Protocol
Leukaferes utfördes under en människa forskning protokoll som godkänts av en National Institutes of Health Institutional Review Board.
1. Isolering och Kryokonservering av monocyter
- Erhålla mononukleära celler genom leukaferes av mänskliga donatorer, och berika monocyter genom kontinuerlig motströmscentrifugering elutriation av mononukleära celler, såsom beskrivits i referenserna 7,8. Erhålla cirka 100 x 10 6 slammas celler (ca 80 - 90% monocyter) i slambuffert anges av tillverkaren. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Centrifugera monocyter i ett 15 ml polypropenrör vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera cellerna i FBS följt av dimetylsulfoxid för att uppnå en slutlig koncentration av 90% FBS / 10% dimetylsulfoxid och 50 x 10 6 celler / ml.
- Lägg varje ml cellsuspension to en enskild cryovial.
- Placera cryovials i en cell frysning behållare och överför till en -80 ° C frys under 24 timmar innan de överförs till en flytande kväve cryovial lagringstank för långtidsförvaring.
2. Differentiering av monocyter till makrofager
- Tina en cryovial av celler genom att snabbt förflyttas till en 37 ° C vattenbad och sedan omedelbart ta bort när cellsuspensionen har tinat ca 70%.
- Omedelbart efter fullständig upptining vid rumstemperatur, överföra 1 ml cryovial innehållet i 50 ml 37 ° C värmdes Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium med 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukin-10 (IL-10), och 10% FBS (komplett medium).
- Överför 25 ml av monocyt suspensionen i var och en av två 75 cm 2 plast cellodlingsflaskor.
- Inkubera kulturer i en 37 ° C cellodlingsinkubator med 5% CO2 / 95% luft under 48 timmar.
- Skölj cultures 3 gånger med 10 ml RPMI 1640-medium (förvärmas till 37 ° C), försiktigt avlägsnande av odlingsmediet för att undvika att rubba eventuella löst fästa celler.
- Efter sköljning, lägga färskt fullständigt medium, ändra medium var 2 dagar tills monocyter differentiera och föröka sig tillräckligt för att bli sammanflytande. Detta kräver ca en veckas odling.
3. Skörd makrofager Initiera Experiment
- Skölj differentierade makrofager i kolv 3 gånger med 10 ml förvärmda 37 ° C Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning utan Ca2 + och Mg2 + före tillsats av 10 ml förvärmda 37 ° C 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) -lösning.
- Plats kolv i cellodling inkubator under 10 - 15 min, vid vilken tidpunkt ca 90% av makrofagerna bör ha rundad och fristående. Verifiera detta genom mikroskopisk undersökning av kolven.
- Tillsätt 10 ml RMPI 1640-medium innehållande 10% FBS till stop trypsinisering.
- Överföra makrofag cellsuspension från kolven in i ett 50 ml polypropylenrör, centrifugera 300 xg under 5 min, och kassera supernatanten.
- Försiktigt resuspendera makrofagerna i 1 ml komplett medium.
- Blanda 10 | il av makrofag cellsuspension med 10 ^ il trypanblått-lösning och bestämma makrofag cellantal och viabilitet (typiskt> 95%) med användning av en hemocytometer.
- Baserat på antalet celler (vanligen ca 15 - 18 x 10 5 makrofager), lägga till ytterligare fullständigt medium för att uppnå den önskade sådd celltätheten. Obs: 1 x 10 5 makrofager i 1,5 ml medium per brunn i en 12-brunnar kommer att producera en nära sammanflytande kultur.
- Efter sådd, inkubera makrofager över natten i en 37 ° C cellodlingsinkubator med 5% CO2 / 95% luft för att tillåta cellvidhäftning. Därefter börjar önskade experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Livskraft färska eller kryokonserverade monocyter var större än 95% enligt bestämning med trypanblått färgning 9. Figur 1 och Figur 2 jämför vid lägre och högre förstoringar, respektive utvecklingen av färsk och frysförvarade (dvs, frysta) monocyt differentiering till makrofager. Observera att den färska jämfört med kryokonserverade monocyter visar en subpopulation att differentiera monocyter som inte sprids utan förblir rundade. Fas-LUCENT vakuoler förekommer i monocythärledda makrofager i båda villkoren. Dessa vakuoler representerar macropinosomes egenskap hos M-CSF-typ makrofager som tidigare beskrivits 10,11.
Cryopreserving makrofager efter sin skörd från kolvarna där de differentierade från monocyter producerade inte framgångsrika makrofagkulturer ( Det ovanstående protokollet för framställning av M-CSF-typ makrofager gör det utan närvaro av kontaminerande GM-CSF-typ makrofager som ibland uppstår när kulturer etableras direkt från monocyter utan deras kryokonservering och differentiering till M-CSF-typ makrofager i kolvar. Emellertid kryokonserverade monocyter differentieras med FBS + GM-CSF producera utmärkta GM-CSF Type Cultures (Figur 4). 
Figur 1: Jämförelse av färsk kontra kryokonserverade monocyter används för att producera makrofager (låg förstoring) faskontrast mikroskopiska bilder av frysförvarade (fryst) och färska monocyter under sin M-CSF inducerade differentiering i. NTO makrofager. Här visas monocyter under kultur i flaskor på 3 och 7 dagar, och på dag 8, en dag efter sin skörd och omstryka i 12-brunnsodlingsplattor. Bar = 100 pm och gäller för alla. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2:. Jämförelse av färsk kontra kryokonserverade monocyter används för att producera makrofager (stor förstoring) Monocyter odlades såsom beskrivs i figur 1 legend och visas här vid högre förstoring. Fas lysande vakuoler är macropinosomes (vita pilar). Bar = 50 pm och gäller för alla. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3: kryokonserverade makrofager misslyckas att producera tillräckliga kulturer Färska monocyter såddes i en kolv och differentierade 7 dagar med M-CSF, såsom visas i fig 1 och 2 ovan.. Därefter fick de differentierade makrofager skördas från flaskor och frysförvarade. Därefter tillsattes de kryokonserverade makrofager såddes i 12-brunnsplattor som beskrivs i protokollet för icke-kryokonserverade makrofager och odlades en dag (dag 8). Faskontrast mikroskopisk bild av en-dagars odling visar att mycket få av makrofagerna fäster efter deras frysförvaring (jämför till dag 8 resultat för icke-kryokonserverade makrofager i figur 1 ovan). Bar = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Kryokonserverade monocyter var också lämplig för att producera GM-CSF typ monocythärledda makrofager Kryokonserverade monocyter (25 x 10 6) såddes i en kolv och differentierade 8 dagar med 10% FBS innehållande 50 ng / ml GM-CSF. Faskontrast bild visar den typiska "stekt ägg" morfologi av GM-CSF typ makrofager. Bar = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generera definierade makrofag typer kan klargöra några av de motstridiga resultat som erhållits genom utredare när man studerar makrofag biologi. Användning av olika odlingsförhållanden och differentieringsfaktorer för att generera primära humana makrofager kan leda till mycket olika makrofag typer, ett faktum som inte kan förstås av forskaren. Till exempel, makrofager ibland alstras från humana monocyter med användning av inget serum, humant serum ensam, humant serum kompletterat med M-CSF, FBS ensamt eller FBS innehållande M-CSF eller GM-CSF. Som tidigare rapporterats och som vi också har observerat, monocyter odlade i en vecka utan serum eller med FBS utan tillsatta differentieringsfaktorer inte förbli livskraftig 3. Såsom nämnts ovan, monocyter odlade med humant serum ensamt eller med tillsats av M-CSF generera makrofager som visar "stekt ägg" morfologi karakteristisk för monocyter differentierade med FBS plus GM-CSF. Således, i närvaro av humant serum M-CSF typ makrofag visar en mer långsträckt morfologi inte erhålls trots monocyter har differentierats med M-CSF.
Intressant nog har vi observerat att differentieringen av monocyter med FBS innehållande både M-CSF och GM-CSF, genererar både M-CSF långsträckt och GM-CSF "stekt ägg" morfologiska fenotyper i samma kultur. Detta tyder på att olika monocyt delpopulationer ger upphov till dessa två makrofager typer. Tidigare studier har visat att M-CSF och GM-CSF-differentieringsfaktorer påverkar inte bara morfologin hos makrofag, men också påverka genexpression och cellfunktion, som är väsentligen olika för dessa två makrofag typerna 2-6. Immunfärgning för makrofag markör CD68 i samband med CD14 som uttrycks av M-CSF typ makrofager och 25F9 som uttrycks av GM-CSF makrofager kan användas för att bekräfta typen makrofager som visats tidigare två. Dessa två makrofag typer may vara särskilt relevanta för studien av ateroskleros där olika makrofager typer förekommer i aterosklerotiska plack och kan visa skillnader i kolesterol metabolism och uttryck av inflammationsmediatorer 2,12,13. Till exempel, M-CSF typ makrofager är unika genom att dessa makrofager insättning kolesterol till den extracellulära matrisen när makrofagerna är berikade med kolesterol 12,14,15.
I protokollet presenteras under odling med M-CSF, har IL-10 rutinmässigt läggas till som beskrivits tidigare 16. Detta cytokin befrämjar tillväxt och differentiering av makrofagerna, och bildar en mer homogen långsträckt morfologi makrofagerna. Dessutom IL-10 inhiberar GM-CSF-beroende monocyt överlevnad genom att hämma de signaleringshändelser som induceras av GM-CSF 17. Dock bör utredarna anser att IL-10 kan påverka andra cellsvar som studeras, och därför, kan vilja att utelämna IL-10. Innangenom att använda det nuvarande protokollet utnyttjar proliferation och differentiering av monocyter i en kolv, var makrofagkulturer initieras av direkt plätering slammas monocyter i odlingsbrunnar och differentiera dem i 7 dagar före start experiment. Men även med tillsats av IL-10, en del av dessa makrofagkulturer uppvisade litet antal (vanligtvis mindre än 10%) av "stekt ägg" GM-CSF-typ makrofager kontaminerar de långsträckta M-CSF-typ makrofager. Med det nuvarande protokollet, inte GM-CSF typ makrofag förorening inte uppstår av skäl som inte är klart. Emellertid är det inte för att GM-CSF-makrofag typ prekursor monocyter går förlorade under frysning, såsom odling av de kryokonserverade monocyter med FBS + GM-CSF producerar utmärkta GM-CSF Type Cultures (se figur 4).
Den beskrivna protokollet utnyttjar kryokonservering av monocyter före deras differentiering till makrofager. Monocyt kryokonservering har varit föregåendeiously visat sig inte påverka monocyt funktion och används vanligen 18-21. I detta avseende har vi funnit att makrofager som genereras av protokollet ovan insättning kolesterol i det extracellulära utrymmet liknar vad vi har beskrivit tidigare med icke-kryokonserverade monocyter som odlades direkt i makrofager 12. Med monocyt frysförvaring, monocyter finns alltid tillgängliga för att initiera experiment, oberoende av när monocytema kan erhållas från en donator. Även om det inte är nödvändigt att cryopreserve monocytema innan du fortsätter med protokollet, frysförvaring gjorde producera mer homogena makrofagkulturer i att alla makrofager mer spridda snarare än att vara både rundade och sprids som var fallet när färska monocyter användes för att initiera kulturer. Vi har framgångsrikt genererat makrofagkulturer från monocyter som hölls frysta upp till 6 månader, (den längsta tid testat). Å andra sidan, sådd av kryokonserverad macrophages i odlingsbrunnar för experiment inte producera tillräckligt makrofagkulturer.
Kritiska steg i protokollet inkluderar omedelbart placera monocyter i frysen efter tillsats av dimetylsulfoxid, och omedelbart överföra upptinade monocyter till odlingsmedium. Även om det är vanligt att avlägsna DMSO genom att centrifugera frysta celler innan de sås i kultur, hittade vi inte detta var ett nödvändigt steg i en framgångsrik kultur monocyter. Dock kan utredarna måste göra detta om koncentrationen av kvarvarande DMSO (2 pl / ml) är högre än vad som användes i ovanstående protokoll. Det är viktigt att inte spola monocyter till 48 timmar efter sin sådd i odlingsflaskor. Annars kan vissa monocyter förloras beroende på deras grad av vidhäftning till odlingsytan. Å andra sidan, när monocytema differentiera till makrofager, ökad vidhäftning av makrofagerna kan kräva längre trypsinbehandling att ta bort dem,eller en cell lyftaren kan användas för att underlätta frisättning efter den initiala trypsinbehandling. Om monocyter inte föröka sig och differentiera, kan det bero på att någon ovanlig egenskap hos monocyt givare, förlust av aktivitet av M-CSF, eller på grund av mycket FBS används. Även eventuell oro när kulturer inte utvecklas är kontaminering av reagenser med endotoxin, ett medel som hämmar makrofag spridning 22.
Differentiera kryokonserverade monocyter i kolvar med M-CSF kan deras bulk differentiering till makrofager. Sedan kan makrofagerna skördas och såddes i odlingsbrunnar på erforderlig celltätheter för att utföra experiment. Användningen av definierade antal makrofager snarare än definierade antalet monocyter för att initiera makrofagkulturer för experiment, ger makrofagkulturer i vilket den önskade celltätheten kan mer konsekvent uppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
