Protocol
Лейкаферез был проведен в соответствии с протоколом исследования человеческого субъекта, одобренного Национальным институтом здравоохранения совета организационного обзора.
1. Выделение и криоконсервации моноцитов
- Получение мононуклеарных клеток путем лейкаферезом человеческих доноров, и обогащают моноциты путем непрерывного противотока центрифугирование отмучивани мононуклеарных клеток , как описано в ссылках 7,8. Получают примерно 100 х 10 6 клеток отмученного (приблизительно 80 - 90% моноциты) в буфере сепарации , указанного изготовителем. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
- Центрифуга моноциты в 15 мл полипропиленовую трубку при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют клетки в FBS с последующим диметилсульфоксида для достижения конечной концентрации 90% FBS / 10% диметилсульфоксиде и 50 х 10 6 клеток / мл.
- Добавьте каждый мл суспензии клеток то индивидуальной криопробирку.
- Поместите криопробирки в контейнере морозильную клеток и перенести в -80 ° C морозильнике в течение 24 ч перед переносом в охлаждаемой жидким азотом криопробирку резервуар для хранения для длительного хранения.
2. Дифференциация моноцитов в макрофаги
- Растаяйте криопробирку клеток путем быстрого перехода на C водяной бане при 37 °, а затем сразу же удаление, когда суспензию клеток оттаивает около 70%.
- Сразу же после полного оттаивания при комнатной температуре, передача 1 мл криопробирку содержимое в 50 мл 37 ° C нагретый институт Roswell Park Memorial (RPMI) 1640 с 2 мМ L-глутамина, 50 нг / мл M-CSF, 25 нг / мл интерлейкин-10 (ИЛ-10), и 10% FBS (полная среда).
- Перенесите 25 мл моноцитов суспензии в каждый из двух 75 см 2 пластиковых колбах для культивирования клеток.
- Инкубируйте культур в культуре клеток С - инкубаторе 37 ° с 5% CO 2/95% воздуха в течение 48 часов.
- Ополосните у.е.ltures 3 раза с помощью 10 мл среды RPMI 1640 (предварительно нагретом до 37 ° С), осторожно удаления культуральной среды, чтобы избежать каких-либо выбивании слабо прикрепленные клетки.
- После ополаскивания добавьте свежую полную среду, изменяя среду каждые 2 дня до тех пор, пока моноциты дифференцируются и пролиферируют в достаточной степени, чтобы стать вырожденная. Для этого требуется около одной недели культуры.
3. Сбор Макрофаги инициировать эксперименты
- Промыть дифференцированные макрофаги в колбу 3 раза с помощью 10 мл подогретого фосфатно-буферном солевом растворе 37 ° C В Дульбекко без Са 2+ и Mg 2+ , перед добавлением 10 мл подогретого 37 ° С 0,25% раствора трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
- Поместите колбу в культуре клеток инкубаторе в течение 10 - 15 минут, после чего примерно 90% макрофагов, должны иметь закругленные и отсоединяются. Проверьте это микроскопическое исследование колбы.
- Добавьте 10 мл RMPI 1640, содержащей 10% FBS до sсверху трипсинизации.
- Перенести макрофагальной клеточной суспензии из колбы в 50 мл полипропиленовую пробирку, центрифуга 300 мкг в течение 5 мин, и отбросить супернатант.
- Аккуратно ресуспендирования макрофаги в 1 мл полной среды.
- Смешайте 10 мкл макрофагальной клеточной суспензии с 10 мкл раствора трипанового синего и определяют количество клеток макрофагальной и жизнеспособность (обычно> 95%) с помощью гемоцитометра.
- На основе числа клеток (обычно около 15 - 18 х 10 5 макрофаги), добавить дополнительную полную среду для достижения желаемой плотности высева клеток. Примечание: 1 х 10 5 макрофаги в 1,5 мл среды на лунку 12-луночного планшета , будет производить около-сливающийся культуры.
- После засева, инкубировать макрофаги в течение ночи в 37 ° C для культивирования клеток инкубаторе с 5% CO 2/95% воздуха , чтобы позволить прикрепление клеток. Затем начинают требующихся экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Жизнеспособность свежих или криосохранены моноцитов было больше , чем 95% , как определено с окрашивания трипановым синим 9. На рисунке 1 и 2 сравнить при более низких и более высоких увеличениях, соответственно, прогресс свежих и криоконсервированных (т.е. замороженные) моноцитов дифференциации в макрофаги. Обратите внимание, что свежий по сравнению с криоконсервированных моноциты демонстрируют субпопуляции дифференциации моноцитов, которые не распространяются, но остаются закруглены. Фаза-LUCENT вакуоли встречаются в моноцитарных макрофагов в обоих состояниях. Эти вакуоли представляют собой macropinosomes характеристику макрофагов типа M-CSF , как описано выше 10,11.
Криоконсервировать макрофаги после сбора из колб, в которых они были дифференцированы из моноцитов не производили успешных культур макрофаги ( Вышеуказанный протокол для производства макрофаги типа M-CSF делает это без присутствия загрязняя макрофаги типа GM-CSF, который иногда возникает, когда культуры устанавливаются непосредственно из моноцитов без их криоконсервации и дифференцировки в макрофагах типа М-CSF в колбах. Тем не менее, криоконсервированных моноциты дифференцируются с FBS + GM-CSF производят отличные культур типа GM-CSF (рисунок 4). 
Рисунок 1: Сравнение свежей по сравнению с криоконсервированных моноцитов используется для производства макрофаги (низкое увеличение) фазового контраста микроскопические изображения криоконсервированных (замороженных) и свежих моноцитов во время их M-CSF индуцирует дифференциацию I. НТО макрофаги. Показаны моноциты во время культивирования в колбах на 3 и 7 дней, а на 8-й день, в один прекрасный день после их уборки и replating в 12-луночные культуральные планшеты. Бар = 100 мкм и относится ко всем. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 2: Сравнение. Пресная по сравнению с криоконсервированных моноцитов , используемых для производства макрофаги (высокое увеличение) Моноциты культивировали , как описано на рисунке 1 легенды и показано здесь , при большем увеличении. Фаза-Lucent вакуоли macropinosomes (белые стрелки). Bar = 50 мкм и относится ко всем. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 3: Криоконсервированные макрофаги не в состоянии производить достаточное культур свежие моноциты высевают в колбу и дифференцированной 7 дней с M-CSF , как показано на рисунках 1 и 2 выше.. Затем, дифференцированные макрофаги собирали из колб и криоконсервации. Затем криоконсервированных макрофаги засевали в 12-луночные планшеты, как описано в протоколе для не криоконсервированных макрофагами и культивируемых 1 день (день 8). Фазового контраста микроскопическое изображение 1- й день культуры показывает , что очень немногие из макрофагов с присоединением после их криоконсервации (сравните день 8 результаты для не криоконсервированных макрофагов на рисунке 1 выше). Bar = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Криоконсервированные моноциты также пригодны для производства типа GM-CSF из моноцитов макрофаги Криоконсервированные моноциты (25 х 10 6) высевали в колбу и дифференцированными 8 дней с 10% FBS , содержащей 50 нг / мл GM-CSF. Фазового контраста изображения показывает типичную "глазунья" морфология макрофагов типа GM-CSF. Bar = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Создание определенных типов макрофаги могут прояснить некоторые противоречивые результаты, полученные исследователями при изучении биологии макрофагами. Использование различных условий культивирования и дифференциации факторов для формирования первичных макрофагах человека может привести к очень разным типам макрофагами, а тот факт, что не может быть оценена исследователем. Например, макрофаги иногда генерируются из человеческих моноцитов, не используя сыворотки, по отдельности человеческая сыворотка, сыворотка крови человека с добавлением M-CSF, ФБС в одиночку, или ФБС, содержащих M-CSF или GM-CSF. Как сообщалось ранее , и , как мы также наблюдали, моноциты культивировали в течение недели без сыворотки или с FBS без дополнительных факторов дифференцировки не остаются жизнеспособными 3. Как уже упоминалось выше, моноциты культивируют с сывороткой человека в отдельности или с добавкой M-CSF генерировать макрофаги, которые показывают "глазунья" Морфология характеристику моноциты дифференцируются с FBS плюс GM-CSF. Таким образом, в присутствии сыворотки человека М-CSF типа макрофагов, показывающий более удлиненную морфологию не получается, хотя моноциты были дифференцированы с M-CSF.
Интересно отметить, что мы наблюдали, что дифференцировка моноцитов с FBS, содержащими как M-CSF и GM-CSF, генерирует как M-CSF удлиненными и GM-CSF "глазунья" морфологические фенотипы в той же культуре. Это говорит о том, что различные моноцитов субпопуляции дают начало этим двум типам макрофага. Предыдущие исследования показали , что M-CSF и GM-CSF фактора дифференцировки влияют не только на морфологию макрофага, но и влиять на экспрессию генов и клеточной функции, которая существенно отличается для этих двух типов макрофага 2-6. Иммуногистохимическое макрофага маркера CD68 в сочетании с CD14 , который экспрессируется макрофагами типа M-CSF и 25F9 , что выражается GM-CSF макрофаги могут быть использованы для подтверждения типа макрофага , как показано ранее 2. Эти два типа макрофаги мау быть особенно уместным к изучению атеросклероза , где различные типы макрофаги происходят в атеросклеротических бляшках и может показать различия в обмене холестерина и экспрессии медиаторов воспаления 2,12,13. Например, макрофаги типа M-CSF являются уникальными в том , что депозит холестерина эти макрофаги в внеклеточного матрикса , когда макрофаги обогащены холестерином 12,14,15.
В протоколе , представленном во время культивирования с M-CSF, IL-10 была обычно добавляется , как описано выше 16. Этот цитокин стимулирует рост и дифференцировку макрофагов и создает более однородную удлиненной морфологии макрофагами. Кроме того, IL-10 ингибирует GM-CSF-зависимой выживаемости моноцитов путем ингибирования событий передачи сигналов , индуцируемых GM-CSF 17. Тем не менее, исследователи должны учитывать, что IL-10 может влиять на другие клеточные ответы при исследовании, и, следовательно, возможно, пожелают опустить IL-10. Дос использованием текущего протокола, использующую пролиферацию и дифференциацию моноцитов в колбе, макрофаги культуры были инициированы непосредственно металлизации отмученного моноцитов в лунки с культурой и отличающим их в течение 7 дней до начала экспериментов. Тем не менее, даже с добавлением IL-10, некоторые из этих культурах макрофагов показали небольшое количество (обычно менее 10%) макрофагами "глазунья" типа GM-CSF, загрязняя удлиненные макрофаги типа M-CSF. С текущего протокола, GM-CSF загрязнения типа макрофагов не происходит по причинам, которые не ясны. Тем не менее, это не потому , что моноциты - предшественники GM-CSF , типа макрофаг теряются при замерзании, а культивировании криоконсервированных моноцитов с FBS + GM-CSF , дает прекрасные культур типа GM-CSF (см рисунок 4).
Описанный протокол использует криоконсервации моноцитов до их дифференцировки в макрофагах. Моноцитов криоконсервации был предiously показано , не влияет на функцию моноцитов и обычно используется 18-21. В связи с этим, мы обнаружили , что макрофаги , сгенерированные протоколом выше уровень холестерина депозита в межклеточное пространство подобно тому , что мы описали ранее с не криоконсервированных моноцитов , которые культивируют непосредственно в макрофагах 12. С моноцитов криоконсервации, моноциты всегда доступны для начала экспериментов, независимо от того, когда моноциты могут быть получены от донора. Хотя это не является необходимым для криоконсервируют моноцитов, прежде чем продолжить с протоколом, криоконсервация действительно производила более однородные макрофаги культуры в том, что все макрофаги были более распространены, чем быть как округлая и распространение, как это было в случае, когда свежие моноциты были использованы для инициирования культуры. Мы успешно создали культурах макрофагов из моноцитов, которые хранили в замороженном до 6 месяцев, (самый длинный время испытания). С другой стороны, засев криоконсервированных MACRophages в культуру скважины для экспериментов не дали адекватных культур макрофаги.
Критические шаги в протоколе включают сразу размещая моноциты в морозильную камеру после добавления диметилсульфоксида, и сразу же перенос размораживают моноцитов в культуральной среде. Несмотря на то, что является общим для удаления ДМСО путем центрифугирования замороженных клеток, прежде чем они высевают в культуру, мы не нашли это было необходимым шагом в успешной культуре моноцитов. Тем не менее, исследователи, возможно, потребуется, чтобы сделать это, если концентрация остаточного ДМСО (2 мкл / мл) выше, чем то, что было использовано в вышеприведенном протоколе. Важно не ополаскивать моноциты в течение 48 часов после их высева в колбах с культурой. В противном случае, некоторые моноциты могут быть потеряны в зависимости от их степени адгезии к поверхности культуры. С другой стороны, как только моноциты дифференцируются в макрофаги, повышенную адгезию макрофагов может потребоваться больше времени обработки трипсином, чтобы удалить их,или клетка, подъемное приспособление может быть использовано для облегчения высвобождения после первоначальной обработки трипсином. Если моноциты не пролиферируют и дифференцируются, это может быть из-за какой-то необычной характеристикой донора моноцитов, потеря активности M-CSF, или из-за большого количества FBS используется. Кроме того , возможного беспокойства , когда культуры не развиваются является загрязнение реагентов с эндотоксина, агент , который ингибирует пролиферацию 22 макрофагами.
Дифференцируя криоконсервированных моноцитов в колбах с M-CSF позволяет их насыпной дифференцировки в макрофагах. Затем, макрофаги могут быть собраны и засевали в культуральные лунки при плотности клеток, необходимых для проведения экспериментов. Использование определенных чисел макрофагов, а не определенные числа моноцитов для инициирования макрофаги культур для экспериментов, дает макрофаги культуры, в которых требуемая плотность клеток может быть более последовательно достигнуты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
