Protocol
وقد أجريت فصادة الكريات البيض تحت بروتوكول البحث موضوع البشري الموافقة عليها من قبل المعاهد الوطنية للصحة المراجعة المؤسسية متنها.
1. عزل والحفظ بالتبريد من وحيدات
- الحصول على خلايا وحيدات النوى التي كتبها فصادة الكريات البيض من الجهات المانحة الإنسان، وإثراء حيدات التي كتبها المستمر لمكافحة تدفق الطرد المركزي تصويل من خلايا وحيدات النوى كما هو موضح في المراجع 7،8. الحصول على ما يقرب من 100 × 10 6 خلايا elutriated (حوالي 80 - 90٪ وحيدات) في المخزن تصويل المحدد من قبل الشركة المصنعة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- حيدات أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل البولي بروبلين في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف وبلطف resuspend الخلايا في FBS تليها سلفوكسيد ثنائي ميثيل لتحقيق تركيز النهائي من 90٪ FBS / 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 50 × 10 6 خلية / مل.
- إضافة كل مل من تعليق خلية تيس لcryovial الفردية.
- وضع cryovials في زنزانة تجميد الحاويات ونقل إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة 24 ساعة قبل نقل إلى النيتروجين السائل خزان cryovial للتخزين على المدى الطويل.
2. تمايز الخلايا وحيدة النواة في الضامة
- ذوبان الجليد في cryovial من الخلايا عن طريق نقل بسرعة إلى 37 درجة مئوية حمام الماء ثم إزالة فورا عند تعليق الخلية قد تحسنت حوالي 70٪.
- فور الذوبان الكامل في درجة حرارة الغرفة، ونقل 1 مل محتويات cryovial إلى 50 مل من 37 درجة مئوية درجة حرارة المعهد التذكاري روزويل بارك (RPMI) 1640 متوسطة مع 2 مم L-الجلوتامين، 50 نانوغرام / مل M-CSF، 25 نانوغرام / مل انترلوكين 10 (IL-10)، و 10٪ FBS (المتوسط الشامل).
- نقل 25 مل من تعليق الوحيدات في كل من اثنين من 75 سم 2 قوارير زراعة الخلايا البلاستيكية.
- احتضان الثقافات في 37 درجة خلية C الثقافة الحاضنة مع 5٪ CO 2/95٪ الجوية لمدة 48 ساعة.
- شطف مكعبltures 3 مرات مع 10 مل RPMI 1640 المتوسطة (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية)، وإزالة بلطف مستنبت لتجنب طرد أي خلايا فضفاضة يعلق.
- بعد الشطف، إضافة المتوسطة كاملة جديدة، وتغيير المتوسط كل يوم 2 حتى تفرق حيدات وتتكاثر بما فيه الكفاية لتصبح متموجة. وهذا يتطلب حوالي أسبوع واحد من الثقافة.
3. حصاد الضامة لبدء التجارب
- شطف الضامة متباينة في قارورة 3 مرات مع 10 مل قبل تحسنت مخزنة المالحة الفوسفات 37 ° C Dulbecco وبدون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ قبل إضافة 10 مل 37 ° C 0.25٪ حمض التربسين ethylenediaminetetraacetic (EDTA) حل قبل تحسنت.
- مكان قارورة في حاضنة الثقافة خلية ل10-15 دقيقة في الوقت الذي ما يقرب من 90٪ من الضامة يجب أن يكون مقربا ومنفصلة. التحقق من ذلك عن طريق الفحص المجهري للقارورة.
- إضافة 10 مل من RMPI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS إلى sكبار trypsinization.
- نقل تعليق خلية بلعم من القارورة في أنبوب البولي بروبلين 50 مل، الطرد المركزي 300 x ج لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف.
- resuspend بلطف الضامة في 1 مل من المتوسط الشامل.
- مزيج 10 ميكرولتر من تعليق خلية بلعم مع 10 ميكرولتر حل التريبان الأزرق وتحديد عدد الخلايا البلاعم وقدرتها على البقاء (عادة> 95٪) باستخدام عدادة الكريات.
- واستنادا إلى عدد خلايا (عادة حوالي 15 - 18 × 10 5 الضامة)، إضافة المتوسطة كاملة إضافية لتحقيق كثافة الخلية البذر المطلوب. ملاحظة: 1 × 10 5 الضامة في 1.5 مل المتوسطة لكل بئر من لوحة ال 12 أيضا سوف تنتج ثقافة شبه متموجة.
- بعد غرس البذور، واحتضان الضامة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حاضنة الثقافة الخلية مع 5٪ CO 2/95٪ الجوية للسماح مرفق الخلية. ثم، تبدأ التجارب المرجوة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كانت قابلية حيدات الطازجة أو cryopreserved أكبر من 95٪ كما هو محدد مع التريبان الأزرق تلطيخ 9 الشكل 1 والشكل 2 مقارنة في تكبير الدنيا والعليا، على التوالي، تقدم الطازجة وcryopreserved (أي المجمدة) الوحيدات التمايز في الضامة. لاحظ أن طازجة مقارنة مع تظهر حيدات cryopreserved جزء من السكان من التمييز وحيدات التي لا تنتشر ولكن تبقى مدورة. تحدث فجوات مرحلة لوسنت في الضامة الوحيدات المستمدة في كل الظروف. وتمثل هذه الفجوات مميزة macropinosomes من نوع الضامة M-CSF كما هو موضح سابقا 10،11.
لم الضامة Cryopreserving بعد حصادها من القوارير التي كانت متباينة من وحيدات لا تنتج الثقافات بلعم الناجحة ( البروتوكول أعلاه لإنتاج نوع الضامة M-CSF يفعل ذلك دون وجود تلوث نوع الضامة GM-CSF الذي يحدث أحيانا عندما يتم تأسيس الثقافات مباشرة من وحيدات دون الحفظ بالتبريد والتمايز إلى الضامة نوع M-CSF في قوارير. ومع ذلك، متباينة حيدات cryopreserved مع FBS + GM-CSF إنتاج ممتازة الثقافات نوع GM-CSF (الشكل 4). 
الشكل 1: مقارنة جديدة مقابل حيدات cryopreserved تستخدم لإنتاج الضامة (تضخم منخفض) المرحلة النقيض من الصور المجهرية وحيدات cryopreserved (المجمدة) والعذبة أثناء هم M-CSF الناجم عن التمايز ط. الضامة n ل. أظهرت هي حيدات خلال الثقافة في قوارير في 3 و 7 أيام، وفي يوم 8، بعد يوم واحد من الحصاد وreplating في لوحات ثقافة 12-جيدا. بار = 100 ميكرون وينطبق على الجميع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
كانت المقارنة من جديد مقابل حيدات cryopreserved المستخدمة لإنتاج الضامة (التكبير العالية) وحيدات مثقف كما هو موضح في الشكل رقم 1 أسطورة وهو موضح هنا في أعلى التكبير: الرقم 2. فجوات مرحلة لوسنت هي macropinosomes (السهام البيضاء). بار = 50 ميكرون وينطبق على الجميع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
فشلت Cryopreserved الضامة لإنتاج الثقافات كافية وكانت المصنفة حيدات الطازجة في قارورة ومتباينة 7 أيام مع M-CSF كما هو موضح في الشكلين 1 و 2 أعلاه: الرقم 3. ثم، تم حصاد الضامة متباينة من قوارير وcryopreserved. بعد ذلك، كانت المصنفة الضامة cryopreserved في لوحات 12-جيدا كما هو موضح في بروتوكول لالضامة غير cryopreserved ومثقف 1 يوم (اليوم 8). على النقيض من المرحلة صورة مجهرية من الثقافة 1-اليوم تبين أن عددا قليلا جدا من الضامة إرفاق التالية الحفظ بالتبريد من (قارن ليوم 8 نتائج الضامة غير cryopreserved في الشكل رقم 1 أعلاه). بار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
SS = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
وكانت المصنفة كانت حيدات Cryopreserved مناسبة لإنتاج نوع GM-CSF الضامة الوحيدات المستمدة أيضا حيدات Cryopreserved (25 × 10 6) في قارورة ومتباينة 8 أيام مع 10٪ FBS تحتوي على 50 نانوغرام / مل GM-CSF: الرقم 4. وتظهر الصورة على النقيض من المرحلة النموذجية "البيض المقلي" مورفولوجية نوع الضامة GM-CSF. بار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن توليد أنواع بلعم يعرف توضيح بعض نتائج متضاربة التي حصل عليها المحققون عند دراسة علم الأحياء البلاعم. استخدام الظروف ثقافة مختلفة وعوامل التمايز لتوليد الضامة الإنسان الأساسية يمكن أن يؤدي إلى أنواع بلعم مختلفة جدا، وهذه حقيقة قد لا يكون موضع تقدير من قبل الباحث. على سبيل المثال، الضامة تتولد في بعض الأحيان من وحيدات الإنسان استخدام أي مصل، مصل الإنسان وحده، المصل البشري تستكمل مع M-CSF، FBS وحده، أو FBS تحتوي M-CSF أو GM-CSF. كما ذكرت سابقا، وكما لاحظنا أيضا، مثقف وحيدات لمدة أسبوع دون المصل أو مع FBS دون عوامل التمايز وأضاف لا تزال قابلة للحياة 3. وكما ذكر أعلاه، مثقف وحيدات مع المصل البشري وحده أو تستكمل مع M-CSF توليد الضامة التي تظهر "البيض المقلي" التشكل سمة من حيدات متباينة مع FBS بالإضافة إلى GM-CSF. وهكذا، في ظل وجود المصل البشري M-لم يتم الحصول على السائل النخاعي نوع بلعم تظهر التشكل أكثر ممدود على الرغم من وحيدات تم متباينة مع M-CSF.
ومن المثير للاهتمام، لاحظنا أن التفريق بين حيدات مع FBS تحتوي على كل من M-CSF و GM-CSF، ويولد كل من M-CSF ممدود وGM-CSF "البيض المقلي" الظواهر المورفولوجية في نفس الثقافة. هذا يشير إلى أن القطعان الوحيدات متميزة تثير هذه الأنواع بلعم اثنين. وقد أظهرت دراسات سابقة أن M-CSF وعوامل التمايز GM-CSF تؤثر ليس فقط على التشكل من البلاعم، ولكن أيضا يؤثر على التعبير الجيني وظيفة الخلية، والتي تختلف بشكل كبير عن هذه نوعين بلعم 2-6. المناعية للCD68 علامة بلعم بالتزامن مع CD14 أن يعبر عنه الضامة نوع M-CSF و25F9 أن يعبر عنه الضامة GM-CSF يمكن استخدامها لتأكيد نوع بلعم كما هو موضح سابقا (2). هذه نوعين بلعم معبد المنعم يوسف أن تكون ذات صلة خاصة لدراسة تصلب الشرايين حيث تحدث أنواع مختلفة البلاعم في لويحات تصلب الشرايين، ويمكن أن تظهر الاختلافات في استقلاب الكوليسترول والتعبير عن وسطاء الالتهاب 2،12،13. على سبيل المثال، نوع M-CSF الضامة هي فريدة من نوعها في أن هذه الضامة الكولسترول الودائع في المصفوفة خارج الخلية عندما يتم إثراء الضامة مع الكوليسترول 12،14،15.
في بروتوكول المعروضة خلال الثقافة مع M-CSF، تمت إضافة IL-10 بشكل روتيني كما هو موضح سابقا (16). هذا خلوى يشجع على نمو وتمايز الضامة وتنتج التشكل ممدود أكثر تجانسا من الضامة. وبالإضافة إلى ذلك، IL-10 يمنع يعتمد GM-CSF البقاء على قيد الحياة الوحيدات عن طريق تثبيط الأحداث يشير الناجمة عن GM-CSF 17. ومع ذلك، يجب أن المحققين يرون أن IL-10 قد تؤثر على استجابات الخلايا الأخرى قيد الدراسة، وبالتالي، قد ترغب في حذف IL-10. قبلباستخدام بروتوكول الحالي توظيف انتشار والتفريق بين حيدات في قارورة، وبدأت الثقافات بلعم من الطلاء مباشرة حيدات elutriated في آبار الثقافة ويميزها عن 7 أيام قبل بدء التجارب. ولكن، حتى مع إضافة IL-10، بعض هذه الثقافات بلعم أظهرت أرقام صغيرة (عادة ما تكون أقل من 10٪) من الضامة "البيض المقلي" نوع GM-CSF تلويث ممدود M-CSF نوع الضامة. مع البروتوكول الحالي، لا تحدث GM-CSF تلوث نوع بلعم لأسباب غير واضحة. ومع ذلك، فإنه ليس لتضيع GM-CSF نوع بلعم حيدات السلائف أثناء التجميد، وزراعة وحيدات cryopreserved مع FBS + GM-CSF تنتج ممتازة الثقافات نوع GM-CSF (انظر الشكل 4).
بروتوكول صفها يستخدم الحفظ بالتبريد وحيدات قبل التمايز بهم في الضامة. وقد الوحيدات الحفظ بالتبريد السابقأظهرت iously لا تؤثر على وظيفة الوحيدات ويعمل عادة 18-21. في هذا الصدد، وجدنا أن الضامة التي تم إنشاؤها بواسطة بروتوكول فوق الكولسترول الودائع في الفضاء خارج الخلية على غرار ما وصفناها سابقا مع حيدات غير cryopreserved التي تم زرعها مباشرة في الضامة (12). مع الحفظ بالتبريد الوحيدات، وحيدات تتوفر لبدء التجارب، بغض النظر عن متى يمكن الحصول على حيدات من متبرع دائما. في حين أنه ليس من الضروري cryopreserve وحيدات قبل الشروع في البروتوكول، لم الحفظ بالتبريد إنتاج الثقافات بلعم أكثر تجانسا في أن جميع الضامة وأكثر انتشرت بدلا من أن كلا تقريب وتنتشر كما كان الحال عندما استخدمت حيدات جديدة لبدء الثقافات. لقد ولدت بنجاح الثقافات بلعم من وحيدات التي تم الاحتفاظ المجمدة تصل إلى 6 أشهر، (أطول فترة اختبار). من ناحية أخرى، البذر من السن الدنيا cryopreservedophages في الثقافة لم آبار للتجارب لا تنتج الثقافات بلعم كافية.
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول تضع على الفور حيدات في الفريزر بعد إضافة سلفوكسيد ثنائي ميثيل، ونقل على الفور حيدات إذابة إلى مستنبت. على الرغم من أنه من الشائع لإزالة DMSO بواسطة الطرد المركزي الخلايا المجمدة قبل أن يتم المصنف أنهم في الثقافة، لم نجد هذا كان خطوة ضرورية في ثقافة ناجحة من وحيدات. ومع ذلك، قد يحتاج الباحثون إلى القيام بذلك إذا كان تركيز DMSO المتبقية (2 ميكرولتر / مل) أعلى مما تم استخدامه في البروتوكول أعلاه. ومن المهم عدم شطف حيدات حتى 48 ساعة بعد البذر في قوارير الثقافة. خلاف ذلك، قد تفقد بعض وحيدات اعتمادا على درجة من الالتصاق على سطح الثقافة. من ناحية أخرى، وبمجرد أن حيدات تفرق في الضامة، وزيادة التصاق الضامة قد تتطلب وقتا أطول التربسين العلاج لإزالتها،أو رافع الخلايا يمكن استخدامها لتسهيل الإفراج بعد العلاج التربسين الأولية. إذا لم يكن وحيدات تتكاثر والتفريق، وهذا قد يكون عائدا لبعض الخصائص غير عادية من الجهات المانحة الوحيدات، وفقدان النشاط من M-CSF، أو بسبب الكثير من FBS المستخدمة. أيضا، من قلق ممكن عندما الثقافات لا تتطور هو تلوث الكواشف مع الذيفان الداخلي، وهو العامل الذي يحول دون انتشار بلعم 22.
التمييز بين حيدات cryopreserved في قوارير مع M-CSF يسمح التمايز كثافتها في الضامة. ثم، الضامة يمكن حصاده والمصنف في آبار الثقافة في كثافة الخلايا اللازمة لإجراء التجارب. استخدام أرقام محددة من الضامة بدلا من أرقام محددة من وحيدات لبدء الثقافات بلعم للتجارب، ينتج الثقافات بلعم فيها كثافة الخلايا المطلوبة لا يمكن أن يتحقق على نحو أكثر اتساقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
