Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54241
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

Почечная травмы, понесенные от нефротоксинов, которые включают в себя препараты, начиная от антибиотиков до химиопрепаратов, может привести к сложных расстройств, чьи патогенез остается не полностью понята. Этот протокол показывает, как данио могут быть использованы для моделирования заболеваний этих условий, которые могут быть применены к идентификации ренопротективных мер.

Abstract

Почки подвержены вред от воздействия химических веществ, они отфильтровывают из крови. Это может привести к травме органа, связанного с быстрым снижением функции почек и развития клинического синдрома, известного как острое повреждение почек (AKI). Фармакологические средства, используемые для лечения медицинских условий, начиная от бактериальной инфекции, рака, при введении по отдельности или в комбинации с другими препаратами, может инициировать AKI. Рерио являются полезной животной моделью для изучения химического воздействия на функцию почек в естественных условиях, так как они образуют эмбриональной почки , состоящую из нефрона функциональных блоков, которые сохраняются с высших позвоночных, включая человека. Кроме того, данио могут быть использованы для выполнения генетических и химических экранов, которые обеспечивают возможности для выяснения клеточные и молекулярные аспекты AKI и разработки терапевтических стратегий, таких как идентификация нефропротективные молекул. Здесь мы покажем, как микроинъекции вданио эмбриона может быть использован в качестве парадигмы для исследований nephrotoxin.

Introduction

AKI резкое потеря функции почек , что может привести к разрушительным последствиям для здоровья 1. AKI является серьезной проблемой здравоохранения во всем мире из - за его высокой заболеваемости примерно на 20% среди госпитализированных пациентов с еще более высокими темпами 30-50% в случаях интенсивной терапии и пожилых людей, а также показатели смертности 50-70% 1-3. К сожалению, распространенность AKI растет и, по прогнозам, к дальнейшей эскалации в течение следующего десятилетия, отчасти из-за многообразия факторов, которые могут вызвать AKI, которые включают в себя послеоперационный стресс, ишемию и подверженность воздействию нефротоксинов, таких как антибиотики и химиотерапевтические препараты 4.

AKI включает в себя внезапное повреждение клеток внутри почки, обычно встречающихся в нефронов, которые являются необходимыми функциональными единицами, и состоят из фильтра крови и сегментированным трубочку , которая стекает мочу в центральные канальцев 1. Когда значительное количество нефроновповреждения во время AKI, непосредственные эффекты включают прерывание клиренса отходов из обращения, а также снижение или отменяться потока жидкости через нефронов вследствие обструкции из мертвых и умирающих клеток 1. Со временем, трубчатая обструкция может привести к вырождению целых нефронов, которая постоянно снижает функцию почек 1. Физиологические изменения в почках следующие AKI также включать в себя сложные воспалительные явления , которые могут привести к хроническому рубцеванию 1.

Несмотря на эти результаты, нефронов имеют некоторую способность пройти регенерацию после AKI , что воссоздает трубчатый эпителий 5,6. В то время как наблюдается увеличение молекулярного понимания регенерации нефрона, механизмы остаются неуловимыми во многих отношениях и обусловливают необходимость продолжали расследование 7. Степень, в которой результаты AKI в постоянное повреждение почек также остается неизвестным. Текущие исследования показывают, восстановительный потенциал для почек являетсявысокий следующие менее серьезные случаи AKI, в то время как более выраженные или повторные эпизоды приводят к хроническим заболеванием почек (ХБП) и завершаются в терминальной стадии почечной недостаточности (ТПН) , что требует спасения жизни трансплантации или диализ 8,9. Кроме того, люди , уже страдающие от CKD находятся на еще более высокий риск заражения серьезный эпизод AKI 8,9. Взятые вместе, то ясно, что по-прежнему фундаментальные и клинические исследования имеет жизненно важное значение для понимания, лечения и профилактики AKI.

