Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

doi: 10.3791/54252 Published: October 8, 2016

Summary

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 - pericyten en CD34 + CD146 - adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het hart is lang beschouwd als een post-mitotische orgaan. Echter, recente studies de aanwezigheid van cardiomyocyt omzet beperkt bij volwassen menselijk hart 1 aangetoond. Inheemse stam / voorlopercellen met cardiomyocyt differentiatie potentieel zijn ook geïdentificeerd binnen het myocard bij volwassen knaagdieren en menselijke harten, met inbegrip van Sca-1 +, c-kit +, cardiosphere-vorming, en het meest recent, perivasculaire voorlopercellen 2,3. Deze cellen zijn aantrekkelijke kandidaten voor therapieën die gericht zijn op verbetering van cardiale herstel / regeneratie via cel transplantatie of stimulatie van in-situ proliferatie.

Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) zijn geïsoleerd uit bijna alle menselijke weefsels 4,5 Klinische proeven van de therapeutische toepassingen van MSC zijn uitgevoerd voor meerdere pathologische omstandigheden uitgevoerd zoals hart- reparatie 6, graft-versus-host ziekte 7 8. Gunstige effecten zijn toegeschreven aan het vermogen van MSCs tot: huis aan ontstekingsplaatsen 9; differentiëren in verschillende celtypes 10; scheiden pro-herstellende moleculen 11; en moduleren gastheer immuunreacties 12. De isolatie van MSC's is van oudsher vertrouwd op hun preferentiële hechting aan plastic substraten. De resulterende celpopulatie is typisch aanmerkelijk heterogeen 13. Van door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met een combinatie van essentiële perivasculaire celmerkers, konden wij isoleren en zuiveren van een multipotente MSC-achtige precursor populatie (- / CD34 - / CD45 - - / CD56 CD146 + / CD31) geweest meerdere menselijke weefsels waaronder volwassen skeletspier en wit vet 14.

Er is aangetoond perivasculaire cel bevolking in diverse niet-cardiale weefsels stam / voorlopercellen cel eigenschappen van een hebbennd worden onderzocht voor klinisch gebruik bij de cardiovasculaire instelling. Pericyten, een van de meest bekende perivasculaire cel subsets, een heterogene populatie die verschillende pathofysiologische functies, waaronder de ontwikkeling van nieuwe vaten 15 te spelen, de regulatie van de bloeddruk 16 en onderhouden van vasculaire integriteit 17,18. Zoals getoond in verschillende weefsels, specifieke subgroepen van pericytes native uiten MSC antigenen en hun MSC-achtige fenotypes in primaire cultuur in stand te houden na FACS zuivering 14. Bovendien zijn deze cellen die stabiel behouden hun lange termijn fenotypes binnen de cultuur en vertonen multi-lijn differentiatie potentieel, vergelijkbaar met MSC's 19,20. Deze resultaten suggereren dat pericytes zijn een van de oorsprong van de ongrijpbare MSC 14. Het therapeutisch potentieel van pericyten aangetoond met een vermindering van myocardiale littekenvorming en verbeterde hartfunctie na transplantatie in ischemisch gewondenharten 21. Onlangs hebben we met succes gezuiverd pericyten van de menselijke hartspier en koos MSC-achtige fenotypen en multipotent (adipogenese, chondrogenese en osteogenese) het ontbreken van skelet myogenesis 3. Bovendien vertoonden myocardiale pericyten cardiomyogene differentiële potentie en angiogene capaciteit vergeleken met tegenhangers gezuiverd van andere organen.

Een tweede populatie van multipotente perivasculaire stam / progenitorcellen, de adventitia cel, is geïsoleerd uit menselijke aderen op basis van positieve CD34 expressie 22. Veneuze adventitia-cellen is aangetoond dat potentiële klonale, mesodermale differentiatievermogen en pro-angiogene potentieel in vitro hebben. Transplantatie van deze cellen in het ischaemisch gewonden harten van muizen resulteerde in een afname van interstitiële fibrose, een toename van angiogenese en myocardiale bloedstroom, verminderde ventriculaire dilatie, en verhoogde cardiale ejectiefractie 23. Interessant is dat vetweefsel adventitia cellen is aangetoond dat CD34 expressie te verliezen en upregulate CD146 expressie in cultuur in reactie op angiopoietine II behandeling, wat suggereert dat de goedkeuring van een pericyte fenotype met stimulering 24. In het hart, maar de adventitia celpopulatie nog niet prospectief gezuiverd door FACS en / of goed gekarakteriseerd. Gebruik makend van de cel isolatie procedures in de volgende gedeelten worden beschreven, zijn we momenteel karakteriseren myocard adventitia cellen en het onderzoeken van hun potentieel voor regeneratieve toepassingen.

Hierin beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en zuiveren twee subpopulaties van perivasculaire stam / progenitorcellen uit humaan foetaal of volwassen myocardium. Deze prospectieve cel isolatie methode zal onderzoekers in staat stellen om isogene perivasculaire stamcellen / voorlopercellen cel subsets van menselijk hart biopsieën voor vergelijkende studies en furthe verkrijgenr verkennen hun therapeutisch potentieel in diverse cardiale pathologische omstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. De verwerking van de Mens Cardiac Sample

  1. Zorg ervoor dat alle vloeistoffen, containers, instrumenten, en de specifieke operationele gebied zijn steriel.
  2. Plaats het hartweefsel monster (verkregen door de weefselbank of chirurgische team) in opslagmedium samengesteld gekoeld Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) dat 20% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (P / S) op ijs 3 transport.
  3. Verwijder de cardiale monster uit het opslagmedium en was met een wasmedium uit fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% FBS en 1% P / S. Bij het hanteren van het monster, maken gebruik van fijne getipt tang om grote schepen of hartzakje te grijpen en het minimaliseren van het breken van het myocard.
  4. Dompel het monster in wasmedium in een petrischaaltje en verwijder het hartzakje, endocardium en grote bloedvaten met gesteriliseerd iris schaar en fijne punt tang zoals beschreven 3.
  5. Snijd de resterende myocardium in kleine stukjes van ongeveer 1 mm3 met een enkelzijdig scheermes of een paar scherpe irisschaar. Let op: Hoogste cel opbrengst zal worden verkregen als de monsters direct worden verwerkt. Als dit niet mogelijk is, opslaan van de bewerkte hartweefsel in de verse opslagmedium (> 5 ml per 1 cm3 weefsel) bij 4 ° C gedurende maximaal 72 uur kan echter vermoedelijk met een bijbehorende afname van de opbrengst cel.

2. Spijsvertering van het weefsel en isolatie van cellen

  1. Vers vormen de vertering oplossing die 1,5 ml van collagenase I, collagenase II en IV collagenase (alle op 0,5 mg / ml in DMEM) en opwarmen tot 37 ° C in een waterbad.
    Opmerking: volume en concentratie van collagenasen zijn geschikt voor monsters van ongeveer 1 cm 3.
  2. Filter de geschorste weefsel stukken door een 100 um zeef en tweemaal wassen met PBS. Breng de stukken weefsel naar een steriele 30 ml container meteen goed afgesloten deksel.
    Opmerking: Korte brede potten in plaats van lange smalle buizen betere resultaten geven. Als alternatief zet weefselstukken in een steriele 50 ml buis en plaats horizontaal als een houder 30 ml afgesloten.
  3. Voeg alle spijsvertering oplossingen (4,5 ml totaal) en de container in een afgesloten plastic zak te plaatsen in een 37 ° C schuddend waterbad ingesteld op 120 rpm. Als alternatief, sluit de container met paraffine film en plaats in een verwarmde rondschudapparaat ingesteld op 120 rpm.
  4. Na 15 minuten, te verwijderen en draai de pot drie keer voordat het vervangen voor een verdere 15 min. Verwijder de collagenasen blussen met 5 ml DMEM aangevuld met 20% FBS en 1% P / S.
  5. Vermaal het digest door voorzichtig pipetteren tien tot twintig keer met 10 ml serologische pipet te breken elk weefsel klonten. Filtreer de suspensie achtereenvolgens tot 100 urn, 70 urn en 40 urn cel uiteindelijk zeven onverteerd materiaal te verwijderen en het verkrijgen van een enkele celsuspensie.
    Notitie:Niet uitspoelen tussen cel zeven naar cel debrisgenerated door het enzym verteringsproces te voorkomen.
  6. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 xg gedurende 4 minuten, voorzichtig de bovenstaande en resuspendeer de pellet in 1 ml erytrocyten lysisbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur vóór het verdunnen met 4 ml van wasmedium.
  7. Centrifugeer nogmaals stap en resuspendeer de pellet in 1 ml van wasmedium. Meng goed en neem 10 ul van de celsuspensie voor celtelling.
  8. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 pi van trypan blauwe vlekken en plaats 10 pi van het mengsel op een standaard hemocytometer voor celtelling. Tel het aantal lichte, ronde cellen aanwezig in de vier hoeken vierkantjes (elk onderverdeeld in zestien vierkantjes) en 4 delen door het gemiddelde per hoekveld krijgen. Vermenigvuldig het gemiddelde van 2 tot vertegenwoordigen de vlek verdunningsfactor en vervolgens met 10 4 tot het totale aantal cellen per 1 ml monster te verkrijgen.

  1. Voeg 50 ul muizenserum aan de celsuspensie en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 min om niet-specifiek antilichaam blokkeert binding.
  2. Centrifugeer de celsuspensie met muizenserum bij 200 xg gedurende 4 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer in wasmedium in een concentratie van 1 x 10 6 cellen per 100 pl.
  3. Aliquot 50 pi elk van de celsuspensie voor de isotype controles en ongekleurde in twee polystyreen rondbodem flowcytometrie buizen plaats dan het resterende volume in een derde buis voor multi-kleur-kleuring.
  4. Voeg CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 en CD146-AF647 antilichamen (alle 1: 100) naar de enkele celsuspensie voor multi-color vlekken. Voor de isotype controle, voeg equivalente volumes van PE, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- en AF647-geconjugeerd isotype antilichamen. Voorzichtig pipet om de antilichamen met de cellen te mengen en incuberen alle buizen bij 4 ° C gedurende 20min in het donker.
  5. Bereid compensatieregeling kralen door één druppel positieve kralen 100 ul wasmedium in vijf rondbodem polystyreen stroomcytometrie buizen. Add CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 en CD146-AF647 antilichamen (alle 1: 100) afzonderlijk aan elk van de 5 buizen. Incubeer alle buizen bij 4 ° C gedurende 20 minuten in het donker.
  6. Tijdens de incubatie bereiden cel verzamelbuizen elk 500 pi groeimedium Endotheel-2 (EGM-2) kweekmedium en bij 4 ° C.
  7. Na antilichaam incubatie, voeg 5 ml van wasmedium aan cellen en kralen wassen om ongebonden antilichaam te verwijderen. Centrifugeer alle buizen bij 200 g gedurende 4 min. Herhaal het wassen en centrifugeren stap. decanteren voorzichtig het supernatant en pipet voorzichtig bij het opnieuw schorsing van cellen.
  8. Resuspendeer in wasmedium in een concentratie van ongeveer 1 x 10 6 cellen per 250 pl. Resuspendeer de kralen in 100 ul wassen medium.
  9. Vervoeren alle cel en kraal schorsingen aan de cel sorter op ijs in het donker. Voeg 1 druppel negatieve kralen om de positieve kraal compensatieregeling, buizen en deze gebruiken om de fluorescentie schadevergoeding in te stellen.
  10. Run ongekleurde controlecellen volgens de instructies van de fabrikant om de achtergrondfluorescentie vast en zet de spanningen op: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. Run isotypen controles volgens de instructies van de fabrikant om de achtergrondfluorescentie drempelwaarden met betrekking tot niet-specifieke binding vast te stellen. Run multi-color gekleurde monster en verzamel de pericyte en adventitia celpopulaties in de verzamelbuizen (figuur 1).
    OPMERKING: Optimale levensvatbare cellen levert ongeveer 3% van de totale levende cel dissociatie van pericyten en 4% voor adventitia-cellen.

4. Cell Culture

  1. Kies geschikte grootte kweekplaten basis van de resultaten van de FACS-sortering. Voeg 100 ul van steriel 0,2% gelatine-oplossing per cm2 groeigebied en de hand schudden om de vacht van de hele putten. Incubeer de platen bij 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder gelatineoplossing volledig. Houd verzamelde cellen op ijs bij het voorbereiden kweekplaten.
    Opmerking: Vers gesorteerd pericyten en adventitia cellen groeien goed wanneer gezaaid met een dichtheid van 30.000 tot 40.000 cellen / cm2 op met gelatine gecoate kweekoppervlak.
  2. Centrifugeren vers verzamelde cellen bij 200 g gedurende 4 min en voorzichtig resuspendeer de celpellet in een geschikte hoeveelheid EGM-2.Seed de cellen op met gelatine beklede platen.
    Opmerking: Het werkelijke aantal cellen worden geënt per putje en de hoeveelheid EGM-2 toegevoegd worden afhankelijk van de maaltijdschotels. Bijvoorbeeld 0,5 ml en 1 ml EGM-2 nodig per putje van 48- en 24-well platen resp.
  3. Exchange EGM-2 voor perivasculaire celgroei medium (DMEM aangevuld met 20% FBS en 1% P / S) voor zowel pericyten en adventitia cellen eenmaal cellen geregeld en gehecht aan de plaat (na minimaal 72 uur). Wijzig de media elke 72 uur vanaf dat moment. Uitvoeren van eerste en alle volgende incubaties in 5% CO2 en bij 37 ° C.
  4. Cellen losmaken behulp 0,05% trypsine EDTA bij pericyten en adventitia cellen bereikt 80 tot 90% confluentie. Blussen met 20% FBS in PBS, centrifuge bij 200 xg gedurende 4 min, resuspendeer in perivasculaire celkweekmedium, en de passage cellen bij een 1: 3 verhouding op ongecoate polystyreen kweekplaten. Passage van 2 ingang passage cellen bij een 1: 5 verhouding (of bij ongeveer 7000 cellen / cm2) tot ongecoate polystyreen kweekplaten of flessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Enkele cellen werden onderscheiden van puin en doubletten op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing distributies. Levende cellen werden geïdentificeerd door hun falen te maken van de DAPI kleurstof. De gating strategie werd gekozen op basis van isotype controle etikettering van deze levende, hele hartcel dissociatie (figuur 1). Vanuit de levende cellen, werden CD45 + cellen eerst gated out, gevolgd door CD56 + cellen. CD144 + endotheliale cellen werden daarna verwijderd uit de CD56 - fractie. Van deze laatste populatie, CD146 + / CD34 - pericytes en CD146 - werden / CD34 + adventitia cellen geselecteerd en vervolgens verzameld (figuur 2). Onmiddellijk na cel collectie, een kleine steekproef van elke subpopulatie (500-1.000 cellen) werd opnieuw uit te voeren door middel van de sorter aan dat de distributie cel was zoals vastgelegd in de eerste soort te bevestigen. FACS-gezuiverde myocardiale peric Ytes en adventitia cellen vertonen zowel een spindel naar cel morfologie in de cultuur (figuur 3) stellaatcellen.

Figuur 1
Figuur 1:. FACS Gating Strategy Vertegenwoordiger puntjes percelen van isotype controle gemerkt gescheiden menselijk hart cellen illustreren de positionering van het soort poorten .. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Zuivering van FACS Myocardiale cellen Perivasculaire Vertegenwoordiger sortering van de twee subpopulaties van cardiale perivasculaire precursorcellen uit een enkel menselijk myocard monster..es / ftp_upload / 54252 / 54252fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3:. Perivasculaire Cell morfologie in Cultuur De twee cardiale Perivasculaire precursor celpopulaties, pericyten (linker paneel) en adventitia cellen (rechts) werden gesorteerd tot homogeniteit door FACS zuivering en verder uitgebreid in kweek (bij passage 3, Schaal bars = 50 pm ). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Steeds meer bewijs ondersteunt een beperkte regeneratieve capaciteit van de volwassen menselijk hart na een blessure. Identificatie en karakterisatie van natief precursorcellen verantwoordelijk zijn voor dergelijke regeneratieve respons gewonde harten essentieel voor zowel het begrijpen van geassocieerde mechanismen en signaalwegen en de ontwikkeling van benaderingen van deze cellen therapeutisch gebruik.

Vorige protocollen zijn de isolatie van perivasculaire voorloper cel subsets beschreven uit menselijke skeletspier 25. De directe toepassing van deze technieken hartweefsel resulteert vaak in slechte opbrengsten cel. We hebben daarom grote aanpassingen aan het protocol geleverd om twee afzonderlijke subpopulaties van perivasculaire precursorcellen, namelijk pericyten en adventitia-cellen uit humane myocardiale biopsies verrijken en de gelijktijdige zuivering van beide subgroepen vergemakkelijken. Isolatie van beide celpopulaties van de same monster niet alleen optimaal gebruik van kostbare hartweefsel biopsieën, maar maakt het ook mogelijk directe vergelijking van verschillende perivasculaire cel subsets.

Teneinde de maximale opbrengst aan cellen te verkrijgen, de versheid van het weefselmonster is van cruciaal belang. Maximale levensvatbare cel opbrengst van pericyten en adventitia cellen ongeveer 3% en 4% van de totale levende cel dissociatie. Opbrengsten kunnen sterk variëren van ongeveer 30.000 tot 400.000 cellen per subgroep en zijn sterk afhankelijk van een aantal factoren, waaronder de hoeveelheid en kwaliteit van het uitgangsweefsel en de duur bewaring. Perivasculaire cellen zijn relatief gevoelig; monsters die tekenen van autolytisch verandering steevast op laag aantal cellen na FACS. Evenzo perivasculaire cellen gevoelig aan ruw spijsvertering technieken en over-digestie zal ook resulteren in een verminderde opbrengst levensvatbare cel. Aangepaste instellingen van de spijsvertering tijd en agitatie snelheid nodig door individua zijnl laboratoria. Ten slotte zal de donor leeftijd en steekproefgrootte hebben ook grote invloed op de mobiele opbrengsten.

Wij hebben uitgebreid gekarakteriseerd cardiale pericyten aldus verkregen 3. Deze cellen aangetoond homogeniteit in de cultuur zonder endotheelcellen besmetting. Populatieverdubbelingstijd tijden van ongeveer 60 uur tussen passages 3 en 12 werden geconstateerd met de consequente uitdrukking van zowel de gemeenschappelijke pericyte markers (alkalische fosfatase, NG2 en α-SMA) en de klassieke MSC merkers (CD44, CD73, CD90 en CD105) over deze periode. Intrigerend genoeg werd vastgesteld dat na demethylering, een fractie van cardiale pericytes sprak de cardiomyogene transcriptiefactoren en Nkx2.5 GATA4. Als co-gekweekt met neonatale rat cardiomyocyten, een fractie van gedemethyleerde cardiale pericytes sprak de sarcomeer eiwit markers alpha-actinine en cardiale troponine-T, met een kleine groep verder exposeren spontane cytoplasma calcium stromen. Tezamen bieden deze bevindingen suggest dat een subpopulatie van cardiale pericyten bezit cardiomyogene mogelijkheden en dus mogelijk een rol bij de intrinsieke myocardiale herstelproces spelen. In vergelijking met pericytes, cardiale adventitia cellen blijven grotendeels uncharacterized. Onze gepubliceerde voorlopige gegevens suggereren dat cardiale adventitia cellen brengen sommige pericyte markers zoals PDGFR-β en NG2, zij het op een lager niveau dan cardiale pericytes, terwijl het verliezen van CD34 in de cultuur. Deze cellen ook de expliciete klassieke MSC markers en toon osteogene en adipogene differentiatie potentieel. Verdere studies van cardiale adventitia cellen met inbegrip van angiogene en pro-cardiogene eigenschappen zijn aan de gang.

De hier beschreven protocol maakt gelijktijdige toekomstige zuivering van cardiale pericytes en adventitia cellen uit een enkel menselijk hartweefsel monster. Deze cellen vormen roman cardiale voorloper cel populaties met potentiële cardiomyogene eigenschappen die kunnen blijken te zijn geschikt candidates voor toekomstige celtherapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit Molecular Probes A-10344
Collagenase I Gibco 17100-017 Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II Gibco 17101-015
Collagenase IV Gibco 17104-019
anti-human CD34-PE BD Pharmingen 555822 Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen 557747 Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
anti-human CD146-AF647 AbD Serotec MCA2141A647 Keep sterile
EGM2-BulletKit Lonza CC-3162 For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate ThermoFischer Scientific 10566-016
Fetal Bovine Serum ThermoFischer Scientific 10500-064 Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin Sigma Aldrich G1393 Dilute with sterile water
IgG1k-PE BD Pharmingen 559320 Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7 BD Pharmingen 557873 Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7 BD Pharmingen 557872 Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
IgG1k-647 AbD Serotec MCA1209A647 Keep sterile
Mouse serum Sigma Aldrich M5905 Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M Sigma Aldrich P7793
Penicillin-Streptomycin Gibco 15979-063 Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4 ThermoFischer Scientific 10010-023 Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max Sigma Aldrich R7757 Keep sterile
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x) Invitrogen 15400-054
 FACSARIA FUSION BD Pharmingen Fluorescence Activated Cell Sorter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324, (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33, (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98, (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94, (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81, (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21, (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15, (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35, (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47, (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20, (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31, (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6, (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51, (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15, (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314, (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67, (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121, (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109, (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21, (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).More

Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter