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Immunology and Infection

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Published: June 30, 2016 doi: 10.3791/54244

Protocol

Leucaférese foi realizado em protocolo de pesquisa de um sujeito humano aprovado por um National Institutes of Health conselho de revisão institucional.

1. Isolamento e criopreservação de monócitos

  1. Obtenção de células mononucleares por leucaferese de dadores humanos, monócitos e enriquecer por contínua contra-fluxo centrifugação elutriação de células mononucleares, tal como descrito nas referências 7,8. Obter aproximadamente 100 x 10 6 células elutriados (aproximadamente 80 - 90% de monócitos) em tampão de elutriação especificado pelo fabricante. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
  2. monócitos de centrifugação em um tubo de 15 ml de polipropileno a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender as células suavemente em FBS, seguido de sulfóxido de dimetilo para alcançar uma concentração final de 90% de FBS / 10% de sulfóxido de dimetilo e 50 x 10 6 células / ml.
  4. Adicionar cada ml de suspensão de células TO criotubo um indivíduo.
  5. Coloque as criotubos num recipiente de congelação de células e transferir para um congelador de -80 ° C durante 24 h antes de transferir para um tanque de armazenamento de azoto líquido criotubo para armazenamento a longo prazo.

2. Diferenciação de monócitos em macrófagos

  1. Descongelar um criotubo de células transferindo rapidamente a um banho de água a 37 ° C e, em seguida, imediatamente a remoção quando a suspensão de células foi descongelada cerca de 70%.
  2. Imediatamente após a descongelação completa à temperatura ambiente, transferir os 1 ml conteúdo criotubo para 50 ml de 37 ° C aqueceu-se Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 2 mM de L-glutamina, 50 ng / mL de M-CSF, 25 ng / mL interleucina-10 (IL-10), e 10% de FBS (meio completo).
  3. Transferir 25 ml de suspensão de monócitos em cada um de dois frascos de 75 cm 2 de cultura de células de plástico.
  4. Incubar as culturas numa incubadora a 37 ° C de cultura de células com 5% de CO 2/95% de ar durante 48 horas.
  5. Lavar o cultures 3 vezes com 10 ml de meio RPMI 1640 (pré-aquecido a 37 ° C), com cuidado de remover o meio de cultura para evitar a retirada quaisquer células fracamente ligados.
  6. Após lavagem, adicione meio completo fresco, mudando média a cada 2 dias até monócitos diferenciar e proliferar o suficiente para se tornar confluentes. Isso requer cerca de uma semana de cultura.

3. A colheita em macrófagos para iniciar Experimentos

  1. Lavar macrófagos diferenciados em balão de 3 vezes com 10 mL de pré-aquecido solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco a 37 ° C, sem Ca 2+ e Mg 2+ antes da adição de 10 ml pré-aquecida de ácido etilenodiaminotetra-tripsina solução a 37 ° C 0,25% (EDTA).
  2. Colocar o balão numa incubadora de cultura de células para 10 - 15 min, altura em que aproximadamente 90% dos macrófagos deve ter arredondado e individual. Verificar esta através de exame microscópico do balão.
  3. Adicionar 10 ml de RPMI 1640 contendo FBS a 10% a stripsinização superior.
  4. Transferir a suspensão de células de macrófagos de balão para um tubo de polipropileno de 50 ml, de centrifugação 300 x g durante 5 min, e desprezar o sobrenadante.
  5. Suavemente ressuspender os macrófagos em 1 ml de meio completo.
  6. Misturar 10 ul de suspensão de células de macrófagos com 10 ul de solução de Azul de Tripano e determinar o número de células de macrófagos e viabilidade (normalmente> 95%), utilizando um hemocitómetro.
  7. Com base na contagem de células (usualmente cerca de 15 - 18 x 10 5 macrófagos), adicionar meio completo adicional para atingir a densidade celular desejada semeadura. Nota: 1 x 10 5 macrófagos em 1,5 ml de meio por poço de uma placa de 12 poços de cultura irá produzir um quase confluentes.
  8. Após a sementeira, incuba macrófagos durante a noite numa incubadora a 37 ° C de cultura de células com 5% de ar de CO 2/95% para permitir a fixação das células. Em seguida, começa experiências desejados.

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Representative Results

A viabilidade de monócitos frescos ou criopreservados foi superior a 95% tal como determinado através da coloração com Trypan Blue 9. A Figura 1 e a Figura 2 comparar com ampliações inferiores e superiores, respectivamente, o progresso da (isto é, congelada) diferenciação de monócitos frescos e criopreservados em macrófagos. Note que o fresco comparado com monócitos criopreservado mostrar uma subpopulação de diferenciar os monócitos que não se espalhou, mas permanecem arredondado. Fase vacúolos-Lucent ocorrer nos macrófagos derivados de monócitos em ambas as condições. Estes representam vacúolos macropinosomes característica de Tipo de macrófagos de M-CSF como anteriormente descrito 10,11.

crioconservação macrófagos após a sua colheita a partir de frascos em que eles foram diferenciados a partir de monócitos não produzir culturas de macrófagos bem sucedidas (

O protocolo anterior para a produção de macrófagos do tipo M-CSF faz isso sem a presença de contaminação de tipo macrófagos de GM-CSF que ocorre, por vezes, quando as culturas são estabelecidas directamente a partir de monócitos, sem a sua criopreservação e diferenciação para macrófagos do tipo M-CSF em frascos. No entanto, os monócitos diferenciam criopreservadas com FBS + GM-CSF produzem excelentes culturas tipo de GM-CSF (Figura 4).

figura 1
Figura 1: Comparação de Fresco contra monócitos criopreservado usado para produzir macrófagos (baixa ampliação) de contraste de fase imagens microscópicas de monócitos criopreservados (congelados) e frescas durante o seu M-CSF induzida diferenciação i. macrófagos GNT. Mostram-se os monócitos durante a cultura em frascos aos 3 e 7 dias, e no dia 8, um dia após a sua colheita e replating em placas de cultura de 12 poços. Bar = 100 mm e se aplica a todos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Comparação de fresco. Monócitos contra criopreservados utilizados para a produção de macrófagos (ampliação elevada) Os monócitos foram cultivados como descrito na Figura 1 e individualidades mostrado em maior ampliação. vacúolos fase-Lucent são macropinosomes (setas brancas). Bar = 50 mm e se aplica a todos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tenda "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 3
Figura 3: criopreservado macrófagos não conseguem produzir culturas adequadas monócitos frescos foram semeadas num frasco e diferenciadas 7 dias com M-CSF como mostrado nas Figuras 1 e 2 acima.. Em seguida, os macrófagos diferenciados foram colhidas a partir de frascos e criopreservados. Em seguida, os macrófagos criopreservados foram semeadas em placas de 12 poços tal como descrito no protocolo de macrófagos não criopreservadas e cultivadas um dia (dia 8). De contraste de fase imagem microscópica da cultura 1 dia mostra que muito poucos dos macrófagos anexação após a sua criopreservação (compare-a-dia 8 resultados para macrófagos não criopreservadas na Figura 1 acima). Bar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 4:. Monócitos foram criopreservadas também adequado para a produção de GM-CSF de tipo macrófagos derivados de monócitos monócitos criopreservadas (25 x 10 6) foram semeadas num frasco e diferenciadas 8 dias com FBS a 10% contendo 50 ng / mL de GM-CSF. imagem de contraste de fase revela a morfologia típica "ovo frito" do tipo macrófagos de GM-CSF. Bar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Geração de tipos de macrófagos definidas podem esclarecer alguns dos resultados conflitantes obtidos pelos investigadores quando se estuda a biologia dos macrófagos. A utilização de várias condições de cultura e dos factores de diferenciação para geração de macrófagos primários humanos pode conduzir a tipos muito diferentes de macrófagos, um facto que não pode ser apreciado pelo pesquisador. Por exemplo, macrófagos, por vezes, são geradas a partir de monócitos humanos utilizando nenhum soro, soro humano por si só, de soro humano enriquecido com FEC-M, FBS sozinho, ou de FBS contendo M-CSF ou GM-CSF. Como relatado anteriormente, e como nós também temos observado, monócitos cultivadas por uma semana sem soro ou com FBS sem factores de diferenciação adicionados não permanecer viáveis ​​3. Como mencionado acima, os monócitos em cultura com soro humano sozinho ou suplementado com M-CSF gerar macrófagos que mostram o "ovo frito" morfologia característica de monócitos diferenciados com FBS mais GM-CSF. Assim, na presença de soro humano a M-CSF tipo macrófago mostrando uma morfologia mais alongada não é obtido mesmo que os monócitos foram diferenciados com M-CSF.

Curiosamente, temos observado que a diferenciação de monócitos com FBS contendo tanto M-CSF e GM-CSF, gera tanto o M-CSF alongada e GM-CSF "ovo frito" fenótipos morfológicas na mesma cultura. Isto sugere que as subpopulações de monócitos distintos dão origem a estes dois tipos de macrófagos. Estudos anteriores demonstraram que os factores de diferenciação de GM-CSF e M-CSF afecta não só a morfologia dos macrófagos, mas também influenciam a expressão de genes e função das células, o que é substancialmente diferente para estes dois tipos de macrófagos 2-6. Imunocoloração para o marcador de macrófagos CD68 em conjunto com CD14, que é expresso por macrófagos do tipo M-CSF e 25F9 que é expressa por macrófagos de GM-CSF pode ser utilizado para confirmar o tipo de macrófagos, como mostrado anteriormente 2. Estes dois tipos de macrófagos may ser especialmente relevante para o estudo da aterosclerose, onde diferentes tipos de macrófagos ocorrer em placas ateroscleróticas e pode mostrar as diferenças no metabolismo do colesterol e expressão de mediadores da inflamação 2,12,13. Por exemplo, tipo M-CSF macrófagos são únicos na medida em que estes macrófagos depósito de colesterol na matriz extracelular quando os macrófagos são enriquecidas com colesterol 12,14,15.

No protocolo apresentado, durante a cultura com M-CSF, IL-10 foi rotineiramente adicionado como descrito anteriormente 16. Esta citocina promove o crescimento e diferenciação dos macrófagos e produz uma morfologia alongada mais homogénea dos macrófagos. Além disso, a IL-10 inibe a sobrevivência dos monócitos GM-CSF-dependente por inibir os eventos de sinalização induzidos por GM-CSF 17. No entanto, os investigadores devem considerar que a IL-10 pode afectar outras respostas celulares em estudo, e, por conseguinte, pode desejar omitir IL-10. Antesutilizando o protocolo corrente empregando proliferação e diferenciação dos monócitos em um frasco, culturas de macrófagos foram iniciadas por plaqueamento directamente monócitos elutriados em poços de cultura e diferenciar-los durante 7 dias antes de iniciar as experiências. No entanto, mesmo com a adição de IL-10, algumas destas culturas de macrófagos mostrou pequenas quantidades (geralmente menos de 10%) de macrófagos "ovo frito" de GM-CSF de tipo contaminando o tipo de M-CSF macrófagos alongados. Com o protocolo atual, GM-CSF contaminação tipo macrófago não ocorre por razões que não são claras. No entanto, não é por monócitos precursoras de GM-CSF de tipo macrófago são perdidas durante o congelamento, como a cultura de monócitos criopreservadas com FBS + GM-CSF produz excelentes culturas tipo GM-CSF (ver Figura 4).

O protocolo descrito utiliza criopreservação de monócitos antes da sua diferenciação em macrófagos. Monócitos criopreservação foi prevmostrado iously para não afetar a função de monócitos e é comumente empregada 18-21. A este respeito, verificou-se que os macrófagos gerados pelo protocolo acima colesterol depósito para o espaço extracelular semelhante ao que se descreveu anteriormente com monócitos não criopreservadas que foram cultivadas directamente em macrófagos 12. Com a criopreservação de monócitos, monócitos estão sempre disponíveis para iniciar experiências independentes, de quando os monócitos pode ser obtido a partir de um dador. Embora não seja essencial para criopreservar os monócitos antes de prosseguir com o protocolo, criopreservação fez produzir culturas de macrófagos mais homogéneas em que todos os macrófagos foram mais espalhado em vez de serem ambos arredondados e espalhar, como foi o caso quando os monócitos frescos foram usadas para iniciar as culturas. Nós têm gerado com êxito a partir de culturas de macrófagos monócitos que foram mantidas congeladas até 6 meses, (o período mais longo testado). Por outro lado, a semeadura de macr criopreservadasophages na cultura poços para experimentos não produziram culturas de macrófagos adequados.

As etapas críticas no protocolo incluem imediatamente colocando monócitos no congelador a seguir à adição de sulfóxido de dimetilo, e imediatamente a transferência de monócitos descongeladas ao meio de cultura. Embora seja comum para remover DMSO por centrifugação células congeladas antes de serem semeadas em cultura, não encontramos este era um passo necessário para a cultura de sucesso dos monócitos. No entanto, os investigadores podem precisar de fazer isso se a concentração de DMSO residual (2 ul / ml) é maior do que o que foi utilizado no protocolo anterior. É importante não para enxaguar monócitos até 48 horas após a sua semeadura em frascos de cultura. Caso contrário, alguns monócitos pode ser perdido, dependendo do seu grau de adesão à superfície da cultura. Por outro lado, uma vez que os monócitos diferenciam-se em macrófagos, aumento da adesão dos macrófagos pode exigir mais tratamento com tripsina para removê-los,ou um levantador de célula pode ser utilizado para facilitar a libertação após o tratamento com tripsina inicial. Se os monócitos não proliferam e se diferenciam, isto poderia ser devido a alguma característica invulgar do dador de monócitos, a perda de actividade de M-CSF, ou devido ao lote de FBS utilizado. Além disso, é possível preocupação quando as culturas não se desenvolvem é a contaminação dos reagentes com endotoxina, um agente que inibe a proliferação de macrófagos 22.

Diferenciando os monócitos criopreservado em frascos com M-CSF permite sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos podem ser colhidas e semeadas em poços de cultura de células em densidades necessárias para a realização de experiências. O uso de números definidos de macrófagos em vez de números de monócitos definidos para iniciar culturas de macrófagos para experiências, produz culturas de macrófagos em que a densidade de células desejada pode ser mais consistentemente alcançados.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellbind 12-well culture plate Corning 3336
CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated Greiner Bio-One North America 658157
RPMI 1640 culture medium Cellgro Mediatech 15-040-CM warmed to 37 °C
L-Glutamine Cellgro Mediatech 25-005-CI
Fetal bovine serum Gibco 16000-036
M-CSF PeproTech 300-25
GM-CSF PeproTech 300-03
IL-10  PeproTech 200-10
DMSO Sigma D2650
Cryovial  Thermo Scientific  375418
DPBS without Ca2+ and Mg2+  Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA  Gibco 25200-056
50 ml polypropylene conical tube Falcon 352070
Trypan Blue Lonza 17-942E
Neubauer-improved bright light hemocytometer Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 610031 http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX cell freezing container BioCision BCS-405 other freezing containers also should  be adequate for this step
Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 Thermo Scientific  7400 any liquid nitrogen tank should be adequate

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References

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Jin, X., Kruth, H. S. Culture ofMore

Jin, X., Kruth, H. S. Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (112), e54244, doi:10.3791/54244 (2016).

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