Исследования с моделями животных играет важную роль в оценивая развитие местных и экологических изменений , которые происходят во время AKI 10. Для того, чтобы расширить это понимание, а также разработать новые методы лечения, то данио модель животного была использована в различных формах 11,12. В нефронов данио почки, в обоих эмбриона и взрослого, показывают высокий уровень сохранности с млекопитающих 13-16. Кроме того, нефрона эпителиальной травмы в геbrafish напоминает процесс в высших позвоночных животных, в результате чего происходит локальное разрушение трубчатых клеток с последующим внутриканального пролиферации и восстановления нефрона архитектуры 17-19. У эмбрионов, однако, значительный ущерб трубочка от нефротоксинов как цисплатин связано с летальностью 20,21. Для сравнения, данио взрослые выживают AKI и демонстрируют существенные регенеративные способности в почках. Например, после воздействия аминогликозидов гентамицин антибиотика, данио регенерировать канальцев повреждения эпителиального и вырастить новые блоки нефрона, а 22-24. В то время как эти гентамицин-индуцированная исследования AKI предоставили ценную информацию, понимание почек ущерб от различных нефротоксинов остается критическим , чтобы оценить последствия и реакцию на различные типы повреждений 25.

Данио эмбриона, из-за его размера, прозрачности и генетической сговорчивости, имеет много преимуществ для исследований nephrotoxin <SUP> 25, где метод микроинъекции 20,21 используется для администрирования молекулы (ы) для исследования. Нефронов формируются на 24 ч после оплодотворения (ФВЧ) и начинают фильтровать кровь примерно 48 HPF 26,27. Таким образом, быстрое формирование и функционирование почек эмбриона облегчает экспериментальный анализ. Тем не менее, процесс микроинъекции имеет технические проблемы, и может быть крутой кривой обучения для овладения техникой. В этом видео статье мы опишем, как выполнять микроинъекций и предоставлять советы по устранению неполадок, с тем чтобы повысить скорость успешных инъекций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры для работы с эмбрионов данио, описанных в этом протоколе были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных путем в Университете Нотр-Дам.

1. Приготовление растворов

  1. Сделать 50x маточного раствора Е3 эмбрионов сред путем смешивания 73,0 г NaCl, 3,15 г KCl, 9,15 г CaCl 2 и 9,95 г MgSO 4 в 5 л дистиллированной воды, и хранить при комнатной температуре.
  2. Для культивирования эмбрионов данио, разбавить 50x маточного раствора Е3 эмбрион медиа запаса для рабочего раствора 1x с дистиллированной водой, а затем добавляют 200 мкл 0,05% метиленовым синим на каждый 1 л 1x E3 выступать в качестве фунгицида, и хранить при RT.
  3. Сделать пигментации блокирующий раствор E3 эмбрионов сред с 0,003% 1-фенил-2-тиомочевины (PTU) путем объединения 40 мл 50Х E3 запаса с 0,06 мг PTU. Затем довести объем в общей сложности до 2 л дистиллированной водой.
  4. Перемешать E3 / PTU O / N при комнатной температуре, чтобы получить порошок PTU в раствор. Затем сохраните E3 / PTU вRT.
    Примечание: E3 / PTU имеет срок годности приблизительно в одну неделю, а более старые решения будут менее эффективны при блокировании развитие пигментации в данио личинок.
  5. Сделать анестезирующий раствор 0,2% Tricaine (MS-222) путем добавления 1 г Tricaine к 500 мл дистиллированной воды и доведения рН до 7,2 с помощью 1 М Трис, рН 9,5.
  6. Готовят сделать 2% -ный раствор метилцеллюлозы для визуализации путем размещения раствора 1x E3 (без метиленовый синий), с 1/10 объема Tricaine добавляют при температуре 4 ° С 0,2%.
    Примечание: метилцеллюлоза раствор представляет собой толстый, прозрачный раствор, который используется для стабилизации мягко живых эмбрионов для микроскопии. После того, как манипуляции выполняются эмбрионы можно мыть в 1x E3, чтобы растворить метилцеллюлозы, не повредив животное и позволяет микроскопии на последующих этапах в том же образце.
  7. При охлаждении до 4 ° С, перемешайте раствор 1x Е3 / Tricaine энергично на мешалке и постепенно добавляют соответствующее количество метилового эфирапорошок целлюлозы, продолжая энергично перемешать. Постепенно добавлять порошок к раствору, чтобы предотвратить образование нерастворимых агрегатов из метилцеллюлозы.
  8. После того, как весь порошок смешивают в 2% растворе метилцеллюлозы / E3 / Tricaine, размешать композиционный раствор в 4 ° C холодном помещении O / N.
    Примечание: Холодная температура лучше всего подходит для полного растворения порошка. Если раствор не ясно, после одной ночи, перемешивают еще в течение рабочего дня и / или второй O / N.
  9. Для того, чтобы удалить пузырьки воздуха из 2% метилцеллюлозы / раствора / Tricaine E3, аликвоты смеси в 1,5 мл пробирки и отжим на высокой скорости (12000 х г) при температуре 4 ° С в течение 30 мин или до 2 часов.
  10. Поместите 2% метилцеллюлозы решение / E3 / Tricaine при 4 ° С для длительного хранения.
    Примечание: Перед использованием аликвоты должны быть предварительно нагреты до комнатной температуры для работы с данио образцов.

2. Подготовка инструментов

  1. Подготовьте инструмент эмбрион манипулятором, используемый для роsitioning эмбрионов для микроинъекции, путем прикрепления наконечника гель нагрузки на конце "прямой рассекает иглы 5, и закрепите скотчем или суперклеем.
  2. Приготовьте иглы микроинъекции с помощью иглы съемника, предварительно поместив огонь полированные 10 см из боросиликатного стекла с нитью в прибор и закрепить боросиликатного стекла путем затягивания ручки.
  3. Вытащите из боросиликатного стекла моды тонкой иглы клиновидные. Используйте следующие параметры: нагреть 540, тянуть 245, скорость 200 и время 125.
  4. Место иглы внутри чашки Петри, суспендирующие их на полосу пластилина, чтобы защитить кончики игл, и держать блюдо покрытые, чтобы предотвратить накопление пыли.
  5. Для того, чтобы завершить подготовку иглы для микроинъекции, используйте лезвия бритвы или тонким пинцетом край, чтобы отрезать притянутое конец иглы, чтобы создать острый наконечник угловой инъекции с диаметром приблизительно 0,05-0,1 мм.
  6. Для того, чтобы лоток микроинъекции, подготовить 1,5% раствора агарозы / E3 в 100 мл колбу Эрленмейера и растворить агарозы путем нагревания E3 до кипения в микроволновой печи затем дают остыть при комнатной температуре в течение приблизительно 10 мин.
  7. Налейте охлажденный раствор агарозы / E3 в чашку Петри, чтобы сделать фундамент с глубиной около 0,5 см. Когда затвердеет налить второй слой на глубину приблизительно 0,3 см и вставьте фабрично форму эмбриона хорошо и позволяют агарозном затвердевать при комнатной температуре.
    Примечание: При вставке пресс-формы в верхний слой агара / E3, поместив пресс-формы в агар под углом, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха.
  8. Когда весь лоток микроинъекции установил, поднимите сборный эмбрион хорошо лепить медленно и осторожно, используя Кулинарная лопатка, а затем заполнить блюдо с раствором Е3 и хранить при температуре 4 ° С.

3. Эмбрион Приготовление

  1. Настройка данио сопрягаемые танков путем размещения разделителей в брачных камер и залить водой системы.
  2. Поместите одну рыбу на каждой стороне делителя сУч, что каждая камера содержит спаривание одна женщина и один самец рыбы, и покрывают каждую сопрягаемую камеру.
  3. На следующее утро, удалить разделители, чтобы включить нерест.
  4. Проверьте рыбу примерно через 30 минут, а после возвращения взрослых в аквариум, собирать их эмбрионов, пропуская спаривание резервуар для воды через тонкий инструмент ситечко из проволочной сетки.
  5. Обратить сетчатый фильтр над чашку Петри и полоскание с E3 для сбора эмбрионов.
  6. Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° CO / N.
  7. Когда эмбрионы достигли 24-26 сомитов 26, переливать большинство средств массовой информации E3 , а затем dechorionate путем добавления 100 мкл 50 мг / мл проназой каждую чашку эмбрионов и инкубирование блюдо при комнатной температуре (23 ° С) в течение приблизительно 15 минимум
    Примечание: Это займет около 24-25 ч с момента оплодотворения для эмбрионов, чтобы достичь стадии 24-26 сомита, если они собраны в том же порядке и инкубировали O / N при 28,5 ° C.
  8. Заполните блюдоE3, а затем циркулировать осторожно, чтобы выбить хорионов из эмбрионов.
  9. Слейте E3 / проназу и полоскание блюдо с 25 мл свежей Е3. Повторите шаг для ополаскивания, чтобы удалить все проназу.
  10. Для того, чтобы блокировать развитие пигментации, переливать E3 и заменить 25 мл свежего E3 / PTU, когда зародыши, достигшие 24 часов после оплодотворения.
    Примечание: Для экспериментов на протяжении нескольких дней, заменить решение E3 / PTU со свежей средой один раз в день, чтобы держать блюдо в чистоте.

4. Микроинъекция Nephrotoxin Solution

  1. В день инъекции, готовят искомое решение nephrotoxin вместе с соответствующим управления транспортным средством.
  2. Вихревой или осторожно перемешать, чтобы обеспечить препарата (ов) / находятся в растворе, проверяя сторонах трубы и верхней части столба воды.
    Примечание: Nephrotoxin растворы могут быть приготовлены, чтобы содержать следовые количества флуоресцентной сопряженного декстрана для мониторинга эффективности микроинъекции, а также оценить почечный клиренс на после-uent раз указывает 20,28.
  3. Загрузите обрезанный микроинъекции иглу с ~ 2-3 мкл nephrotoxin, продев тонкий гель загрузки наконечник в задней части иглы и приостановить иглу вертикально кусок ленты, чтобы позволить раствору, чтобы заполнить обрезанного кончик иглы под действием силы тяжести.
  4. После того, как кончик иглы полон, обеспечить загруженную иглу в микроманипулятора.
  5. Проверьте громкость микроинъекции путем размещения каплю минерального масла на микрометрическим слайде и вводят в масло для оценки размера капель. Вводимый объем 500 мкл имеет диаметр 0,1 мм.
  6. Удалите блюдо из эмбрионов из инкубатора и обезболить, добавляя приблизительно 5 мл 0,2% Tricaine к эмбриону блюдо.
  7. Для того, чтобы обеспечить полное обезболивание, осторожно потрогать эмбриона с кончиком инструмента эмбрион манипулятором. Отсутствие движения указывает на достаточное обезболивание.
  8. После успешного обезболиванием, переноса эмбрионов литья под давлением с элеменэр пипетку.
  9. Маневр каждого эмбриона в другую лунку формы размещения головки в самой глубокой части скважины таким образом, что ствол лежит вдоль впадины, а хвост торчит из депрессии.
  10. Вставьте заполненную иглу в микроманипулятора и поместите кончик иглы рядом с эмбрионом.
  11. Осторожно вставьте иглу в хвост судна, перемещая джойстик вперед и нажать на педаль, чтобы доставить микроинъекции.
    Примечание: Успешное инъекции можно судить, наблюдая жидкости входят в обращение. Кроме того, совместное введение в nephrotoxicant с флуоресцентной сопряженного декстрана позволяет исследователю проверки успешной инъекции последующей процедуры.
  12. Осторожно потяните на джойстик, чтобы удалить иглу из эмбриона.
  13. После инъекции переноса эмбрионов в чистую чашку и промойте, чтобы удалить Tricaine и заменить свежим E3 / PTU.
  14. Выдержите эмбриона к нужной точке времени на ослахs морфологии, которые могут быть задокументированы фотографии в метилцеллюлозы монтажа средств массовой информации, или процесса для экспериментального анализа, как хотелось бы.
    Примечание: Восстановление эмбрионов должны быть оценены, чтобы определить процент лиц с отеком, который обычно указывает на повреждение почек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Микроинъекции станция создана включает в себя Стереомикроскоп микроманипулятор и регулятор давления (Рис . 1А) Просвечивание инъекционной пластины , предпочтительно , чтобы просмотреть образцы во время этой процедуры (Фиг.1В). Приготовление инъекционной иглы включает потянув соответствующий боросиликатного стекла, а затем готовит кромку резки и, наконец, обратно загрузкой иглы. Оптимально, кончик иглы скошена , а не тупой (рис 1C), разрез , который сделан по резко наклонив край режущего инструмента, например, тонким пинцетом, во время процедуры резки (Рисунок 1D). Эта фаска имеет решающее значение и будет в значительной степени влиять на способность аккуратно вставить иглу в данио.

В день инъекции, эмбрионы были расположены с использованием прочной, но податливый эмбрионманипуляции с инструментами (рис. 1д) Для инъекции, эмбрионы были маневрировать, таким образом, что туловище покоилась вдоль стороны лотка для инъекций , чтобы обеспечить рычаги для последующей стадии впрыска (Рисунок 1F). При введении, следует сосредоточить внимание на плоскости зрения на эмбриональном туловище для визуализации сосудов место для введения иглы , а затем наблюдать за вводимый материал попадает в циркулирующие (рис 1G).

Прозрачность данио эмбриона облегчает процедуру микроинъекции, и может быть дополнительно повышена путем PTU химической обработке при температуре 24 часов после оплодотворения , чтобы уменьшить развитие пигментации в течение типичного экспериментального временного хода (фиг.2А). Здесь образцы эмбрионов позволили разработать через стадию 72 часов после оплодотворения, а затем были либо фиктивный вводили, микроинъекции с солевым транспортным средством, или микроинъекции с 2,5 мг / мл гентамицина (фиг.2А).Последующее наблюдение в прямом эфире было проведено в одном и двух дней после инъекции, с использованием просвечивания освещения с помощью стереомикроскопа (Фигура 2В). По сравнению с фиктивных или засоленных инжектированных эмбрионов, только к гентамицину впрыскивается индивидуумы показали развитие отека (Фигура 2В), в этом случае перикардиальной отека, что указывает на отмену нормальной функциональности почек в соответствии с ранее опубликованными наблюдениями 11,20,21.

