Protocol
Lökoferez Sağlık kurumsal inceleme kurulu Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanmış bir insan öznenin araştırma protokol kapsamında gerçekleştirildi.
1. İzolasyon ve Monositler Kryoprezervasyon
- İnsan donörlerin lökaferez tarafından mononükleer hücreleri elde, ve referanslar 7,8 açıklandığı gibi mononükleer hücrelerin sürekli karşı akım santrifüj elutrasyonun tarafından monositler zenginleştirmek. Üretici tarafından belirtilen sivili ayrıştırma tamponunda - (% 90 monositler yaklaşık 80) yaklaşık 100 x 10 6 elutriated hücre elde. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- 300 xg'de 15 mi polipropilen tüp içinde santrifüj monositler Oda sıcaklığında 5 dakika karıştırıldı.
- Bir son% 90 FBS /% 10 dimetil sülfoksit konsantrasyonu 50 x 10 6 hücre / ml elde etmek için, dimetil sülfoksit, ardından FBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri hafifçe Süpernatantı ve.
- Hücre süspansiyonu t her ml ekleyinbağımsız bir cryovial O.
- Hücre dondurma kapta cryovials yerleştir ve transfer -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya 24 saat boyunca, uzun süreli depolama için bir sıvı azot depolama tankı cryovial aktarmadan önce.
Makrofajlar içine Monositler 2. Farklılaşma
- hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosuna transfer ve hücre süspansiyonu yaklaşık% 70 çözülmüş zaman derhal kaldırarak hücre cryovial çözülme.
- Hemen, oda sıcaklığında komple erime üzerine Cı Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml 1640 ortamı ısıtıldı, 37 °, 50 ml 1 ml cryovial içeriğini aktarmak interlökin-10 (IL-10) ve% 10 FBS (tam ortam).
- Aktarım, iki 75 cm 2 Plastik hücre kültürü şişesinden her birine monosit süspansiyonu 25 mi.
- 48 saat boyunca% 5 CO2 /% 95 hava ile 37 ° C hücre kültürü inkübatöründe kültürleri inkübe edin.
- cu durulayınRPMI 1640 ortamı yavaşça bir gevşek bağlı hücrelerin yerini değiştirmemek için, kültür ortamının çıkarılması, (37 ° C önceden ısıtılmış) mi, 10 ile ltures 3 kez.
- durulama sonrasında, monositler ayırt kadar ortam her 2 günde bir değişen, taze tamamlanmış besiyeri ekleyebilir ve konfluent hale gelmeye yeterli çoğalır. Bu kültürün yaklaşık bir hafta gerektirir.
3. Hasat Makrofajlar Deneyler Başlatacak
- 10 ml bir şişe içinde 3 kez ayırt makrofajlar durulayın önceden ısıtılmış 37 ° C,% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi 10 ml ilave edilmeden önce 2 + ve Mg2 +, Ca olmayan 37 ° C Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su önceden ısıtılmış.
- makrofajlar yaklaşık% 90'ı yuvarlak ve müstakil olması gereken zaman 15 dakika - 10 hücre kültürü inkübatör Yeri balon. Şişenin mikroskopik inceleme ile bu doğrulayın.
- % 10 FBS içeren RMPI 1640 ortamında 10 ml ŞÜst trypsinization.
- 5 dakika boyunca santrifüj 50 ml polipropilen tüpe şişeye 300 xg makrofaj hücre süspansiyonu aktarın ve süpernatant atılır.
- Yavaşça tam ortam içinde 1 ml makrofajlar yeniden süspanse edin.
- 10 ul Tripan Mavisi solüsyonu ile makrofaj hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın ve bir hemositometre kullanılarak makrofaj hücre sayısı ve canlılığı (tipik olarak>% 95) belirler.
- Hücre sayımına bağlı olarak (genel olarak yaklaşık 15-18 x 10 5 makrofajlar), arzu edilen tohumlama hücre yoğunluğu elde etmek için ek bir tam orta ekleyin. Not: 12 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için 1.5 ml ortam içinde 1 x 10 5 makrofajlar yakın bir Birleşik kültür üretecektir.
- Tohumlamadan sonra, hücre tutunmasını sağlar,% 5 CO2 /% 95 hava ile 37 ° C hücre kültürü gece boyunca inkübatör içinde makrofajlar inkübe edin. Sonra, istenen deneyleri başlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tripan mavi 9 boyama ile saptandığı haliyle, taze veya dondurulmuş monosit canlılığı Şekil 1.% 95'den daha fazla olan ve Şekil 2, alt ve üst büyütmelerde karşılaştırabilir sırasıyla makrofajlara taze ve dondurularak saklanmış (yani, donmuş) monosit farklılaşmasının ilerlemesi. Kriyoprezerve monositler yaymak ancak yuvarlak kalmaz monositler ayırt gösteren bir alt göstermektedir taze karşılaştırıldığında unutmayın. Faz-lucent vakuol her iki durumda da monosit kökenli makrofajlar meydana gelir. Daha önce tarif edildiği gibi 10,11 Vaküoller M-CSF türü makrofaj macropinosomes özelliği temsil eder.
Onlar monositler ayırt edildiği şişeler kendi hasat sonrası cryopreserving makrofajlar (başarılı makrofaj kültürleri vermedi M-CSF türü makrofajlar üretilmesi için yukarıdaki protokol kültürleri şişelerinde M-CSF türü makrofajlara kendi dondurarak saklama ve farklılaşma olmadan monositler tarafından doğrudan belirlenir bazen meydana GM-CSF türü makrofajlar kirletici varlığı olmadan yapar. Ancak, dondurulan monositler + GM-CSF, mükemmel GM-CSF tipi kültürleri (Şekil 4) üreten FBS ile ayırt. 
Şekil 1: dondurulan monositler karşı taze karşılaştırılması makrofajlar (düşük büyütme) üretmek için kullanılan dondurulan (dondurulmuş) ve taze monositlerin Faz-kontrast mikroskobik görüntüleri kendi M-CSF kaynaklı farklılaşma i sırasında. Nto makrofajlar. 3 ve 7 gün sonra şişeler içinde kültür sırasında monositler gösterilen ve 8. günde, tek bir gün 12 oyuklu kültür plakaları içine hasat ve şarjı sonra. = 100 mikron ve herkes için geçerli bar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 2:. Şekil 1 efsanede anlatılan ve daha yüksek büyütmede burada gösterildiği gibi (yüksek büyütme) makrofajlar üretmek için kullanılan dondurulan monositler karşı taze Monositler karşılaştırılması kültüre edildi. Faz-lucent vakuoller macropinosomes (beyaz oklar) bulunmaktadır. = 50 mikron ve herkes için geçerli bar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 3: Dondurularak saklanan makrofajlar, yeterli kültürleri üretmek için başarısız Taze monositler M-CSF ile bir şişeye ve farklı 7 gün serpildi Yukarıda, Şekil 1 ve 2'de gösterildiği gibi.. Daha sonra, farklı makrofajlar şişeleri ve dondurularak saklanmış hasat edilmiştir. olmayan dondurulan makrofaj ve kültüre 1 gün (gün 8) için protokolde tarif edildiği gibi, dondurulan makrofajlar 12 oyuklu plakalara tohumlandı. 1 günlük kültür faz-kontrast mikroskobik görüntü makrofajlar çok az (yukarıdaki Şekil 1'de güne olmayan dondurulan makrofajlar için 8 sonuçlarını karşılaştırmak) kendi kriyoprezervasyon aşağıdaki yükledikleriyle olduğunu göstermektedir. Bar = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Dondurularak saklanan monositler, GM-CSF tipi monosit türevli makrofajlar üretmek için uygun olduğu Dondurularak saklanan monositler (25 x 10 6) 50 ng / ml GM-CSF ihtiva eden,% 10 FBS ile bir şişeye ve farklı 8 gün içine ekilmiştir. Faz kontrastlı görüntü GM-CSF tipi makrofajlar tipik "kızarmış yumurta" morfoloji göstermektedir. Bar = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
tanımlı makrofaj türlerini üreten makrofaj biyoloji okuyan zaman araştırmacılar tarafından elde edilen çelişkili sonuçların bazılarını şöyle açıklamak mümkündür. çeşitli kültür koşulları ve farklılaşma faktörleri kullanımı primer insan makrofaj farklı makrofaj türlerine neden olabilir araştırmacı tarafından takdir olabilir bir gerçeği üretir. Örneğin, makrofajlar bazen serum tek başına insan serumu, FBS başına M-CSF, ya da M-CSF veya GM-CSF ihtiva eden FBS ile takviye edilmiş insan serumu kullanılarak insan monositlerinden oluşturulur. Daha önce bildirilen ve biz de gözlemlediğimiz gibi, monositler 3 canlı kalmaz eklenen farklılaşma faktörleri olmadan FBS serum olmadan veya bir hafta kültüre olarak. Yukarıda belirtildiği gibi, monositler, tek başına insan serumu ile kültürlenen veya FBS artı GM-CSF ile farklılaşmış monositlerin "kızarmış yumurta" morfolojisi göstermemesi makrofajlar elde M-CSF ile takviye edilmiştir. Bu nedenle, insan serumu M mevcudiyetindemonositler M-CSF ile farklılaşmış olsa bile bir daha uzatılmış morfoloji gösteren BOS tipi makrofaj elde edilmez.
İlginç bir şekilde, gözlemledik aynı kültür morfolojik fenotipi "yumurta kızartılmış" M-CSF ve GM-CSF üretir hem uzunlamasına M-CSF ve GM-CSF içeren FBS ile monositlerin türevleri. Bu tat monosit alt-popülasyonları bulunduğunu bu iki makrofaj türlerine neden olduğunu göstermektedir. Daha önceki çalışmalar, M-CSF ve GM-CSF farklılaşma faktörleri makrofaj sadece morfolojisine etki, aynı zamanda, gen ekspresyonu ve bu iki makrofaj tip 2-6 için esas olarak farklı olan bir hücre fonksiyonunu etkileyebilir göstermiştir. Daha önce gösterildiği gibi, 2, GM-CSF makrofaj tarafından ifade edilmektedir M-CSF türü makrofajlar ve 25F9 ile ifade edilir CD14 ile birlikte makrofaj markör CD68 için immüno-makrofaj tipi teyit etmek için kullanılabilir. Bu iki makrofaj tip may farklı makrofaj türleri aterosklerotik plakların ortaya çıkar ve kolesterol metabolizması ve inflamasyon arabulucuların 2,12,13 ifadesi farklılıkları gösterebilir ateroskleroz çalışmaya özellikle alakalı. Makrofajlar kolesterol 12,14,15 ile zenginleştirilmiş Örneğin, M-CSF türü makrofajlar hücre dışı matrisin içine Bu makrofajlar yatırma kolesterol eşsizdir.
Daha önce tarif edildiği gibi, 16 M-CSF ile kültür sırasında, sunulan protokolde, IL-10, rutin olarak eklendi. Bu sitokin makrofajların büyümesini ve farklılaşmasını teşvik ve makrofajlar daha homojen bir uzunlamasına morfolojisi üretir. Buna ek olarak, IL-10, GM-CSF 17 neden olduğu sinyal olaylarını inhibe ederek, GM-CSF bağlı monosit hayatiyetini sürdürmesini inhibe etmektedir. Ancak, araştırmacılar IL-10 ihmal isteyebilirsiniz, IL-10, bu nedenle çalışma kapsamında diğer hücre yanıtları etkileyebilir ve düşünmelisiniz. Önceçoğalmasını ve bir şişe içinde monosit farklılaşmasını kullanan mevcut protokolü kullanarak, makrofaj kültürü doğrudan kültür kuyulara elutriated monositler kaplama, deney başlamadan önce 7 gün süreyle ayırt başlanılmıştır. Bununla birlikte, daha da IL-10 ilave edilerek, bu makrofaj kültürlerinin bazıları uzun M-CSF türü makrofajlar kirletici "kızarmış yumurta" GM-CSF türü makrofaj az sayıda (genellikle en az% 10) göstermiştir. Geçerli protokol ile, GM-CSF tipi makrofaj kontaminasyon net değil nedenlerden dolayı oluşmaz. GM-CSF makrofaj tipi öncüsü monositler, GM-CSF mükemmel GM-CSF tipi kültürleri (Şekil 4) üretir + FBS ile dondurulan monositlerin kültürleme olarak, donma sırasında kaybolur Ancak, öyle değil.
açıklanan protokol makrofajlar içine farklılaşma önce monositlerin kriyopreservasyona kullanır. Monosit dondurma prev olmuşturiously monosit fonksiyonu etkilemediği gösterilmiştir ve genel olarak 18-21 kullanılır. Bu bağlamda, biz bulduk biz makrofajlar 12 doğrudan kültüre edildi olmayan dondurulan monositler ile daha önce tarif ne benzer hücre dışı alana mevduat kolesterol üzerindeki protokolü tarafından oluşturulan makrofajlar. monosit kriyoprezervasyonu, monositler, her zaman monositler, bir donörden elde edilebilir olduğunda bağımsız deneyler başlatmak için kullanılabilir. Bu protokol ile devam etmeden önce, monositler cryopreserve için gerekli olmasa da, dondurma daha yuvarlak ve taze monositler kültürlerini başlatmak için kullanılmıştır zaman olduğu gibi yayılımı olmaktan ziyade yayılmış tüm makrofajlarda daha homojen makrofaj kültürleri üretilmemiştir. Biz başarıyla 6 ay, (test uzun süre) kadar dondurulmuş tuttu edildi monositler makrofaj kültürleri yarattı. dondurulan Makr Diğer taraftan, tohumlamaophages kültürüne deneyler için kuyu yeterli makrofaj kültürleri vermedi.
Protokolde kritik adım hemen dimetil sülfoksit ilave edildikten sonra dondurucu monositlerin yerleştirilmesi ve hemen kültür ortamına eritilmiş monositler aktarılması yer alır. onlar kültürün içine numaralı seribaşı önce dondurulmuş hücreler santrifüj yoluyla DMSO kaldırmak için ortak olsa da, biz bu monositlerin başarılı kültüründe gerekli bir adım olduğunu bulamadık. Ancak, araştırmacılar artık DMSO (2 ul / ml) konsantrasyonu yukarıdaki protokolünde kullanılan olandan yüksek ise bunu yapmak gerekebilir. Kültür şişelerinde kendi tohumlama sonrası 48 saat kadar monositler durulama için önemli değildir. Aksi takdirde, bazı monositler Kültür yüzeyine yapışma derecesine bağlı olarak kaybolabilir. Öte yandan, monositler, makrofajları ayırt, makrofajlar yapışması kaldırmak için tripsin uzun süre gerektiren yükselenya da bir hücre kaldırma başlangıç tripsin tedaviden sonra salınmasını kolaylaştırmak için kullanılabilir. monositler çoğalır ve ayırt yoksa, bunun nedeni monosit donör bazı sıradışı özelliği, M-CSF aktivitesinin kaybı veya kullanılan FBS sürü olabilir. Ayrıca, kültürler ortaya çıkmaz olası endişe endotoksin ile reaktiflerin kirlenmesi, makrofaj çoğalmasını 22 önleyen bir maddedir.
M-CSF ile şişelerinde dondurulan monositler Farklılaşan makrofajlar içine toplu farklılaşmasını sağlar. Daha sonra, makrofajlar hasat edilmiş ve deneyler gerçekleştirmek için gereken hücre yoğunluklarında kültür çukurlarında tohumlanmış edilebilir. Deneyler için makrofaj kültürü başlatmak için makrofajların tanımlanan numaraları yerine monositlerin tanımlanan numaralarının kullanılması, arzu edilen hücre yoğunluğu daha tutarlı elde edilebildiği makrofaj kültürleri elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellbind 12-well culture plate | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, T-75 flask, tissue culture treated | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| RPMI 1640 culture medium | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | warmed to 37 °C |
| L-Glutamine | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 375418 | |
| DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Neubauer-improved bright light hemocytometer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX cell freezing container | BioCision | BCS-405 | other freezing containers also should be adequate for this step |
| Liquid Nitrogen Storage System, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | any liquid nitrogen tank should be adequate |
References
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683 (2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
- Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
- Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
- Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
- Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
- Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
- Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
- Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
- Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
- Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
- Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
- Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
- Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
- Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
- Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
- Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).
