Protocol
白细胞分离是根据人类主体的卫生机构审查委员会的国家机构认可的研究方案进行。
1.分离的单核细胞冷冻保存
- 得到单核细胞由人类供体的白细胞分离，并通过如在参考文献7,8中所述的单核细胞的连续逆流离心淘析丰富的单核细胞。得到约100×10 6淘洗细胞（约80 - 90％的单核细胞）在由制造商指定的淘析缓冲。算使用血球细胞。
- 在15ml聚丙烯管中离心的单核细胞在300 xg离心 在室温下5分钟。
- 除去上清液并轻轻悬浮随后二甲基亚砜FBS中的细胞达到90％的FBS / 10％二甲亚砜的终浓度和50×10 6个细胞/ ml。
- 将每个毫升细胞悬液ŤØ个别冷冻管。
- 放置冷冻管在细胞冷冻容器和转移至液氮冷冻管贮槽用于长期保存前转移到-80℃冷冻24小时。
2.单核细胞分化成巨噬细胞
- 通过快速转移到37℃水浴中，并在细胞悬浮液解冻约70％，然后立即除去解冻细胞的离心管。
- 后立即在室温下完全融化，转移1毫升离心管内容到50ml的37℃温热罗斯韦尔园区纪念研究所（RPMI）有2mM L-谷氨酰胺，50纳克/毫升的M-CSF，25纳克/毫升1640培养基白细胞介素-10（IL-10），和10％FBS（完全培养基）。
- 转印25毫升单核细胞悬浮液到每两个75cm 2的塑料细胞培养瓶中的。
- 孵育培养物中，用5％ 二氧化碳 / 95％空气的37℃的细胞培养培养箱中48小时。
- 冲洗立方米ltures 3次用10ml的RPMI 1640培养基（预热至37℃），轻轻除去培养基，以避免撞出任何松散附着的细胞。
- 后续漂洗，加入新鲜完全培养基，培养基改变每2天，直到单核细胞分化，增殖，足以成为融合。这需要大约一个星期的文化。
3.收获巨噬细胞实验启动
- 用10毫升漂洗分化的巨噬细胞在烧瓶3次预热37℃的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水不含Ca 2+和Mg 2+加入10ml预热的37℃的0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液之前。
- 此时的巨噬细胞的约90％应具有圆形和拆卸15分钟 - 在10细胞培养孵化地方烧瓶中。由烧瓶镜检验证这一点。
- 加入10 mL RMPI 1640培养基含有10％FBS送顶部胰蛋白酶。
- 从烧瓶中转移巨噬细胞悬浮到50ml的聚丙烯管中，离心300×g离心5分钟，并弃去上清液。
- 轻轻重悬巨噬细胞在1ml完全培养基。
- 混合10微升巨噬细胞悬浮液与10微升锥虫蓝溶液，并确定使用血球巨噬细胞数量和生存力（典型地> 95％）。
- 根据细胞计数（通常为约15 - 18×10 5个巨噬细胞），加入以达到所需接种细胞密度额外的完全培养基。注意：在每一个12孔板的孔1.5ml介质1×10 5个巨噬细胞将产生一个近汇合培养。
- 以下播种，过夜孵育的巨噬细胞中，用5％ 二氧化碳 / 95％空气的37℃的细胞培养孵化器，以允许细胞附着。然后，开始所需的实验。
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Representative Results
与台盼蓝染色9确定的新鲜或冷冻保存的单核细胞的存活力大于95％。 图 1和图2在较低和较高的倍率进行比较，分别新鲜和冷冻（ 即冷冻）的单核细胞分化的进展成巨噬细胞。注意，新鲜比较了冷冻保存的单核细胞显示分化的单核细胞不传播，但仍然圆形的亚群。相朗讯液泡发生在这两个条件下，单核细胞衍生的巨噬细胞。如前所述-10,11-这些液泡代表M-CSF型巨噬细胞的macropinosomes特性。
从它们从单核细胞分化的烧瓶其收获后冷冻保存的巨噬细胞不产生成功的巨噬细胞培养物（ 用于制造M-CSF型巨噬细胞的上述协议这样做而不污染的GM-CSF型巨噬细胞的存在时，培养物直接从未经其冷冻保存和分化在烧瓶M-CSF型巨噬细胞单核细胞建立的，有时会发生。然而，单核细胞冻存与FBS分化+ GM-CSF产生卓越的GM-CSF型文化（ 图4）。 
图1：新鲜与冷冻保存的单核细胞比较用于产生巨噬细胞（低倍率）冻存（冷冻）和新鲜的单核细胞的相衬显微图像的M-CSF诱导分化我期间。 n要巨噬细胞。示出的是在第3和7天培养瓶中培养过程中的单核细胞，并在第8天，其收获和replating到12孔培养板后一天。酒吧= 100微米，适用于所有。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图2：新鲜与用于产生巨噬细胞（高倍率）冷冻保存的单核细胞单核细胞的比较中培养如在图1说明中描述并在更高的放大倍数在这里显示。相透亮空泡是macropinosomes（白色箭头）。酒吧= 50微米，适用于所有。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图3：冷冻保存的巨噬细胞不能产生足够的培养新鲜的单核细胞接种到烧瓶中，并分化7天M-CSF如上面图1和2。然后，分化的巨噬细胞从培养瓶中并冷藏保存收获。接着，作为用于非冻存巨噬细胞和1的影响一天（8天）在协议中描述的冷冻保存的巨噬细胞接种到12孔板中。 1天培养的相差显微镜图像示出了很少的巨噬细胞的附着以下的冷冻保存（比较每天8结果非冷藏的巨噬细胞在上面的图1）。酒吧= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：冷冻保存的单核细胞也适用于生产的GM-CSF型单核细胞衍生的巨噬细胞冻存的单核细胞（25×10 6）接种到烧瓶中和差异8天用 含有50纳克/ ml的GM-CSF的10％FBS的。相衬图像显示GM-CSF型巨噬细胞的典型的“炒鸡蛋”的形态。酒吧= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
定义生成巨噬细胞类型可以澄清一些研究巨噬细胞生物学当调查员获得的结果相互矛盾的。使用各种培养条件和分化因子，以产生初级人类巨噬细胞可以导致非常不同的巨噬细胞的类型，可能无法由研究人员可以理解一个事实。例如，巨噬细胞有时从人单核细胞用无血清，单独的人血清，人血清补充有M-CSF，FBS单独，或含M-CSF或GM-CSF的FBS的生成。如先前报道和如我们还观察到，单核细胞为一个星期培养无血清或FBS的无添加分化因子不保持存活3。如上所述，单核细胞与人血清培养单独或补充有M-CSF产生的巨噬细胞，显示与FBS加GM-CSF分化的单核细胞的“煎鸡蛋”的形态特征。因此，在人血清的M-的存在即使单核细胞已分化与M-CSF不能得到表示多个细长形态CSF的类型的巨噬细胞。
有趣的是，我们已观察到，用含有M-CSF和GM-CSF，同时产生M-CSF细长和GM-CSF在相同的培养“煎鸡蛋”形态学表型的FBS单核细胞的分化。这表明不同的单核细胞亚群产生这两种巨噬细胞类型。以前的研究已经表明，M-CSF和GM-CSF分化因子不仅影响巨噬细胞的形态，而且也影响基因表达和细胞的功能，这是这两个细胞巨噬细胞类型2-6基本上不同。免疫染色在与由受GM-CSF的巨噬细胞表达M-CSF型巨噬细胞和25F9表达CD14结合巨噬细胞标记物CD68可用于确认巨噬细胞类型如先前2所示。这两个巨噬细胞的种类数mAY是动脉粥样硬化，其中不同类型的巨噬细胞在发生粥样硬化斑块，并能显示胆固醇代谢和炎症介质2,12,13的表达差异研究尤为重要。例如，当巨噬细胞与胆固醇12,14,15富含M-CSF型巨噬细胞是在这些巨噬细胞存胆固醇到细胞外基质独特。
中提出，与M-CSF培养过程中协议，IL-10已被常规地如先前16描述的加入。该细胞因子促进巨噬细胞的生长和分化，并产生的巨噬细胞的更均匀的细长的形态。此外，IL-10通过抑制由GM-CSF 17感应的信号事件抑制GM-CSF依赖性单核细胞的存活。然而，调查人员应该考虑到IL-10可能会影响正在研究其他细胞的反应，因此，不妨忽略IL-10。之前使用采用扩散和在一烧瓶中的单核细胞的分化当前协议，巨噬细胞的培养物通过直接电镀淘析的单核细胞进入培养孔和区分它们之前发起实验7天启动。然而，即使在加入的IL-10的，其中一些巨噬细胞培养物的结果显示“煎鸡蛋”GM-CSF型巨噬细胞的少量（通常小于10％）的污染细长M-CSF型巨噬细胞。随着当前协议，GM-CSF型巨噬细胞的污染不会对不明确的原因而发生。然而，这不是因为GM-CSF细胞巨噬细胞类型的前体的单核细胞被冷冻过程中丢失，与FBS + GM-CSF的产生优良的GM-CSF型培养物（参见图4）培养所述冷冻保存的单核细胞。
所描述的协议利用单核细胞冷冻保存它们分化成巨噬细胞之前。单核细胞冻存一直上一页iously所示不影响单核细胞的功能和通常采用18-21。在这方面，我们已经发现，通过上述存款胆固醇协议生成到类似于我们已经与该直接培养成巨噬细胞的12个非冷冻保存的单核细胞先前所描述的外空间的巨噬细胞。单核细胞冷冻保存，单核细胞总是可用的启动实验，独立的时候可以从捐赠中获得的单核细胞。而它与协议继续之前冷冻保存的单核细胞不是必须的，冻存确实产生更均匀的巨噬细胞培养在所有的巨噬细胞更传播而不是两个圆形和传播因为是当新鲜的单核细胞用于启动培养的情况。我们已经成功地产生的巨噬细胞培养物从该被冷冻保存长达6个月，（测试的最长时间）的单核细胞。在另一方面，冻存MACR播种ophages成培养实验井没有产生足够的巨噬细胞培养物。
在协议中的关键步骤包括立即将单核细胞进入冷冻以下加入二甲基亚砜，立即解冻单核细胞转移至培养基中。虽然是常见的离心冷冻细胞以去除DMSO他们被接种到培养前，我们没有发现这是在单核细胞培养成功的一个必要步骤。然而，调查可能需要做，如果残留的DMSO（2微升/毫升）的浓度比在上述协议中使用更高。不冲洗的单核细胞，直到后48小时其在培养瓶中播种是重要的。否则，某些单核细胞可以根据它们在培养表面粘附的程度会丢失。另一方面，一旦单核细胞分化成巨噬细胞，增加了巨噬细胞的粘附，可能需要更长的胰蛋白酶处理以除去它们，或细胞升降机可以用来促进初始胰蛋白酶处理后释放。如果单核细胞不增殖和分化，这可能是由于单核细胞供体的一些不寻常的特点，M-CSF的活性的损失，或者由于所使用的大量的FBS。此外，当文化不发展可能值得关注的是内毒素的试剂的污染，抑制巨噬细胞增殖22代理人。
与M-CSF瓶区分单核细胞冻存他们可以批量分化成巨噬细胞。然后，巨噬细胞可被收获并在需要的细胞密度接种到培养孔用于进行实验。利用巨噬细胞的限定数量，而不是单核细胞的定义号码发起的巨噬细胞培养物的实验中，产生了巨噬细胞培养，其中所需的细胞密度可以更一致地实现。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
