescerende intensitet utføres umiddelbart etter fremgangsmåten for å bekrefte vellykket mikroinjeksjon med minimal lekkasje. Intensiteten kan måles ved hjelp av egnet bildeopptak fotografering og deretter reexamined ved senere tidspunkt for å måle endring i fluorescerende intensitet, slik som å måle renal clearance 51. Videre reabsorpsjon av dekstran i proksimale tubuli gir en proxy for funksjonaliteten til denne nephron segmentet 16,17.

Tatt sammen, er det mange måter som mikroinjeksjon kan benyttes til å undersøke AKI med sebrafisk, særlig når denne modellen gir mulighet til å ta opp farmakokinetikken in vivo. Dermed når mestret, mikroinjeksjon av nephrotoxinsinn i sebrafisk embryo gir en nyttig paradigme for nyre studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH stipend DP2OD008470. I tillegg RAM ble støttet delvis av midler fra University of Notre Dame Graduate School. Vi takker staber av Department of Biological Sciences, Senter for Sebrafisk forskning og Senter for stamceller og regenerativ medisin ved University of Notre Dame. Vi vil spesielt takke medlemmene av lab for å engasjere diskusjoner om nyre biologi og deres nyttige tilbakemeldinger på dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
 (microinjection tray) 150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Micrometer Ted Pella, Inc. 2280-24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).

Tags

Medisin sebrafisk nyre nyreskade renal clearance akutt nyreskade mikroinjeksjon gentamicin
Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKee, R. A., Wingert, R. A.… More

McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter