Summary
tessuto cardiaco umano alberga popolazioni di cellule precursore perivascolari multipotenti che possono essere adatti per la rigenerazione del miocardio. La tecnica qui descritta permette l'isolamento e la purificazione simultanea di due popolazioni di cellule stromali multipotenti associati con i vasi sanguigni nativi, cioè CD146 + CD34 - periciti e CD34 + CD146 - cellule avventiziale, dal miocardio umano.
Introduction
Il cuore è stato a lungo considerato un organo post-mitotico. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato la presenza di fatturato cardiomiociti limitata nel cuore degli uomini adulti 1. Cellule staminali / progenitrici nativa con cardiomiociti potenziale di differenziazione sono stati individuati all'interno del miocardio in roditori adulti e cuori umani, tra cui Sca-1 +, c-kit +, Cardiosphere di formazione, e, più recentemente, le cellule precursori perivascolari 2,3. Queste cellule rappresentano candidati interessanti per le terapie volte a migliorare cardiaco riparazione / rigenerazione attraverso il trapianto di cellule o la stimolazione della proliferazione in situ.
Staminali mesenchimali / cellule stromali (MSC) sono stati isolati da quasi tutti i tessuti umani 4,5 Studi clinici delle applicazioni terapeutiche di MSC sono state effettuate per molteplici condizioni patologiche quali la riparazione cardiovascolare 6, graft-versus-host-disease 7 8. Effetti benefici sono stati attribuiti alla capacità delle cellule staminali mesenchimali per: a casa per i siti di infiammazione 9; differenziarsi in diversi tipi cellulari 10; secernono molecole pro-riparativi 11; e modulare risposta immunitaria 12. L'isolamento di cellule staminali mesenchimali ha tradizionalmente fatto affidamento su loro adesione preferenziale ai substrati plastici. Tuttavia, la popolazione di cellule risultante è tipicamente marcatamente eterogenea 13. Usando fluorescenza delle cellule attivate (FACS) con una combinazione di marcatori chiave di cellule perivascolari, siamo stati in grado di isolare e purificare un multipotenti MSC-come precursore della popolazione (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) da molteplici tessuti umani, tra cui il muscolo scheletrico adulto e grasso bianco 14.
popolazioni di cellule perivascolari in vari tessuti non-cardiaci hanno dimostrato di avere proprietà staminali / progenitrici a cellulariND sono indagati per uso clinico in ambito cardiovascolare. Periciti, uno dei più noti sottopopolazioni di cellule perivascolari, sono una popolazione eterogenea che svolgono diversi ruoli fisiopatologici compresa nello sviluppo di nuovi vasi 15, la regolazione della pressione sanguigna 16, e il mantenimento dell'integrità vascolare 17,18. Come mostrato in diversi tessuti, specifici sottoinsiemi di periciti nativamente esprimono antigeni MSC e sostenere le loro fenotipi MSC-come in coltura primaria dopo FACS purificazione 14. Inoltre, queste cellule mantengono stabilmente i loro fenotipi a lungo termine all'interno della cultura e mostrano multi-lignaggio potenziale di differenziazione, simile a MSC 19,20. Questi risultati suggeriscono che periciti sono una delle origini della MSC sfuggente 14. Il potenziale terapeutico dei periciti è stata dimostrata con una riduzione cicatrici miocardica e migliorata funzione cardiaca dopo trapianto in ischemically feriticuori 21. Recentemente, abbiamo purificati con successo periciti dal miocardio umano e dimostrato la loro fenotipi MSC-simili e multipotenza (adipogenesi, Condrogenesi e osteogenesi) con l'assenza di miogenesi scheletrico 3. Inoltre, periciti miocardio esposti differenziali capacità potenziali e angiogenici cardiomyogenic se confrontato con le controparti purificati da altri organi.
Una seconda popolazione di cellule staminali / progenitrici multipotenti perivascolari, la cellula avventiziale, è stato isolato da safene umane sulla base di espressione CD34 positivo 22. Cellule avventiziale venose hanno dimostrato di avere un potenziale clonogenico, la capacità di differenziazione mesoderma e potenziale proangiogenico in vitro. Il trapianto di queste cellule nei cuori ischemically feriti di topi ha comportato una riduzione della fibrosi interstiziale, un aumento angiogenesi e flusso miocardico, ridotta dil ventricolarezione, e l'aumento di eiezione cardiaca frazione 23. È interessante notare che le cellule adipose avventiziale hanno dimostrato di perdere l'espressione di CD34 e CD146 upregulate espressione di cultura in risposta al trattamento angiopoietin II, suggerendo l'adozione di un fenotipo pericyte con la stimolazione 24. All'interno del cuore, tuttavia, la popolazione di cellule avventiziale non è ancora stato prospetticamente purificato mediante FACS e / o ben caratterizzato. Utilizzando le procedure di isolamento delle cellule descritte nelle sezioni seguenti, stiamo caratterizzando cellule miocardiche avventiziale e indagare il loro potenziale per applicazioni rigenerative.
Qui si descrive un metodo per isolare e purificare due sottopopolazioni di cellule staminali / progenitrici perivascolari da miocardio fetale o umano adulto. Questo metodo di isolamento delle cellule prospettico permetterà ai ricercatori di ottenere isogenici sottoinsiemi di cellule staminali / progenitrici perivascolari da biopsie cardiache umane per gli studi comparativi e further esplorare il loro potenziale terapeutico in varie condizioni patologiche cardiache.
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Protocol
1. Il trattamento di cardiache umane del campione
- Assicurarsi che tutti i fluidi, contenitori, strumenti, e la zona operativa dedicata sono sterili.
- Posizionare il campione di tessuto cardiaco (ottenuta con la banca dei tessuti o all'équipe chirurgica) nel supporto di memorizzazione composto medio refrigerata di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) contenente 20% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (P / S) sul ghiaccio per il trasporto 3.
- Rimuovere il campione cardiaco dal supporto e lavare con un mezzo di lavaggio costituito da soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) addizionato con 2% FBS e 1% P / S. Quando si maneggia il campione, utilizzare una pinza sottile punta a cogliere le grandi navi o pericardio e ridurre al minimo la frantumazione del miocardio.
- Immergere il campione in media lavaggio in una capsula di Petri e rimuovere il pericardio, endocardio e grandi vasi sanguigni con iris forbici sterilizzati e pinze a punta fine, come descritto 3.
- Tagliare il restante myocardium in piccoli pezzi di circa 1 mm 3 usando una singola lama lato rasoio o con un paio di forbici affilate iris. Nota: alti rendimenti cellulari saranno ottenuti se i campioni vengono elaborati immediatamente. Se il ritardo è inevitabile, conservazione del tessuto cardiaco elaborato nel supporto di memorizzazione fresco (> 5 ml per 1 cm 3 di tessuto) a 4 ° C per un massimo di 72 ore è possibile, tuttavia presumibilmente con una diminuzione associata nella produzione di cellule.
2. La digestione del tessuto e Isolamento di cellule
- Appena il volume della soluzione di digestione comprendente 1,5 ml di collagenasi I, collagenasi II, e IV collagenasi (tutti a 0,5 mg / ml in DMEM) e riscaldare a 37 ° C a bagnomaria.
Nota: Volume e concentrazione di collagenasi sono adatti per i campioni di circa 1 cm 3. - Filtrare i pezzi di tessuto sospesi attraverso un colino micron 100 e lavare due volte con PBS. Trasferire i pezzi di tessuto in un contenitore 30 ml sterile conun coperchio a tenuta stagna.
Nota: brevi ampie pentole piuttosto che tubi alte e strette danno risultati migliori. In alternativa, mettere i pezzi di tessuto in una provetta sterile 50 ml e posizionare orizzontalmente se un contenitore 30 ml non è disponibile. - Aggiungere tutte le soluzioni di digestione (4,5 ml totale) e posizionare il contenitore all'interno di un sacchetto di plastica sigillato in un 37 ° C agitando bagnomaria regolato per 120 giri al minuto. In alternativa, sigillare il contenitore con pellicola di paraffina e mettere in un agitatore orbitale riscaldata impostato a 120 giri al minuto.
- Dopo 15 min, rimuovere e invertire la pentola tre volte prima di sostituire per altri 15 min. Rimuovere e dissetare le collagenasi con 5 ml di DMEM supplementato con il 20% FBS e 1% P / S.
- Triturare il digest pipettando delicatamente dieci a venti volte con una pipetta 10 ml sierologico per rompere eventuali grumi di tessuto. Filtrare la sospensione in modo sequenziale attraverso 100 micron, 70 micron e, infine, 40 filtri cellulari micron per rimuovere i materiali non digeriti e di ottenere una sospensione singola cella.
Nota:Non sciacquare tra filtri cellulari per evitare cellulare debrisgenerated dal processo di digestione enzimatica. - Centrifugare la sospensione cellulare a 200 xg per 4 min, decantare attentamente il supernatante e risospendere il pellet in 1 ml di globuli rossi lisi buffer per 2 minuti a temperatura ambiente prima della diluizione con 4 ml di terreno di lavaggio.
- Ripetere la fase di centrifugazione e risospendere il pellet in 1 ml di terreno di lavaggio. Mescolare bene e prendere 10 ml di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule.
- Mescolare 10 ml di sospensione cellulare con 10 ml di Trypan blue macchia e versare 10 microlitri della miscela su un emocitometro standard per il conteggio delle cellule. Contare il numero di brillanti, cellule rotonde presenti nelle quattro piazze d'angolo (a loro volta suddivise in sedici piccoli quadrati) e dividere per 4 per ottenere la media per quadrato angolo. Moltiplicare il medio da 2 a conto per il fattore di diluizione macchia e poi da 10 4 per ottenere il numero totale di cellule per 1 ml di campione.
- Aggiungere 50 ml di siero di topo alla sospensione cellulare e incubare a 4 ° C per 20 minuti per bloccare legame di anticorpi non specifico.
- Centrifugare la sospensione cellulare con siero di topo a 200 xg per 4 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere in mezzo di lavaggio ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule per 100 microlitri.
- Aliquotare 50 microlitri ciascuno di sospensione cellulare per isotipo e controlli non colorati in due polistirene a fondo rotondo citometria a flusso tubi poi posto il volume rimanente in un terzo tubo per la colorazione multicolore.
- Aggiungere CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, e gli anticorpi CD146-AF647 (tutti 1: 100) per la sospensione singola cella per la colorazione multicolore. Per il controllo isotipico, aggiungere i volumi equivalenti di PE, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- e anticorpi isotipo AF647-coniugati. Delicatamente pipetta per mescolare anticorpi con le cellule e incubare tutte le provette a 4 ° C per 20min al buio.
- Preparare sfere di controllo di compensazione con l'aggiunta di una goccia di perle positive per 100 l di media lavaggio in cinque polistirene tondo tubi citometria a flusso fondo. Aggiungere CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, e gli anticorpi CD146-AF647 (tutti 1: 100) individualmente a ciascuno dei 5 tubi. Incubare tutte le provette a 4 ° C per 20 minuti al buio.
- Durante l'incubazione, preparare tubi di raccolta delle cellule ognuna con 500 ml di Endothelial Growth medio-2 (EGM-2) terreno di coltura e posto a 4 ° C.
- Dopo l'incubazione anticorpo, aggiungere 5 ml di terreno di lavaggio per lavare le cellule e perline al fine di rimuovere l'anticorpo non legato. Centrifugare tutte le provette a 200 xg per 4 minuti. Ripetere la fase di lavaggio e centrifugazione. decantare con cautela il surnatante e pipetta con delicatezza quando le cellule ri-sospensione.
- Risospendere in mezzo di lavaggio ad una concentrazione di circa 1 x 10 6 cellule per 250 microlitri. Risospendere le sfere in 100 ml di lavaggio medium.
- Trasportare tutti sospensioni cellulari e perline al cell sorter in ghiaccio al buio. Aggiungere 1 goccia di perle negative alle provette positive controllo della compensazione di perline e utilizzare questi per impostare la compensazione della fluorescenza.
- Eseguire cellule di controllo non colorate secondo le istruzioni del produttore per stabilire la fluorescenza di fondo e impostare le tensioni al seguente: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. isotipi l'esecuzione dei controlli in base alle istruzioni del produttore per stabilire le soglie di fluorescenza di fondo relative al legame non specifico. Eseguire il multi-colore campione colorato e raccogliere il pericyte e popolazioni di cellule avventiziale nei tubi di raccolta (Figura 1).
NOTA: i rendimenti ottimali cellule vitali sono circa il 3% della dissociazione cellule vive totale per periciti e il 4% per le cellule avventiziale.
Cultura 4. cellulare
- Selezionare adatte piastre di coltura formato secondo l'esito della ordinamento FACS. Aggiungere 100 ml di soluzione sterile di gelatina 0,2% per cm 2 di area di crescita e agitare manualmente per rivestire i pozzetti interi. Incubare le piastre a 4 ° C per 10 minuti e rimuovere completamente soluzione di gelatina. Mantenere cellule raccolte in ghiaccio, mentre la preparazione di piastre di coltura.
Nota: periciti appena ordinati e cellule avventiziale crescono bene quando seminate ad una densità di 30.000 a 40.000 cellule / cm 2 sulla superficie cultura di gelatina rivestita. - Centrifugare le cellule appena raccolti a 200 xg per 4 minuti e delicatamente risospendere il pellet cellulare in una quantità appropriata di EGM-2.Seed le cellule su piastre di gelatina rivestite.
Nota: Il numero effettivo di cellule per essere seminati per pozzetto e la quantità di EGM-2 da aggiungere dipende dalla selezione piatto. Ad esempio, 0,5 ml e 1 ml EGM-2 sono necessari per pozzetto per lastre 48 e 24 pozzetti, rispettivamente. - Scambio EGM-2 per mezzo di crescita delle cellule perivascolari (DMEM integrato con il 20% FBS e 1% P / S) sia per i periciti e cellule avventiziale volta che le cellule si sono stabiliti e aderito alla piastra (dopo almeno 72 ore). Modificare i media ogni 72 ore da allora in poi. Effettuare incubazioni successive iniziali e tutti a 5% di CO 2 e a 37 ° C.
- Separa celle utilizzando lo 0,05% tripsina EDTA quando periciti e cellule avventiziale raggiungono 80 e il 90% di confluenza. Quench con 20% FBS in PBS, centrifugare a 200 xg per 4 min, risospendere in terreno di crescita cellulare perivascolare, e quindi il passaggio delle cellule in un rapporto 1: 3 su piastre di coltura polistirene non rivestite. Da Passaggio 2 in avanti, le cellule di passaggio in un rapporto 1: 5 (o circa 7.000 cellule / cm 2) a piastre di coltura polistirene non rivestite o flaconi.
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Representative Results
singole cellule si distinguevano da detriti e doppiette sulla base delle distribuzioni in avanti e scatter laterale. cellule vive sono stati identificati per la loro incapacità di prendere il colorante DAPI. La strategia di gating è stato scelto sulla base di etichettatura controllo isotipico di questo live, dissociazione whole-cell cardiaca (Figura 1). Dalle cellule vive, cellule CD45 + sono stati gated, seguito da CD56 + cellule. Cellule endoteliali CD144 + sono stati poi rimossi dal CD56 - frazione. Da questa popolazione finale, CD146 + / CD34 - periciti e CD146 - / CD34 + cellule avventiziali stati selezionati e successivamente raccolto (Figura 2). Subito dopo la raccolta delle cellule, un piccolo campione di ciascuna sottopopolazione di cellule (500-1.000) è stato nuovamente eseguito attraverso il selezionatore per confermare che la distribuzione delle cellule era come registrato in una sorta iniziale. Peric infarto FACS-purificato Ytes e cellule avventiziale entrambi mostrano un mandrino ad stellate morfologia delle cellule in coltura (Figura 3).
Figura 1:. FACS strategia di gating punti rappresentativi appezzamenti di controllo isotipico etichettato dissociate cellule del cuore umano illustrano il posizionamento delle porte di ordinamento .. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: FACS Purificazione di cellule miocardiche Perivascolari smistamento Rappresentante delle due sottopopolazioni di cellule precursori perivascolari cardiache da un unico campione del miocardio umano..es / ftp_upload / 54252 / 54252fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Perivascolare morfologia cellulare nella cultura due cardiaci popolazioni di cellule precursore perivascolari, periciti (pannello di sinistra) e le cellule avventiziale (a destra) sono stati allineati per omogeneità con la purificazione FACS e ulteriormente ampliata nella cultura (al passaggio 3, Barre di scala = 50 micron ). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Una crescente evidenza supporta una limitata capacità rigenerativa del cuore umano adulto dopo l'infortunio. Identificazione e caratterizzazione di cellule precursori native responsabili di tali risposte rigenerativa nei cuori feriti sono fondamentali sia per la comprensione dei meccanismi associati e vie di segnalazione e lo sviluppo di approcci di utilizzare queste cellule terapeuticamente.
Protocolli precedenti hanno descritto l'isolamento di sottoinsiemi di cellule precursori perivascolari dal muscolo scheletrico umano 25. Tuttavia, l'applicazione diretta di queste tecniche ai tessuti cardiaci provoca spesso molto scarsa resa cellulari. Di conseguenza, abbiamo fatto ampie modifiche del protocollo, al fine di arricchire le due sottopopolazioni discreti di cellule precursori perivascolari, vale a dire periciti e cellule avventiziale, da biopsie del miocardio umani e per facilitare la purificazione simultanea di entrambi i sottoinsiemi. Isolamento di entrambe le popolazioni cellulari dalle scampione ame non solo ottimizza l'uso delle preziose biopsie di tessuto cardiaco, ma permette anche un confronto diretto dei distinti sottoinsiemi di cellule perivascolari.
Per ottenere la massima resa di cellule, la freschezza del campione di tessuto è di importanza critica. le rese massime di cellule vitali per periciti e le cellule avventiziale sono circa il 3% e il 4% della dissociazione totale cellule vive, rispettivamente. I rendimenti possono variare notevolmente da circa 30.000 a 400.000 cellule per sottoinsieme e fortemente dipendenti da una serie di fattori, tra cui la quantità e la qualità del tessuto di partenza e la durata di conservazione. cellule perivascolari sono relativamente delicati; campioni che mostrano evidenze di cambiamento autolitico invariabilmente cedere il numero di cellule bassi dopo FACS. Analogamente, le cellule perivascolari sono sensibili alle tecniche di digestione rigide, e sovra-digestione anche comportare una ridotta produzione di cellule vitali. regolazione personalizzata del tempo di digestione e la velocità di agitazione possono essere necessari per individuaL laboratori. Infine, l'età del donatore e la dimensione del campione avranno anche importanti ripercussioni sui rendimenti delle cellule.
Abbiamo ampiamente caratterizzato periciti cardiaci così ottenuti 3. Queste cellule hanno dimostrato l'omogeneità di cultura senza contaminazione delle cellule endoteliali. Popolazione tempi di circa 60 ore tra i passaggi 3 e 12 raddoppiando sono stati notati con l'espressione coerente di entrambi i marcatori periciti comuni (fosfatasi alcalina, NG2 e α-SMA) e marcatori MSC classici (CD44, CD73, CD90 e CD105) in questo periodo. Curiosamente, è stato accertato che dopo demetilazione, una frazione di periciti cardiaci espresso la trascrizione cardiomyogenic Fattori Nkx2.5 e GATA4. Quando co-coltura con cardiomiociti neonatali di ratto, una frazione di pericytes cardiaci demetilato espresso la sarcomerica marcatori proteina alfa-actinina e troponina cardiaca T-, con un gruppo minore esibendo ulteriori flussi di calcio citoplasmatici spontanee. Presi insieme, questi risultati suggest che una sottopopolazione di pericytes cardiaci possiede potenzialità cardiomyogenic e, pertanto, può giocare un ruolo nel processo di riparazione intrinseca miocardica. In confronto con periciti, le cellule cardiache avventiziale rimangono in gran parte indefinita. I nostri dati preliminari pubblicati suggeriscono che le cellule cardiache avventiziale esprimono alcuni marcatori periciti quali PDGFR-β e NG2, anche se a livelli inferiori rispetto periciti cardiaci, mentre perdendo CD34 nella cultura. Queste cellule esprimono anche i marcatori MSC classico e mostrano osteogenico e potenziale di differenziazione adipogenico. Ulteriori studi su cellule cardiache avventiziale incluse le proprietà angiogeniche e pro-cardiogeno sono in corso.
Il protocollo qui descritto consente simultanea, prospettico purificazione di periciti cardiaci e le cellule avventiziale da un campione di tessuto cardiaco umano unico. Queste cellule rappresentano popolazioni cardiaco di cellule precursore nuove con potenziali proprietà cardiomyogenic che possono rivelarsi per essere adatto candidates per le future terapie cellulari.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film - Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
References
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