Рисунок 1
Рисунок 1. Микроинъекция приборы и инструменты. (A) Инъекции станция устанавливается с стереомикроскопа (слева), микроманипулятор и держатель иглы (средний) и регулятор давления (справа). (В) Просвечивание инжекционной плиты. (C) Слева: Тупая игла порез. Справа: скошенный срез иглы. (D) FЩипцы ап пара та используется для резки кончиков игл. (E) Манипуляции инструменты , используемые для вставки и поместите образцы в литья под давлением. (F) Эмбрионы облеченные в микроинъекции формы. Шкала бар = 0,5 мм. (G) , позиционирование иглы рядом с эмбрионом для инъекций. Шкала бар = 0,15 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Экспериментальный график и после инъекции Отек анализа. (А) Пример nephrotoxin экспериментальной шкале времени в данио, здесь применяется к гентамицин исследования. Эмбрионы dechorionated и обрабатывают раствором PTU через 24 часа после оплодотворения (HPF). Каждый день, раствор сливают PTU и заменяли свежей средой, как указано Smalleг зеленые стрелки. На 72-HPF, эмбрионы были подвергнуты анестезии, переносили в литьевую форму, а затем обрабатывают следующим образом: фиктивный вводили или вводили либо физиологический раствор (контроль транспортного средства) или гентамицин. После того, как возрождение эмбрионов в свежей среды, наблюдались эмбрионы на 1 и 2 дня после инъекции (96 и 120 ФВЧ, соответственно) для анализа и получения изображений. (B) Верхняя часть : неинъецированных данио эмбриона. Средний: эмбрион вводят через 72 часов после оплодотворения с физиологическим раствором. Внизу: эмбрион вводят 2,5 мг / мл гентамицина. Шкала бар = 0,5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Разнообразная количество терапевтических агентов были связаны с AKI 29. Там были достигнуты значительные научные успехи в понимании ущерба , индуцированный многими отдельными соединениями, такими как аминогликозиды гентамицин 30 и широко используемого химиотерапевтического цисплатин 31,32. Некоторые патологические изменения, участвующие в этих условиях, однако, остаются предметом продолжающегося исследования. Одна эмерджентное проблема остается понимание того, как несколько препаратов отрицательно влияют на пациентов, особенно в группах высокого риска , таких как те , в условиях интенсивной терапии и пожилых людей 29. Таким образом, модели, позволяющие дальнейшие исследования, основанные клеточные о влиянии наркотиков индуцированных AKI играют важную роль в улучшении обнаружения этого состояния и оценить динамические взаимодействия наркотиков.

Работа с моделями млекопитающих, таких как мыши и крысы, были неотъемлемой частью установления клеточных изменений в почках следующие AKI, бушельт одно ограничение с этими системами в том, что наблюдение прямой, в режиме реального времени ограничено из-за архитектурной сложности и внутреннего расположения органа. Проще говоря, почки не доступен для непосредственного наблюдения, что требует, чтобы лица принести в жертву, чтобы проанализировать почки. Эти ограничения могут быть противопоставлены с использованием эмбрионов данио, которые образуют простую почку двух нефронов , которые имеют консервативную структуру сегмента с других позвоночных, включая человека 33. Данио развитие происходит ех утробе матери и с незначительной пигментацией, что позволяет для прямого наблюдения за почечной органогенеза и мониторинга ответов на внешние сигналы 34. Инструменты для молекулярного анализа, такие как экспрессии генов 35-37, были использованы с высокой разрешающей способностью, чтобы определить особенности нефрогенеза 38-40. Экспериментальные манипуляции для тестирования малых молекул с помощью химических генетики хорошо зарекомендовали себя в данио и применимы к kidnEY 41-43. Действительно, в последние годы, данио были применены к модели нефротоксичность агентов , начиная от acetominophen микотоксинами и aristolochic кислоты 44-48. Важно отметить, что существуют также значительные ограничения для моделирования AKI в данио эмбриона, из-за самой простоты почечной структуры на данном этапе развития. Например, данио не подходят для адресации многофакторные взаимодействия внутри почечной ткани, которая плотно заполнена нефронов, которые окружены сложной стромы, который содержит несколько интерстициальных типов клеток, как это происходит в грызуна или человека вторичной почки. Таким образом, данио лучше всего подходят для визуализации автономных клеточных и молекулярных изменений в нефрона во время AKI.

Метод микроинъекции, описанный здесь, имея при этом крутой кривой обучения, является очень полезным для изучения как в области развития и болезненные состояния, включая нефротоксинов. Этот метод может быть использован для т.ей препараты по отдельности или в комбинации. Кроме того, инъекции могут быть выполнены в течение широкого диапазона моментов времени разработки. Аналогичный, одинаково хорошо зарекомендовавшие способ выполнения внутривенных микроинъекций в данио личинок было ранее описано Косентино, и др. 21. Одно существенное различие в их методологии, по сравнению с методами , описанными здесь, является то , что эмбрион , который будет введен иммобилизуют с использованием удерживающей пипеткой 21. Использование удерживающей пипеткой является жизнеспособной альтернативой для литья под давлением. Исследователи, которые стремятся реализовать микроинъекции как способ доставки для nephrotoxicant агентов должны быть в курсе этой альтернативы и, возможно, пожелает сравнить методы, чтобы определить, какие лично предпочтительнее, так как научиться манипулировать удерживающую пипетку таким образом, чтобы не повредить зародыш будет включать в себя практику так же, как это требует практики, чтобы успешно маневрировать и microinject с помощью простой инъекции плесени с полостью депрессии для EMBRYos.

