Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة

doi: 10.3791/54252 Published: October 8, 2016

Summary

الأنسجة القلبية الإنسان تؤوي متعددة القدرات ماحول الأوعية السكان الخلية السلائف التي قد تكون مناسبة لتجديد عضلة القلب. تقنية الموضحة هنا يسمح للعزلة في وقت واحد وتنقية اثنين متعددة القدرات سكان الخلية انسجة المرتبطة السفن الأم الدم، أي CD146 + CD34 - pericytes وCD34 + CD146 - خلايا الغلالة البرانية، من عضلة القلب البشري.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد اعتبر قلب لفترة طويلة جهاز بعد الإنقسامية. ومع ذلك، فقد أثبتت الدراسات الحديثة وجود دوران cardiomyocyte محدود في قلوب البشر الكبار 1. كما تم تحديد الأم الخلايا الجذعية / السلف مع cardiomyocyte التمايز المحتملة داخل عضلة القلب في القوارض الكبار وقلوب البشر، بما في ذلك هيئة السلع التموينية-1 ج طقم cardiosphere تشكيل، وكان آخرها، وخلايا السلائف المحيطة بالأوعية 2،3. وتمثل هذه الخلايا المرشحين جذابا للالعلاجات التي تهدف إلى تعزيز القلب إصلاح / تجديد من خلال زرع الخلايا أو التحفيز من الانتشار في الموقع.

وقد تم عزل الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة (MSC) من كل الأنسجة البشرية تقريبا أجريت 4،5 التجارب السريرية من التطبيقات العلاجية للجنة السلامة البحرية خارج عن الحالات المرضية متعددة مثل إصلاح القلب والأوعية الدموية الطعم ضد المضيف المرض 7 8. وقد نسبت آثار مفيدة لقدرة اللجان الدائمة ل: منزل لمواقع التهاب التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا 10؛ تفرز جزيئات الموالية للتعويضية 11؛ وتعدل المضيف الاستجابات المناعية 12. عزل اللجان الدائمة وتعتمد تقليديا على الالتزام تفضيلية لركائز بلاستيكية. ومع ذلك، فإن السكان الناتجة من الخلايا عادة غير متجانسة بشكل ملحوظ (13). باستخدام الفلورسنت خلية تنشيط الفرز (FACS) مع مجموعة من العلامات الرئيسية الخلايا المحيطة بالأوعية، وكنا قادرين على عزل وتنقية تشبه MSC متعددة القدرات السلائف السكان (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) من الأنسجة البشرية متعددة بما في ذلك الكبار العضلات والهيكل العظمي والأبيض الدهون 14.

وقد تبين أن أعداد الخلايا المحيطة بالأوعية في مختلف الأنسجة غير القلب أن لها خصائص الجذعية / خلية سلفية لالثانية يجري التحقيق للاستخدام السريري في الإعداد القلب والأوعية الدموية. Pericytes، واحدة من مجموعات فرعية الخلايا المحيطة بالأوعية الأكثر شهرة، هي مجموعة متغايرة التي تلعب العديد من الأدوار المرضية بما في ذلك تطوير السفن الجديدة 15، وتنظيم ضغط الدم 16، والحفاظ على سلامة الأوعية الدموية 17،18. كما هو مبين في أنسجة متعددة، مجموعات فرعية محددة من pericytes التعبير أصلا المستضدات لجنة السلامة البحرية والحفاظ الظواهر مثل لجنة السلامة البحرية في الثقافة الابتدائية بعد تنقية FACS 14. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا مستقر الحفاظ على الظواهر على المدى الطويل في الثقافة ويحمل متعددة النسب إمكانية التمايز، على غرار اللجان الدائمة 19،20. وتشير هذه النتائج إلى أن pericytes هي واحدة من أصل MSC بعيد المنال 14. وقد تجلى الإمكانات العلاجية من pericytes مع انخفاض في تندب عضلة القلب وتعزيز وظيفة القلب بعد زرع إلى إصابة ischemicallyقلوب 21. في الآونة الأخيرة، ونحن تنقيته بنجاح pericytes من عضلة القلب البشري وأظهرت الظواهر الخاصة مثل لجنة السلامة البحرية وmultipotency (تكون الشحم، تكون الغضروف وتكون العظم) مع غياب تكون العضل الهيكل العظمي 3. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت pericytes عضلة القلب فارق القدرات المحتملة وعائية cardiomyogenic بالمقارنة مع نظرائهم تنقيته من الأجهزة الأخرى.

عدد سكانها الثاني من الخلايا المحيطة بالأوعية متعددة القدرات الجذعية / السلف، الخلية الغلالة البرانية، تم عزل من الأوردة الصافن الإنسان على أساس CD34 إيجابي التعبير 22. وقد تبين أن خلايا الغلالة البرانية الوريدية لديها إمكانات مولد الرمع، والقدرة على التمايز أرومية متوسطة وإمكانات proangiogenic في المختبر. أدى زرع هذه الخلايا في قلوب الجرحى ischemically من الفئران في الحد من التليف الخلالي، وزيادة في الأوعية الدموية وتدفق الدم عضلة القلب، وانخفاض البطين ديلأوجه، وزيادة طرد القلب جزء 23. ومن المثير للاهتمام، وقد ثبت أن الخلايا الدهنية الغلالة البرانية لانقاص التعبير CD34 وupregulate التعبير CD146 في الثقافة في الاستجابة للعلاج angiopoietin الثاني، مما يشير إلى اعتماد النمط الظاهري خلية حوطية مع التحفيز 24. داخل القلب، ومع ذلك، فإن سكان الخلية البرانية لم يتم تنقيته مستقبلي من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية و / أو تتميز بشكل جيد. الاستفادة من إجراءات العزل خلية وصفها في الأقسام التالية، نحن تميز حاليا خلايا عضلة القلب الغلالة البرانية والتحقيق في قدرتها على التجدد التطبيقات.

هنا نحن تصف طريقة لعزل وتنقية اثنين من القطعان من الخلايا الجذعية / السلف المحيطة بالأوعية من البشر عضلة القلب الجنين أو الكبار. وهذا المحتملين طريقة العزلة خلية تمكين الباحثين من الحصول على إسوي المحيطة بالأوعية مجموعات فرعية من الخلايا الجذعية / السلف من الخزعات قلب الإنسان للدراسات المقارنة وابعد من ذلكص استكشاف الإمكانات العلاجية في مختلف الحالات المرضية القلبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تجهيز قلب الإنسان عينة

  1. التأكد من أن جميع السوائل والحاويات، والصكوك، ومنطقة العمليات مخصصة تكون عقيمة.
  2. ضع عينة أنسجة القلب (التي اشترتها بنك الأنسجة أو الفريق الجراحي) في وسائط تخزين تتألف من المتوسطة المبردة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (P / S) على الجليد لنقل 3.
  3. إزالة عينة القلب من وسيلة تخزين ويغسل مع وسيلة غسل تتكون من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع 2٪ FBS و 1٪ P / S. عند التعامل مع العينة، واستخدام الملقط يميل غرامة لفهم السفن الكبيرة أو التامور وتقليل سحق من عضلة القلب.
  4. غمر العينة في غسل المتوسطة في طبق بتري وإزالة التامور، البطانة والأوعية الدموية الكبيرة مع مقص القزحية تعقيمها وملقط يميل غرامة كما هو موضح 3.
  5. قطع myoca المتبقيةrdium إلى قطع صغيرة من حوالي 1 ملم 3 باستخدام شفرة حلاقة واحدة جانبية أو زوج من مقص القزحية الحاد. ملاحظة: سيتم الحصول على أعلى عائدات الخليوي إذا تتم معالجة عينات على الفور. إذا كان تأخير أمر لا مفر منه، وتخزين الأنسجة القلبية معالجتها في وسائط تخزين جديدة (> 5 مل لكل 1 سم 3 الأنسجة) في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة هو ممكن، ولكن من المفترض مع انخفاض المرتبطة بها في العائد الخلية.

2. الهضم من الأنسجة وعزل الخلايا

  1. جعل الطازجة حتى حل الهضم تضم 1.5 مل كل من كولاجيناز الأول، كولاجيناز الثاني، وكولاجيناز الرابع (في كل 0.5 ملغ / مل في DMEM) ودافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    ملاحظة: حجم وتركيز collagenases هي مناسبة لعينات من حوالي 1 سم 3.
  2. تصفية قطع الأنسجة مع وقف التنفيذ من خلال مصفاة ميكرون 100 ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. نقل قطع من الأنسجة إلى معقمة حاوية 30 مل معغطاء مغلقة بإحكام.
    ملاحظة: الأواني واسعة قصيرة بدلا من أنابيب ضيقة طويلة تعطي نتائج أفضل. بدلا من ذلك، وضع قطعة نسيج في أنبوب 50 مل العقيمة ووضع أفقيا إذا حاوية 30 مل غير متوفرة.
  3. إضافة كافة الحلول الهضم (4.5 مل الكل) ووضع الحاويات داخل كيس من البلاستيك مختوم في 37 درجة مئوية حمام ماء تهز مجموعة إلى 120 دورة في الدقيقة. بدلا من ذلك، وختم الحاويات مع فيلم البارافين ومكان في شاكر المداري ساخنة لتعيين 120 دورة في الدقيقة.
  4. بعد 15 دقيقة، وإزالة وعكس وعاء ثلاث مرات قبل استبدال لمدة 15 دقيقة أخرى. إزالة وإخماد collagenases مع 5 مل من DMEM تستكمل مع FBS 20٪ و 1٪ P / S.
  5. يسحن هضم من قبل pipetting بلطف عشرة إلى عشرين مرة مع ماصة 10 مل المصلية لتفريق أي كتل الأنسجة. تصفية بالتتابع تعليق من خلال 100 ميكرون، 70 ميكرون، وأخيرا 40 مصافى خلية ميكرون لإزالة المواد غير المهضومة والحصول على تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: لا شطف بين مصافى الخلية إلى خلية تجنب debrisgenerated من عملية الهضم الانزيم.
  6. الطرد المركزي تعليق خلية في 200 x ج لمدة 4 دقائق، صب بعناية طاف وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من الخلايا الحمراء الناشر عازلة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تمييع مع 4 مل من غسل المتوسطة.
  7. كرر الخطوة الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من غسل المتوسطة. تخلط جيدا ويستغرق 10 ميكرولتر من تعليق خلية لمدة عد الخلايا.
  8. مزيج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان وصمة عار الزرقاء ووضع 10 ميكرولتر من الخليط على عدادة الكريات القياسية لعد الخلايا. حساب عدد الخلايا مشرق، جولة الحالي في الساحات الزاوية الأربعة (كل مقسمة إلى ستة عشر مربعات صغيرة) والقسمة على 4 للحصول على متوسط ​​لكل متر مربع الزاوية. مضاعفة متوسط بنسبة 2 إلى حساب لعامل وصمة عار التخفيف ثم بنسبة 10 4 للحصول على العدد الكلي للخلايا لكل 1 مل من العينة.

= "jove_title"> 3. وسم الخلية والفرز

  1. إضافة 50 ميكرولتر من المصل الماوس إلى تعليق الخلية واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة.
  2. الطرد المركزي تعليق خلية مع مصل الفأر في 200 x ج لمدة 4 دقائق، وإزالة طاف، وإعادة تعليق في غسل المتوسطة بتركيز 1 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر.
  3. قسامة 50 ميكرولتر كل من تعليق خلية لنمط إسوي والضوابط غير ملوثين إلى قسمين البوليسترين جولة القاع تدفق الخلوي أنابيب ثم ضع حجم المتبقية في أنبوب ثالث لتلطيخ متعددة الألوان.
  4. إضافة CD34-PE، CD45-APC-Cy7، CD56-PE-Cy7، CD144-PerCP-Cy5.5، والأجسام المضادة CD146-AF647 (كل 1: 100) إلى تعليق خلية واحدة لتلطيخ متعددة الألوان. لisotype السيطرة، إضافة وحدات يعادل PE-، APC-Cy7-، PE-Cy7-، PerCP-Cy5.5- والأجسام المضادة نمط إسوي AF647 مترافق. بلطف ماصة للمزيج الأجسام المضادة مع الخلايا واحتضان جميع الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 20دقيقة في الظلام.
  5. إعداد حبات تحكم التعويض عن طريق إضافة قطرة واحدة من حبات إيجابية إلى 100 ميكرولتر من غسل المتوسطة في خمس البوليسترين جولة القاع أنابيب التدفق الخلوي. إضافة CD34-PE، CD45-APC-Cy7، CD56-PE-Cy7، CD144-PerCP-Cy5.5، والأجسام المضادة CD146-AF647 (كل 1: 100) كل على حدة من 5 أنابيب. احتضان جميع الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
  6. أثناء الحضانة، وإعداد أنابيب جمع خلية كل منها 500 ميكرولتر من غشائي النمو المتوسطة 2 (EGM-2) ثقافة متوسطة ومكان في 4 درجات مئوية.
  7. وبعد الحضانة الضد، إضافة 5 مل من غسل المتوسطة لغسل الخلايا والخرز من أجل إزالة الأجسام المضادة غير منضم. الطرد المركزي جميع الأنابيب في 200 x ج لمدة 4 دقائق. كرر الخطوة غسل والطرد المركزي. بعناية صب وطاف ماصة بلطف عندما خلايا إعادة تعليق.
  8. إعادة تعليق في غسل المتوسطة بتركيز حوالي 1 × 10 6 خلايا في 250 ميكرولتر. إعادة تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من غسل مedium.
  9. نقل عن تعليق خلية وحبة لفارز خلية على الجليد في الظلام. إضافة 1 قطرة من الخرز السلبية للأنابيب إيجابية تحكم تعويض حبة واستخدام هذه لتعيين تعويض مضان.
  10. تشغيل الخلايا السيطرة غير ملوثين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لتأسيس مضان الخلفية وتعيين الفولتية لما يلي: FSC 150V. SSC 290V. V450 / 50 350V. V710 / 50 620V. B530 / 30 400V. B710 / 50 530V. YG780 / 60 460. R670 / 30 480V. R780 / 60 460V. تشغيل عناصر تحكم isotypes وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لإنشاء العتبات خلفية مضان المتعلقة غير محددة وملزمة. تشغيل متعددة الألوان عينة الملون وجمع خلية حوطية والسكان الخلية البرانية في أنابيب جمع (الشكل 1).
    ملاحظة: الأمثل غلة خلية قابلة للحياة ما يقرب من 3٪ من إجمالي تفكك الخلايا الحية لpericytes و 4٪ للخلايا الغلالة البرانية.

الثقافة 4. خلية

  1. اختيار لوحات ثقافة حجم المناسبة وفقا لنتائج الفرز FACS. إضافة 100 ميكرولتر من العقيمة 0.2٪ محلول الجيلاتين لكل سم 2 من مساحة النمو وتستنهض الهمم يدويا إلى معطف الآبار بأكملها. احتضان لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وإزالة حل الجيلاتين تماما. حفاظ على الخلايا التي تم جمعها على الجليد في حين إعداد لوحات ثقافة.
    ملاحظة: pericytes فرز طازجة وخلايا الغلالة البرانية تنمو جيدا عند المصنف في مناطق ذات كثافة من 30،000 إلى 40،000 خلية / سم 2 على سطح الثقافة المغلفة الجيلاتين.
  2. الطرد المركزي الخلايا التي جمعت حديثا في 200 x ج لمدة 4 دقائق وبلطف إعادة تعليق بيليه خلية في كمية مناسبة من الجمعية العامة غير العادية، 2.Seed الخلايا على لوحات الجيلاتين المغلفة.
    ملاحظة: العدد الفعلي للخلايا أن المصنف لكل بئر وكمية من الجمعية العامة غير العادية-2 التي يمكن ان تضاف تعتمد على اختيار اللوحة. على سبيل المثال، 0.5 مل و 1 مل EGM-2 هناك حاجة لكل بئر لوحات 48- و 24 جيدا على التوالي.
  3. صرف EGM-2 للأجل المتوسط ​​نمو الخلايا ماحول الأوعية (تستكمل DMEM مع FBS 20٪ و 1٪ P / S) لكلا pericytes وخلايا الغلالة البرانية مرة واحدة خلايا استقروا والالتزام بها لوحة (بعد لا يقل عن 72 ساعة). تغيير وسائل الاعلام كل 72 ساعة من الآن فصاعدا. تنفيذ حضانات لاحقة الأولية وكلها في 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
  4. فصل الخلايا باستخدام 0.05٪ التربسين EDTA عندما pericytes وخلايا الغلالة البرانية تصل إلى 80-90٪ التقاء. إخماد مع 20٪ FBS في برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 4 دقائق، وإعادة تعليق في المحيط بالأوعية المتوسطة نمو الخلايا، ومن ثم تمرير الخلايا في نسبة 1: 3 على لوحات ثقافة البوليسترين غير المصقول. من الممر 2 فصاعدا، خلايا مرور في نسبة 1: 5 (أو على حوالي 7000 خلية / سم 2) لوحات ثقافة البوليسترين غير المصقول أو قوارير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتتميز الخلايا واحد من الحطام والحلل على أساس من الأمام والجانب مبعثر التوزيعات. وقد تم تحديد الخلايا الحية وبسبب إخفاقهم في تناول الصبغة دابي. وقد تم اختيار استراتيجية المحاصرة على أساس وضع العلامات isotype السيطرة على هذا الحي، كامل القلب تفكك خلية (الشكل 1). من الخلايا الحية، وبوابات CD45 + الخلايا لأول مرة، تليها CD56 + الخلايا. ثم تم إزالة CD144 + الخلايا البطانية من CD56 - الكسر. من هذه الفئة من السكان النهائي، CD146 + / CD34 - تم اختيار / CD34 + خلايا الغلالة البرانية وبعد ذلك جمعها (الشكل 2) - pericytes وCD146. مباشرة بعد جمع الخلايا، تم إعادة تشغيل عينة صغيرة من مجموعة حيوانية (500-1،000 خلايا) من خلال فارز للتأكد من توزيع الخلايا كان كما هو مسجل في الفرز الأولي. تنقية FACS-بريتش عضلة القلب ytes وخلايا الغلالة البرانية كل من يحمل المغزل إلى النجمية مورفولوجيا الخلايا في الثقافة (الشكل 3).

شكل 1
نأت FACS استراتيجية المحاصرة النقاط المؤامرات التمثيلية للisotype السيطرة المسمى خلايا القلب البشرية توضح المواقع من البوابات الفرز ..: الشكل 1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: FACS تنقية خلايا عضلة القلب المحيطة بالأوعية الفرز الممثل اثنين من القطعان من خلايا السلائف المحيطة بالأوعية القلبية من عينة عضلة القلب بشرية واحدة.وفاق / ftp_upload / 54252 / 54252fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
تم فرز المحيطة بالأوعية خلية الصرف في الثقافة واثنين من القلب ماحول الأوعية السكان الخلية السلائف، pericytes (اللوحة اليسرى) وخلايا الغلالة البرانية (يمين) إلى التجانس من قبل تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية ومزيد من التوسع في الثقافة (في مرور 3 والحانات مقياس = 50 ميكرومتر: الرقم 3. ). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أدلة متزايدة تدعم القدرة على التجدد محدودة من قلب الإنسان الكبار بعد تعافيه من الاصابة. تحديد وتوصيف الخلايا الطليعية الأم مسؤولة عن مثل هذه الردود التجدد في قلوب المصابة حاسمة لكلا فهم الآليات المرتبطة بها ومسارات إشارات ووضع نهج للاستفادة من هذه الخلايا علاجيا.

ووصف البروتوكولات السابقة عزل مجموعات فرعية خلية السلائف المحيطة بالأوعية من العضلات والهيكل العظمي الإنسان 25. ومع ذلك، فإن التطبيق المباشر لهذه التقنيات لأنسجة القلب غالبا ما يؤدي إلى عوائد خلية سيئة للغاية. ونتيجة لذلك، فقد حققنا تعديلات كبيرة على بروتوكول من أجل إثراء اثنين من القطعان منفصلة من خلايا السلائف حول الأوعية، وهي pericytes وخلايا الغلالة البرانية، من الخزعات عضلة القلب الإنسان وتسهيل تنقية في وقت واحد من كل من مجموعات فرعية. عزل كل من السكان خلية من الصورةعينة AME ليس فقط يحسن استخدام الخزعات النسيجية القلب الثمينة ولكنه يسمح أيضا مقارنة مباشرة متميزة فرعية الخلايا المحيطة بالأوعية.

من أجل الحصول على أقصى قدر من العائد من الخلايا، نضارة عينة الأنسجة ذات أهمية حاسمة. أقصى غلة خلية قابلة للpericytes وخلايا الغلالة البرانية ما يقرب من 3٪ و 4٪ من إجمالي تفكك الخلايا الحية على التوالي. قد تختلف المحاصيل بشكل كبير من حوالي 30،000 إلى 400،000 الخلايا لكل فرعية وتعتمد اعتمادا كبيرا على عدد من العوامل، بما في ذلك كمية ونوعية الأنسجة بدء ومدة الحفظ. الخلايا المحيطة بالأوعية حساسة نسبيا. عينات تظهر أدلة على تغير حال ذاتي دائما تسفر عن أرقام الهواتف المحمولة منخفضة بعد FACS. وبالمثل، فإن الخلايا المحيطة بالأوعية حساسة للتقنيات الهضم قاسية، والإفراط في الهضم وتؤدي أيضا إلى انخفاض العائد خلية قابلة للحياة. قد تكون التعديلات مخصصة من الوقت الهضم وسرعة الإثارة اللازمة من قبل individuaمختبرات لتر. وأخيرا، فإن سن المانحة وحجم العينة لديها أيضا تأثيرات كبيرة على عائدات الخلية.

لقد تميزت على نطاق واسع pericytes القلب التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة 3. وأظهرت هذه الخلايا التجانس في الثقافة مع عدم وجود تلوث الخلايا البطانية. وأشار السكان مضاعفة أوقات حوالي 60 ساعة بين الممرات 3 و 12 مع التعبير بما يتفق كل من علامات خلية حوطية المشتركة (الفوسفاتيز القلوية، NG2 وα-SMA) وعلامات السلامة البحرية الكلاسيكية (CD44، CD73، CD90 وCD105) خلال هذه الفترة. ومن المثير للاهتمام، تبين أنه بعد نزع الميثيل، أعرب جزء من pericytes القلب النسخ cardiomyogenic العوامل Nkx2.5 وGATA4. عندما شارك في تربيتها مع العضلية الفئران حديثي الولادة، أعرب جزء من pericytes القلب demethylated والساركومير علامات البروتين ألفا actinin والقلب تروبونين-T، مع مجموعة صغيرة أخرى اظهار عفوية تدفقات الكالسيوم هيولي. أخذت معا، هذه النتائج suggeالحادي وأن جزء من السكان من pericytes القلب يمتلك إمكانات cardiomyogenic وبالتالي قد تلعب دورا في عملية إصلاح عضلة القلب الجوهرية. بالمقارنة مع pericytes، تظل خلايا الغلالة البرانية القلب uncharacterized إلى حد كبير. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أولية غير منشورة أن الخلايا الغلالة البرانية القلب تعبر عن بعض علامات خلية حوطية مثل PDGFR-β وNG2، ولو بمستويات أقل من pericytes القلب، في حين خسر CD34 في الثقافة. هذه الخلايا أيضا التعبير عن علامات السلامة البحرية الكلاسيكية وتظهر المكونة للعظم وإمكانية التفريق مكون الشحم. إجراء المزيد من الدراسات من خلايا الغلالة البرانية القلب بما في ذلك خصائص عائية والمؤيدة قلبية جارية.

بروتوكول صفها هنا يمكن في وقت واحد، وتنقية المحتملين من pericytes القلب وخلايا الغلالة البرانية من عينة أنسجة القلب بشرية واحدة. وتمثل هذه الخلايا رواية السكان الخلية السلائف القلب مع خصائص cardiomyogenic المحتملة التي قد يثبت أنه candidat مناسبةوفاق لعلاجات الخلايا في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit Molecular Probes A-10344
Collagenase I Gibco 17100-017 Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II Gibco 17101-015
Collagenase IV Gibco 17104-019
anti-human CD34-PE BD Pharmingen 555822 Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen 557747 Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
anti-human CD146-AF647 AbD Serotec MCA2141A647 Keep sterile
EGM2-BulletKit Lonza CC-3162 For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate ThermoFischer Scientific 10566-016
Fetal Bovine Serum ThermoFischer Scientific 10500-064 Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin Sigma Aldrich G1393 Dilute with sterile water
IgG1k-PE BD Pharmingen 559320 Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7 BD Pharmingen 557873 Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7 BD Pharmingen 557872 Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
IgG1k-647 AbD Serotec MCA1209A647 Keep sterile
Mouse serum Sigma Aldrich M5905 Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M Sigma Aldrich P7793
Penicillin-Streptomycin Gibco 15979-063 Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4 ThermoFischer Scientific 10010-023 Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max Sigma Aldrich R7757 Keep sterile
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x) Invitrogen 15400-054
 FACSARIA FUSION BD Pharmingen Fluorescence Activated Cell Sorter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324, (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33, (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98, (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94, (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81, (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21, (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15, (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35, (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47, (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20, (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31, (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6, (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51, (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15, (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314, (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67, (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121, (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109, (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21, (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).More

Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter