Protocol
Leucaferesi è stata effettuata sotto protocollo di ricerca di un soggetto umano approvato da un National Institutes of Health revisione istituzionale bordo.
1. Isolamento e Crioconservazione dei monociti
- Ottenere cellule mononucleate da leucaferesi di donatori umani, e arricchire monociti dal continuo controcorrente centrifugazione dilavamento delle cellule mononucleari come descritto nei riferimenti 7,8. Ottenere circa 100 x 10 6 cellule elutriated (circa 80 - 90% monociti) in tampone elutriation specificato dal costruttore. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- monociti centrifuga in un tubo da 15 ml in polipropilene a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere le cellule in FBS seguite da dimetilsolfossido per ottenere una concentrazione finale di 90% FBS / 10% dimetilsolfossido e 50 x 10 6 cellule / ml.
- Aggiungere ogni ml di sospensione cellulare to un individuo esageratamente.
- Mettere i cryovials in un contenitore di congelamento delle cellule e trasferire ad un -80 ° C freezer per 24 ore prima del trasferimento a un serbatoio di stoccaggio esageratamente azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
2. La differenziazione dei monociti in macrofagi
- Scongelare un esageratamente di cellule trasferendo rapidamente a bagnomaria C 37 ° e poi subito la rimozione quando la sospensione cellulare è stato scongelato circa il 70%.
- Subito dopo completa scongelamento a temperatura ambiente, trasferire i 1 ml contenuti esageratamente in 50 ml di 37 ° C riscaldata Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 2 mM L-glutammina, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleuchina-10 (IL-10), e del 10% FBS (mezzo completo).
- Trasferimento 25 ml di sospensione dei monociti in ciascuno dei due 75 cm 2 palloni di plastica di coltura cellulare.
- Incubare culture in un 37 ° cultura incubatore di cellule C con 5% di CO 2/95% di aria per 48 ore.
- Sciacquare il cultures 3 volte con 10 ml di RPMI 1640 medium (pre-riscaldato a 37 ° C), rimuovere delicatamente il terreno di coltura per evitare di spostare tutte le cellule debolmente collegate.
- Dopo il risciacquo, aggiungere mezzo fresco completa, cambiando media ogni 2 giorni fino monociti differenziano e proliferare in misura sufficiente a diventare confluenti. Ciò richiede circa una settimana di coltura.
3. Raccolta macrofagi di avviare esperimenti
- Risciacquare macrofagi differenziati in boccetta 3 volte con 10 ml di pre-riscaldato soluzione salina tamponata con fosfato di 37 ° C Dulbecco senza Ca 2 + e Mg 2+ prima di aggiungere 10 ml preriscaldata acido etilendiamminotetraacetico tripsina-soluzione 37 ° C 0,25% (EDTA).
- Posto pallone in coltura incubatore cellulare per 10 - 15 minuti momento in cui circa il 90% dei macrofagi dovuto arrotondati e distaccato. Verificare questo esame microscopico del pallone.
- Aggiungere 10 ml di RMPI 1640 medium contenente il 10% FBS per stripsinizzazione superiore.
- Trasferire la sospensione cellulare macrofagi dal pallone in un tubo da 50 ml polipropilene, centrifugare 300 xg per 5 min, e scartare il surnatante.
- Risospendere delicatamente i macrofagi in 1 ml di terreno completo.
- Mescolare 10 ml di sospensione cellulare macrofagi con 10 microlitri soluzione Trypan Blue e determinare il numero di cellule macrofagi e vitalità (tipicamente> 95%) con un emocitometro.
- Sulla base del numero di celle (di solito circa 15 - 18 x 10 5 macrofagi), aggiungere ulteriore mezzo completo per ottenere la densità cellulare di semina desiderata. Nota: 1 x 10 5 macrofagi in 1,5 ml di mezzo per pozzetto di una piastra 12 pozzetti produrrà una cultura quasi confluenti.
- Dopo la semina, incubare macrofagi durante la notte in un 37 ° C incubatore di coltura cellulare con il 5% di CO 2/95% di aria per permettere l'adesione cellulare. Poi, iniziare gli esperimenti desiderati.
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Representative Results
La vitalità dei monociti freschi o crioconservati era superiore al 95%, come determinato con Trypan Blue colorazione 9. Figura 1 e Figura 2 confronta ad ingrandimenti inferiori e superiori, rispettivamente, l'andamento di fresco e crioconservato (cioè, congelato) differenziazione dei monociti in macrofagi. Si noti che il fresco confrontato con monociti crioconservati mostrano una sottopopolazione di differenziare i monociti che non si diffondono, ma restano arrotondato. vacuoli Phase-Lucent verificano nei macrofagi derivate da monociti in entrambe le condizioni. Questi vacuoli rappresentano caratteristica macropinosomes di tipo macrofagi M-CSF come descritto in precedenza 10,11.
macrofagi Cryopreserving dopo la loro raccolta dai contenitori in cui sono stati differenziati da monociti non hanno prodotto culture macrofagi di successo ( Il protocollo di cui sopra per la produzione di tipo M-CSF macrofagi fa senza la presenza di contaminanti di tipo GM-CSF macrofagi che a volte si verifica quando le culture sono stabiliti direttamente da monociti senza il loro crioconservazione e la differenziazione di tipo M-CSF macrofagi in fiaschi. Tuttavia, monociti crioconservati differenziati con FBS + GM-CSF produce eccellenti culture di tipo GM-CSF (Figura 4). 
Figura 1: Confronto di fresco contro monociti crioconservati utilizzato per la produzione di macrofagi (basso ingrandimento) a contrasto di fase immagini microscopiche di monociti crioconservati (congelati) e fresche durante la loro M-CSF indotta differenziazione i. macrofagi nto. vengono riportati i monociti durante la coltura in fiasche a 3 e 7 giorni, e il giorno 8, un giorno dopo la loro raccolta e replating in piastre di coltura da 12 pozzetti. Bar = 100 micron e si applica a tutti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 2:. Confronto di fresco contro monociti crioconservati utilizzati per la produzione di macrofagi (alto ingrandimento) I monociti sono stati coltivati come descritto nella Figura 1 leggenda e mostrato qui a maggiore ingrandimento. vacuoli fase-Lucent sono macropinosomes (frecce bianche). Bar = 50 micron e si applica a tutti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 3: crioconservati macrofagi non riescono a produrre colture adeguate monociti fresche sono state seminate in un pallone e differenziati 7 giorni con M-CSF come mostrato nelle figure 1 e 2.. Poi, i macrofagi differenziati sono state raccolte dai fiaschi e crioconservati. Successivamente, i macrofagi crioconservati sono state seminate in piastre da 12 pozzetti come descritto nel protocollo per macrofagi non crioconservati e coltivate 1 giorno (giorno 8). A contrasto di fase immagine microscopica della cultura 1 giorno dimostra che ben pochi dei macrofagi attach dopo la loro crioconservazione (confrontare in giorno 8 risultati per i macrofagi non crioconservati in figura 1 di cui sopra). Bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Monociti crioconservati erano anche adatto a produrre tipo GM-CSF macrofagi derivate da monociti monociti crioconservati (25 x 10 6) sono state seminate in un pallone e differenziati 8 giorni con 10% FBS contenente 50 ng / ml di GM-CSF. immagini a contrasto di fase mostra la morfologia tipica "uovo fritto" di tipo macrofagi GM-CSF. Bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Generazione di tipi definiti macrofagi può chiarire alcuni dei risultati contrastanti ottenuti dai ricercatori nello studio della biologia dei macrofagi. L'uso di varie condizioni di coltura e fattori di differenziazione per generare macrofagi umani primari possono portare a tipi molto diversi macrofagi, un fatto che non può essere apprezzata dal ricercatore. Ad esempio, i macrofagi a volte sono generate da monociti umani non usando il siero, siero umano da solo, siero umano integrato con M-CSF, FBS da solo, o FBS contenenti M-CSF o GM-CSF. Come riportato in precedenza e come abbiamo anche osservato, monociti in coltura per una settimana senza siero o con FBS senza fattori di differenziazione aggiunti non rimanere vitale 3. Come accennato in precedenza, monociti in coltura con siero umano da solo o integrato con M-CSF generare macrofagi che mostrano il "uovo fritto" morfologia caratteristica dei monociti differenziati con FBS inclusa GM-CSF. Pertanto, in presenza di siero umano M-Tipo CSF macrofagi che mostra una morfologia più allungata, non si ottiene anche se monociti sono stati differenziati con M-CSF.
È interessante notare, abbiamo osservato che la differenziazione dei monociti con FBS contenenti sia M-CSF e GM-CSF, genera sia l'M-CSF allungata e GM-CSF "uovo fritto" fenotipi morfologici nella stessa cultura. Questo suggerisce che distinte sottopopolazioni monociti danno origine a questi due tipi di macrofagi. Studi precedenti hanno dimostrato che M-CSF e fattori di differenziazione GM-CSF influenzano non solo la morfologia del macrofago, ma anche influenzare l'espressione genica e la funzione delle cellule, che è sostanzialmente differente per questi due tipi macrofagi 2-6. Immunocolorazione per il CD68 marcatore macrofagi in collaborazione con CD14 che si esprime per tipo macrofagi M-CSF e 25F9 che si esprime da parte dei macrofagi GM-CSF può essere utilizzata per confermare il tipo di macrofagi, come indicato in precedenza 2. Questi due tipi di macrofagi may essere particolarmente rilevante per lo studio dell'aterosclerosi, dove diversi tipi di macrofagi si verificano in placche aterosclerotiche e possono mostrare differenze nel metabolismo del colesterolo e di espressione dei mediatori dell'infiammazione 2,12,13. Ad esempio, digitare M-CSF macrofagi sono unici in quanto questi macrofagi deposito di colesterolo nella matrice extracellulare, quando i macrofagi sono arricchiti con il colesterolo 12,14,15.
Nel protocollo presentato, durante la coltura con M-CSF, IL-10 è stato aggiunto ordinariamente come descritto in precedenza 16. Questa citochina promuove la crescita e la differenziazione dei macrofagi e produce una morfologia allungata più omogenea dei macrofagi. Inoltre, IL-10 inibisce la sopravvivenza monociti GM-CSF-dipendente inibendo gli eventi di segnalazione indotti da GM-CSF 17. Tuttavia, gli investigatori dovrebbero considerare che l'IL-10 può influenzare le altre risposte delle cellule in fase di studio, e di conseguenza, potrebbe voler omettere IL-10. Primautilizzando il protocollo corrente utilizzando la proliferazione e la differenziazione dei monociti in un pallone, culture macrofagi sono state avviate dalla placcatura direttamente monociti elutriated nei pozzetti cultura e differenziandole per 7 giorni prima di iniziare gli esperimenti. Tuttavia, anche con l'aggiunta di IL-10, alcune di queste culture di macrofagi mostrato piccole quantità (di solito meno di 10%) di "uovo fritto" tipo GM-CSF macrofagi contaminanti le allungati M-CSF tipo macrofagi. Con l'attuale protocollo, GM-CSF contaminazione tipo di macrofagi non si verifica per ragioni che non sono chiare. Tuttavia, non è perché GM-CSF di tipo macrofago monociti precursori sono persi durante il congelamento, come coltura i monociti crioconservati con FBS + GM-CSF produce eccellenti culture di tipo GM-CSF (vedere Figura 4).
Il protocollo descritto utilizza la crioconservazione dei monociti prima della loro differenziazione in macrofagi. Monociti crioconservazione è stato previously dimostrato di non influire sulla funzione dei monociti e viene comunemente impiegato 18-21. A questo proposito, abbiamo trovato che i macrofagi generati dal protocollo sopra colesterolo deposito nello spazio extracellulare simile a quanto descritto in precedenza con monociti non crioconservati che sono state coltivate direttamente in macrofagi 12. Con monociti crioconservazione, monociti sono sempre disponibili per avviare esperimenti indipendenti di quando i monociti possono essere ottenute da un donatore. Anche se non è essenziale per crioconservare i monociti prima di procedere con il protocollo, la crioconservazione ha prodotto culture macrofagi più omogenee in quanto tutti i macrofagi erano più diffuso, piuttosto che essere sia arrotondata e diffondere come era il caso in cui monociti freschi sono stati usati per avviare culture. Abbiamo generato con successo culture macrofagi da monociti che sono stati mantenuti congelati fino a 6 mesi, (il più lungo tempo testato). D'altra parte, la semina di MACR crioconservatiophages nella cultura pozzi per gli esperimenti non hanno prodotto adeguate culture macrofagi.
passaggi critici nel protocollo comprendono immediatamente mettendo monociti nel congelatore in seguito all'aggiunta di dimetilsolfossido, e subito il trasferimento di monociti scongelati al mezzo di coltura. Anche se è comune per rimuovere DMSO mediante centrifugazione cellule congelate prima di essere seminate nella cultura, non abbiamo trovato questo era un passo necessario nella cultura di successo dei monociti. Tuttavia, gli investigatori possono avere bisogno di fare questo se la concentrazione di DMSO residua (2 ml / ml) è superiore a quello che è stato utilizzato nel protocollo di cui sopra. E 'importante non lavare i monociti fino a 48 ore dopo la loro semina in fiasche di coltura. Altrimenti, alcuni monociti possono essere persi a seconda del loro grado di adesione alla superficie cultura. D'altra parte, una volta che i monociti differenziano in macrofagi, aumentata adesione dei macrofagi può richiedere più tripsina trattamento per rimuoverli,o un sollevatore cella può essere impiegato per facilitare stampa dopo il trattamento iniziale tripsina. Se monociti non proliferano e si differenziano, questo potrebbe essere causa di alcuni insoliti caratteristiche del donatore monociti, perdita di attività di M-CSF, o per il lotto di FBS utilizzato. Inoltre, di possibile preoccupazione quando le culture non si sviluppa è la contaminazione dei reagenti con endotossine, un agente che inibisce la proliferazione dei macrofagi 22.
Differenziare i monociti crioconservati in boccette con M-CSF permette loro differenziazione di massa in macrofagi. Poi, i macrofagi possono essere raccolte e seminate in pozzetti di coltura a densità di cellule necessarie per lo svolgimento di esperimenti. L'uso dei numeri definiti di macrofagi piuttosto che numeri definite di monociti di avviare colture di macrofagi per esperimenti, produce colture di macrofagi in cui la densità cellulare desiderato può essere raggiunto più coerente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
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