Protocol
白血球搬出は、保健機関審査委員会の国立研究所によって承認されたヒト被験体の研究プロトコルの下で行いました。
1.単離と単球の凍結保存
- 人間のドナーの白血球搬出によって単核細胞を得る、および参考文献7,8に記載されているように、単核細胞の連続向流遠心水簸によって単球を豊かにします。製造業者が指定する水簸バッファに- （90％単球約80）約100×10 6簸細胞を得ます。血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 300×gで15ミリリットルポリプロピレンチューブで遠心分離した単球 室温で5分間。
- 上清を除去し、穏やかに90％FBS / 10％ジメチルスルホキシド、50×10 6細胞/ mlの最終濃度を達成するようにジメチルスルホキシド、続いFBSで細胞を再懸濁します。
- 細胞懸濁液tの各ミリリットルを加えます個々のクライオバイアルO。
- セル冷凍コンテナ内のクライオバイアルを置き、に転送-80℃のフリーザー24時間長期保存のために液体窒素クライオバイアル貯蔵タンクに移す前に。
単球からマクロファージへの2分化
- すぐに37℃の水浴に移し、細胞懸濁液は、約70％を解凍したときにすぐに除去することによって細胞のクライオバイアルを解凍します。
- すぐに室温で完全に融解時、37の50ミリリットルに1ミリリットルをクライオバイアル内容を転送°Cは、2 mMのL-グルタミン、50 ngの/ mlのM-CSF、25 ngの/ mlのロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地を温めインターロイキン10（IL-10）、及び10％FBS（完全培地）。
- 移送2 75cm 2のプラスチック製の細胞培養フラスコのそれぞれへの単球の懸濁液を25ml。
- 48時間、5％CO 2/95％空気で37℃で細胞培養インキュベーター中で培養物をインキュベートします。
- 立方をすすぎますRPMI 1640培地を穏やかに任意の緩く付着した細胞を取り除く回避するために、培養培地を除去し、（37℃に予め温めておいた）mlの10でltures 3回。
- 単球が分化し、コンフルエントになるまで十分に増殖するまで2日毎に培地を交換し、新鮮な完全培地を追加し、すすぎに続いて。これは文化の約1週間が必要です。
3.収穫マクロファージ実験を開始します
- 10mlのフラスコ中で3回分化マクロファージリンス予め温めた37℃の0.25％トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液10 mlで添加する前に、Ca 2+及びMg 2+ を含まない37℃のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水を予熱しました。
- マクロファージの約90％は四捨五入と切り離されている必要があり、その時点で15分 - 10のための細胞培養インキュベーターにフラスコを置きます。フラスコの顕微鏡検査することによってこれを確認してください。
- 10％FBSを含むRMPI 1640培地10 mlのSへの追加トップトリプシン処理。
- 5分間の遠心分離器、50ミリリットルのポリプロピレンチューブにフラスコから300×gでのマクロファージ細胞懸濁液を移し、上清を捨てます。
- 静かに完全培地の1ミリリットル中にマクロファージを再懸濁します。
- 10μlのトリパンブルー溶液を用いてマクロファージ細胞懸濁液10μlを混合し、血球計数器を使用して、マクロファージ細胞数および生存率（典型的には> 95％）を決定します。
- 細胞数に基づいて、（通常は約15から18×10 5マクロファージ）、目的の播種細胞密度を達成するために追加の完全培地を追加します。注：12ウェルプレートのウェル当たり1.5ミリリットル培地中で1×10 5マクロファージを、近コンフルエント文化を生成します。
- 播種後、細胞の付着を可能にするために、5％CO 2/95％空気で37℃で細胞培養インキュベーターで一晩マクロファージインキュベートします。次に、目的の実験を開始します。
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Representative Results
トリパンブルー染色9で決定されるような新鮮または凍結保存した単球の生存率は95％以上であった。 図 1および図2は 、それぞれ、より低いおよびより高い倍率でマクロファージへ新鮮で凍結保存した（ すなわち 、冷凍）単球分化の進行状況を比較します。凍結保存した単球と比較して、新鮮なが広がっていないが、丸みを帯びたまま、単球を区別するの亜集団を示していることに注意してください。フェーズ・ルーセント空胞は、両方の条件で単球由来のマクロファージで起こります。以前に10,11を説明したように、これらの小胞は、M-CSF型マクロファージのマクロピノソーム特性を表します。
彼らは、単球から分化されたフラスコからの彼らの収穫後の凍結保存マクロファージは（成功したマクロファージ培養物を生成しませんでした M-CSF型マクロファージを生成するための上記の手順は、培養物をフラスコ中でM-CSF型マクロファージへの凍結保存し、分化することなく単球から直接確立されるときに生じる場合があるGM-CSF型マクロファージ汚染が存在しないようにします。しかし、凍結保存単球は、優れたGM-CSF型培養物（ 図4）を生成FBS + GM-CSFを用いて分化しました。 
図1：凍結保存された単球対新鮮の比較は、マクロファージ（低倍率）を生成するために使用される凍結保存し（冷凍）、新鮮な単球の位相差顕微鏡画像を自分のM-CSF誘導分化の私の間に。 Ntoのマクロファージ。示す3および7日目のフラスコ中で培養中の単球、および8日目に、12ウェル培養プレートへのそれらの収穫と再播種後1日です。 =100μmのバーとすべてに適用されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図2： 図1の説明に記載し、より高い倍率でここに示されているように（高倍率）マクロファージを生成するために使用される凍結保存単球に対する新鮮な単球の比較は、培養しました。フェーズ・ルーセント空胞はマクロピノソーム（白矢印）です。 =50μmで、すべてに適用されるバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図3：凍結保存されたマクロファージは、適切な培養物を生成することができない新鮮単球はM-CSFとフラスコと分化7日に播種し、上記の図1及び図 2に示すように 。次いで、分化したマクロファージは、フラスコおよび凍結保存から回収しました。非凍結保存マクロファージ培養1日（8日目）のプロトコルに記載のように、次の、凍結保存したマクロファージを12ウェルプレートに播種しました。 1日培養の位相差顕微鏡像は、マクロファージの非常に少ないが（ 図1の非凍結保存されたマクロファージのための8の結果、上記の日に比較して）自分の凍結保存を次の接続することを示しています。バー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：凍結保存単球もまた、GM-CSF型単球由来マクロファージを生成するのに適した凍結保存単球（25×10 6）をフラスコに播種し、50 ngの/ mlのGM-CSFを含む10％FBSを8日間分化させました。位相差画像は、GM-CSF型マクロファージの典型的な「目玉焼き」形態を示します。バー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
定義されたマクロファージの種類を生成することは、マクロファージの生物学を研究する研究者によって得られた相反する結果のいくつかを明確にすることができます。初代ヒトマクロファージを生成するために、さまざまな培養条件および分化因子の使用は、非常に異なるマクロファージタイプに研究者によって理解されなくてもよいことを導くことができます。例えば、マクロファージは、時には何血清、単独でヒト血清、FBS単独でM-CSF、またはM-CSFまたはGM-CSFを含むFBSを補充したヒト血清を使用していないヒト単球から生成されます。以前、我々はまた、観察しているように報告したように、単球が追加された分化せずに、無血清またはFBSで一週間培養した要因は、生存3残りません。上記のように、単球を単独で、ヒト血清とともに培養またはFBSを加えたGM-CSFを用いて分化した単球の「目玉焼き」形態の特性を示すマクロファージを生成するM-CSFを補充しました。このように、ヒト血清M-の存在下で、単球は、M-CSFと区別されているにもかかわらず、より細長い形態を示すCSF型マクロファージが得られません。
興味深いことに、我々が観察したことと同じ文化の中で形態学的表現型「卵を揚げ「M-CSFおよびGM-CSF、生成両方の細長いM-CSFおよびGM-CSFの両方を含むFBSと単球の分化。これは、別個の単球の亜集団は、これら2つのタイプのマクロファージを生じることを示唆しています。以前の研究では、M-CSFおよびGM-CSFの分化因子は、マクロファージだけでなく形態に影響を与えるだけでなく、遺伝子発現およびこれらの二つのマクロファージのタイプ2-6のために実質的に異なる細胞機能に影響を及ぼすことが示されています。 GM-CSFはマクロファージによって発現されるM-CSF型マクロファージおよび25F9によって表現されるCD14と組み合わせてマクロファージマーカーCD68の免疫染色は、以前2に示すように、マクロファージの種類を確認することができます。これら二つのマクロファージ種類メートルAY異なるマクロファージタイプはアテローム性動脈硬化プラークで発生し、コレステロール代謝および炎症メディエーター2,12,13の発現の差を表示することができ、アテローム性動脈硬化症の研究に特に関連があります。マクロファージはコレステロール12,14,15で富化されている場合例えば、M-CSFの型マクロファージは、細胞外マトリックスへの、これらのマクロファージ預金コレステロールでユニークです。
先に説明したように16、M-CSFと培養中、提示プロトコルでは、IL-10は、定期的に追加されています。このサイトカインは、マクロファージの増殖および分化を促進し、マクロファージのより均一な細長い形態を生成します。加えて、IL-10、GM-CSF 17により誘導されるシグナル伝達事象を阻害することによって、GM-CSF依存性の単球の生存を阻害します。しかし、研究者らは、IL-10が研究中の他の細胞応答に影響を与える可能性があり、したがって、IL-10を省略することを望む可能性があることを考慮する必要があります。前増殖フラスコ内の単球の分化を用いる現在のプロトコルを使用して、マクロファージ培養物を直接培養ウェルに水簸単球をプレーティングし、実験を開始する前の7日のためにそれらを区別することによって開始しました。しかし、IL-10を添加して、これらのマクロファージの培養物の一部は、細長いM-CSF型マクロファージの混入 "目玉焼き" GM-CSF型マクロファージの少数（通常10％未満）を示しました。現在のプロトコルでは、GM-CSF型マクロファージ汚染は明らかではない理由で発生しません。 GM-CSFマクロファージ系前駆単球をGM-CSFは、優れたGM-CSF型培養を（ 図4参照）を生成+ FBSで凍結保存した単球を培養として、凍結中に失われているのでしかし、そうではありません。
記載されているプロトコルは、マクロファージへの分化前単球の凍結保存を利用しています。単球の凍結保存は、PREVされましたiously単球機能に影響を及ぼさないことが示さ、一般に18〜21を採用しています。この点で、我々が発見した、我々は、マクロファージ12に直接培養した非凍結保存単球で前に説明したものと同様の細胞外空間にデポジットコレステロール上記のプロトコルによって生成されたマクロファージ。単球の凍結保存では、単球が常に単球がドナーから得ることができたときの独立した実験を開始するために利用可能です。それはプロトコルに進む前に、単球を凍結保存することは必須ではないが、凍結保存は、その中でより均一なマクロファージ培養物を生産なかったすべてのマクロファージは、むしろ新鮮な単球を培養を開始するために使用された場合のように丸みを帯びたと拡散の両方であることよりも広がりました。我々は成功し、6ヶ月、（試験した最長時間）まで凍結保存した単球からマクロファージの文化を生成しています。凍結保存しMACRの一方、播種実験のための培養ウェルにophagesは、十分なマクロファージ培養物を生成しませんでした。
プロトコルにおける重要なステップは、すぐにジメチルスルホキシドを添加した後、冷凍庫への単球を配置し、直ちに培養培地に解凍した単球を転送含まれています。彼らが文化に播種される前に凍結した細胞を遠心分離することにより、DMSOを除去することが一般的であるが、我々はこれが単球の成功文化の中で必要なステップでした見つけることができませんでした。しかし、研究者らは、残留DMSO（2μL/ミリリットル）の濃度は、上記のプロトコルで使用されていたものよりも高い場合には、これを行う必要があるかもしれません。培養フラスコ中で、それらの播種後48時間までの単球を洗浄しないことが重要です。そうでなければ、いくつかの単球を培養表面への接着の程度に依存して失われることがあります。単球はマクロファージに分化した後一方、マクロファージの接着の増大は、それらを削除するには長いトリプシン処理を必要とするかもしれません、または細胞リフター初期トリプシン処理後の放出を促進するために使用することができます。単球が増殖し、分化しない場合、これは、単球ドナーのいくつかの珍しい特徴、M-CSFの活性の損失、または、使用されるFBSの多くである可能性があります。また、文化が発達しない可能性懸念のエンドトキシンを有する試薬の汚染、マクロファージ増殖22を阻害する薬剤です。
M-CSFとフラスコ内で凍結保存した単球を区別することは、マクロファージへのそれらのバルクの分化を可能にします。次いで、マクロファージを採取し、実験を行うために必要な細胞密度で培養ウェルに播種することができます。実験のためにマクロファージ培養を開始するために、マクロファージの定義された数ではなく、単球の定義された番号の使用は、所望の細胞密度がより一貫して達成することができるマクロファージ培養物が得られます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
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