При выполнении этой процедуры, очень важно подготовить иглы для инъекций соответствующего размера, и, чтобы сократить угол на кончике иглы, чтобы оптимизировать плавный вход и выход в эмбриональном обращении. Во время процедуры инъекции, крайне важно, чтобы контролировать объем впрыска с целью оценки согласованности доставки nephrotoxin между образцами. Периодическая оценка объема впрыска топлива с помощью микрометра может быть выполнена, если исследователь не уверен изменения объема при проведении эксперимента. Например, в связи с характером техники, кончик иглы может быть частично или полностью закупоривают с клеточного дебриса. Это осложнение может быть нейтрализованы путем очистки иглы периодически, чтобы обеспечить согласованность выбрасываемой жидкости. Кроме того, витальным красителем как феноловый красный может быть добавлен к смеси , чтобы выступать в качестве визуального маркера инъекции и помочь в мониторинге рассеивание жидкости 49,50. Кроме того, инъекции молекул трассеров может помочь ввизуализации конкретных популяций клеток, после инъекции. Для совместного введения флуоресцентных декстран фрагментов, в частности , 10 кДа декстрана конъюгатов, имеет ряд применений 16,17. В этом случае оценка интенсивности флуоресценции можно проводить сразу после процедуры для подтверждения успешного микроинъекции с минимальной утечкой. Интенсивность может быть измерена с помощью соответствующего захвата изображения фотографии , а затем пересмотрено в последующие моменты времени , чтобы измерить изменение интенсивности флуоресценции , с тем чтобы измерить почечный клиренс 51. Кроме того, реабсорбция декстрана в проксимальных канальцах обеспечивает прокси для функциональности этого сегмента нефрона 16,17.

Взятые вместе, Есть много способов , которые микроинъекции могут быть использованы для исследования AKI с данио, в частности , как эта модель дает возможность обратиться к фармакокинетики в естественных условиях. Таким образом, когда-то освоили, микроинъекции нефротоксиновв данио эмбриона обеспечивает полезную парадигму для почечных исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана грантом DP2OD008470 NIH. Кроме того, оперативная память была частично поддержана за счет средств, предусмотренных в Университете Нотр-Дам Высшая школа. Мы благодарим штабы Отделения биологических наук, Центр исследований данио рерио, и Центром стволовых клеток и регенеративной медицины в Университете Нотр-Дам. Мы особенно благодарны членам лаборатории за участие дискуссии по поводу почек биологии и их полезные отзывы об этой работе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
 (microinjection tray) 150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Micrometer Ted Pella, Inc. 2280-24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
  2. Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
  3. Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
  4. Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
  5. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction? Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
  6. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
  7. Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  8. Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it's a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
  9. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  10. Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
  11. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  12. McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
  13. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  14. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  15. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  16. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
  17. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
  18. Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
  19. Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
  20. Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  21. Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  22. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  23. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  24. McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
  25. Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
  26. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Hanke, N., et al. 'Zebrafishing' for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
  29. Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
  30. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
  31. Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
  32. Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
  33. Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
  34. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
  35. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
  36. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
  37. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
  40. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
  41. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
  42. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
  43. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
  44. Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
  45. Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
  46. Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
  47. Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
  48. Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
  49. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
  50. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  51. Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).

Tags

Медицина выпуск 113 данио почек nephrotoxin почечный клиренс острое повреждение почек микроинъекции гентамицин
Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McKee, R. A., Wingert, R. A.… More

McKee, R. A., Wingert, R. A. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (113), e54241, doi:10.3791/54241 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter