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Developmental Biology

मानव हृदय के ऊतकों से Perivascular multipotent अग्रदूत सेल आबादी के अलगाव

doi: 10.3791/54252 Published: October 8, 2016

Summary

मानव हृदय के ऊतकों multipotent परिवाहकीय अग्रदूत सेल आबादी है कि दौरे के उत्थान के लिए उपयुक्त हो सकता है बंदरगाहों। Pericytes और CD34 + CD146 - - adventitial कोशिकाओं, मानव मायोकार्डियम से तकनीक यहाँ वर्णित एक साथ अलगाव और दो multipotent stromal सेल मूल निवासी रक्त वाहिकाओं, यानी CD146 + CD34 के साथ जुड़े आबादी की शुद्धि के लिए अनुमति देता है।

Introduction

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दिल लंबे समय से एक बाद mitotic अंग माना गया है। हालांकि, हाल के अध्ययनों से वयस्क मानव मन 1 में सीमित cardiomyocyte कारोबार की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है। Cardiomyocyte भेदभाव क्षमता के साथ मूल निवासी स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं को भी परिवाहकीय अग्रदूत साबित कोशिकाओं 2,3 वयस्क कृंतक और मानव मन, सहित Sca -1 +, सी-किट +, cardiosphere के गठन में मायोकार्डियम में पहचाना गया है, और सबसे हाल ही में,। इन कोशिकाओं को सेल प्रत्यारोपण या में सीटू प्रसार की उत्तेजना के माध्यम से हृदय की मरम्मत / उत्थान बढ़ाने के उद्देश्य से उपचार के लिए आकर्षक उम्मीदवारों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (एमएससी) इस तरह के हृदय की मरम्मत 6 के रूप में लगभग हर मानव ऊतक 4,5 एमएससी की चिकित्सीय अनुप्रयोगों के नैदानिक परीक्षणों कई रोग की स्थिति के लिए बाहर किया गया है से पृथक किया गया है, भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग 7 8। लाभदायक प्रभाव के लिए MSCS की क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है: सूजन 9 की साइटों के लिए घर; विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अंतर 10; समर्थक विरोहक अणुओं 11 छिपाना; और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 12 मिलाना। MSCs के अलगाव के पारंपरिक रूप से प्लास्टिक substrates के लिए उनकी तरजीही पालन पर भरोसा किया है। हालांकि, कोशिकाओं के परिणामस्वरूप जनसंख्या आम तौर पर स्पष्ट रूप से heterogenous 13 है। से फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल कुंजी परिवाहकीय सेल मार्कर के संयोजन के साथ छँटाई (FACS) का उपयोग करके, हम अलग और एक multipotent एमएससी की तरह अग्रदूत आबादी (- / CD34 - / CD45 - - / CD56 CD146 + / CD31) को शुद्ध करने के लिए सक्षम किया गया है वयस्क कंकाल की मांसपेशी और सफेद वसा 14 सहित कई मानव ऊतकों।

विभिन्न गैर-हृदय के ऊतकों में Perivascular सेल आबादी स्टेम / पूर्वज सेल गुण एक है दिखाया गया हैएन डी हृदय में स्थापित करने में नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए जांच की जा रही है। Pericytes, सबसे अच्छी तरह से जाना जाता है perivascular सेल सबसेट में से एक, एक विषम आबादी है कि नए जहाजों 15 के विकास में सहित कई pathophysiological भूमिका निभाते हैं, रक्तचाप 16, और संवहनी अखंडता 17,18 के रखरखाव के विनियमन। के रूप में कई ऊतकों में दिखाया गया है, pericytes के विशिष्ट सबसेट natively एमएससी एंटीजन व्यक्त करने और FACS शुद्धि 14 के बाद प्राथमिक संस्कृति में अपनी एमएससी की तरह phenotypes बनाए। इसके अलावा, इन कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक संस्कृति के भीतर उनके दीर्घकालिक phenotypes को बनाए रखने और बहु-वंश भेदभाव क्षमता, MSCs 19,20 के समान दिखा रहे हैं। इन परिणामों का सुझाव है कि pericytes मायावी एमएससी 14 के मूल में से एक हैं। pericytes की चिकित्सीय क्षमता दौरे scarring में कमी के साथ प्रदर्शन किया और प्रत्यारोपण के बाद हृदय समारोह बढ़ाया में ischemically घायल हो गया हैदिलों को 21। हाल ही में, हम सफलतापूर्वक मानव मायोकार्डियम से pericytes शुद्ध और कंकाल myogenesis 3 के अभाव के साथ अपनी एमएससी की तरह phenotypes और multipotency (वसाजनन, उपास्थिजनन और osteogenesis) का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, मायोकार्डियल pericytes जब अन्य अंगों से शुद्ध समकक्षों के साथ तुलना में अंतर cardiomyogenic क्षमता और एन्जियोजेनिक क्षमता का प्रदर्शन किया।

Multipotent perivascular स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं, adventitial सेल का एक दूसरा आबादी, सकारात्मक CD34 अभिव्यक्ति 22 के आधार पर मानव saphenous नसों से अलग-थलग कर दिया गया है। शिरापरक adventitial कोशिकाओं clonogenic क्षमता, mesodermal भेदभाव क्षमता और इन विट्रो में proangiogenic संभावित है दिखाया गया है। चूहों के ischemically घायल दिलों में इन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण मध्य फाइब्रोसिस में कमी, angiogenesis और मायोकार्डियल रक्त के प्रवाह में वृद्धि, कम वेंट्रिकुलर दिल में हुईसमझना, और वृद्धि की हृदय इंजेक्शन फ्रैक्शन 23। दिलचस्प है, वसा कोशिकाओं adventitial CD34 अभिव्यक्ति खो और angiopoietin द्वितीय उपचार के जवाब में संस्कृति में CD146 अभिव्यक्ति upregulate, उत्तेजना 24 के साथ एक pericyte phenotype के गोद लेने का सुझाव करने के लिए दिखाया गया है। दिल के भीतर, तथापि, adventitial सेल की आबादी नहीं अभी तक भावी FACS और / या अच्छी तरह से होती द्वारा शुद्ध किया गया है। सेल अलगाव प्रक्रियाओं का पालन वर्गों में वर्णित का उपयोग, हम वर्तमान दौरे adventitial कोशिकाओं निस्र्पक और पुनर्योजी अनुप्रयोगों के लिए अपनी क्षमता की जांच कर रहे हैं।

इस के साथ साथ हम अलग और मानव भ्रूण या वयस्क मायोकार्डियम से perivascular स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के दो उप-जनसंख्या को शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन। इस संभावित सेल अलगाव विधि शोधकर्ताओं तुलनात्मक अध्ययन और furthe के लिए मानव हृदय बायोप्सी से isogenic perivascular स्टेम / पूर्वज सेल सबसेट प्राप्त करने के लिए सक्षम हो जाएगाआर विभिन्न हृदय रोग की स्थिति में उनके चिकित्सीय क्षमता का पता लगाने।

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Protocol

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1. मानव हृदय नमूना के प्रसंस्करण

  1. सुनिश्चित करें कि सभी तरल पदार्थ, कंटेनर, उपकरणों, और समर्पित परिचालन क्षेत्र बाँझ कर रहे हैं।
  2. कार्डियक ऊतक का नमूना भंडारण माध्यम में ठंडा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) बर्फ पर युक्त से बना (ऊतक बैंक या शल्य चिकित्सा टीम द्वारा प्राप्त) की जगह परिवहन 3 के लिए।
  3. भंडारण माध्यम से हृदय नमूना निकालें और एक कपड़े धोने मध्यम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 2% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक की रचना से धो लें। जब नमूना हैंडलिंग, बड़े जहाजों या पेरीकार्डियम समझ और मायोकार्डियम की पेराई कम करने के लिए ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग करें।
  4. एक पेट्री डिश में मध्यम धोने में नमूना डूब और के रूप में वर्णित 3 निष्फल आईरिस कैंची और ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ पेरीकार्डियम, अंतर्हृदकला और बड़े रक्त वाहिकाओं को हटा दें।
  5. शेष myoca कटलगभग 1 मिमी 3 के छोटे टुकड़े एक ही पक्ष धार या तेज आईरिस कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करने में rdium। नोट: यदि नमूने तुरंत कार्रवाई की जाती है सर्वोच्च सेल पैदावार प्राप्त किया जाएगा। एक देरी अपरिहार्य है, तो नए सिरे से भंडारण माध्यम में संसाधित हृदय के ऊतकों के भंडारण (> 1 सेमी 3 ऊतक प्रति 5 एमएल) अप करने के लिए 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संभव हालांकि शायद सेल उपज में एक संबद्ध गिरावट के साथ है।

2. ऊतकों और कोशिकाओं के अलगाव की पाचन

  1. हौसले से 1.5 मिलीलीटर जिसमें पाचन समाधान को बनाने के collagenase के प्रत्येक रहा, collagenase द्वितीय, और collagenase चतुर्थ (सभी DMEM में 0.5 मिलीग्राम / एमएल) और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एक waterbath में।
    नोट: वॉल्यूम और collagenases की एकाग्रता लगभग 1 सेमी 3 के नमूने लिए उपयुक्त हैं।
  2. एक 100 माइक्रोन झरनी के माध्यम से निलंबित कर दिया ऊतक के टुकड़े फिल्टर और पीबीएस के साथ दो बार धोने। के साथ एक बाँझ 30 मिलीलीटर कंटेनर के लिए ऊतक टुकड़े स्थानांतरणएक कसकर बंद ढक्कन।
    नोट: लघु विस्तृत बजाय बर्तन लंबा संकीर्ण ट्यूब बेहतर परिणाम देती है। वैकल्पिक रूप से, एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक टुकड़े डाल दिया है और क्षैतिज जगह अगर एक 30 मिलीलीटर कंटेनर उपलब्ध नहीं है।
  3. सभी पाचन समाधान (4.5 मिलीलीटर कुल) जोड़ें और एक 37 डिग्री सेल्सियस मिलाते हुए पानी से स्नान 120 rpm के लिए सेट में एक मोहरबंद प्लास्टिक बैग के भीतर कंटेनर जगह है। वैकल्पिक रूप से, एक गर्म कक्षीय प्रकार के बरतन 120 rpm के लिए सेट में पैराफिन फिल्म और जगह के साथ कंटेनर सील।
  4. 15 मिनट के बाद, हटाने और एक और 15 मिनट के लिए जगह पहले पॉट तीन बार पलटना। निकालें और 20% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक DMEM के 5 मिलीलीटर के साथ collagenases बुझा लेते हैं।
  5. धीरे से एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट किसी भी ऊतक clumps को तोड़ने के साथ दस से बीस बार pipetting द्वारा डाइजेस्ट Triturate। 100 माइक्रोन के माध्यम से निलंबन क्रमिक रूप से फिल्टर, 70 माइक्रोन और अंत में 40 माइक्रोन सेल strainers पचाया सामग्री हटाने और एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए।
    ध्यान दें:सेल झरनी के बीच कुल्ला एंजाइम पाचन प्रक्रिया द्वारा debrisgenerated सेल से बचने के लिए नहीं है।
  6. अपकेंद्रित्र 4 मिनट के लिए 200 XG पर सेल निलंबन, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला छानना और मध्यम धोने के 4 मिलीलीटर के साथ गिराए से पहले लाल सेल कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए बफर lysing के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित।
  7. centrifugation कदम दोहराएँ और मध्यम धोने के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित। अच्छी तरह मिक्स और सेल गिनती के लिए सेल निलंबन के 10 μl ले।
  8. Trypan नीले दाग के 10 μl के साथ सेल निलंबन के 10 μl मिक्स और सेल गिनती के लिए एक मानक hemocytometer पर मिश्रण के 10 μl जगह है। 4 से चार कोने वर्गों में मौजूद उज्ज्वल, गोल कोशिकाओं की संख्या (प्रत्येक सोलह छोटे वर्गों में विभाजित) और विभाजन गणना कोने वर्ग प्रति मतलब पाने के लिए। दाग कमजोर पड़ने कारक के लिए खाते में 2 से मतलब गुणा और फिर 10 4 नमूने के 1 मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की कुल संख्या प्राप्त करने के द्वारा।

  1. सेल निलंबन के लिए माउस सीरम के 50 μl जोड़ें और 20 मिनट के गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी को ब्लॉक करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. अपकेंद्रित्र 4 मिनट के लिए 200 XG पर माउस सीरम के साथ सेल निलंबन, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 100 μl प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में मध्यम धोने में फिर से निलंबित।
  3. अशेष दो polystyrene दौर नीचे में 50 μl निर्धारण और बेदाग नियंत्रण के लिए सेल निलंबन के प्रत्येक प्रवाह cytometry ट्यूबों तो बहु रंग धुंधला के लिए एक तिहाई ट्यूब में शेष मात्रा जगह है।
  4. (: 100 सभी 1) बहु रंग धुंधला के लिए एकल कक्ष निलंबन के लिए CD34-पे, CD45 एपीसी-Cy7, CD56 पीई Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, और CD146-AF647 एंटीबॉडी जोड़ें। निर्धारण नियंत्रण के लिए, पीई, एपीसी-Cy7-, पे-Cy7-, PerCP-Cy5.5- और AF647 संयुग्मित निर्धारण एंटीबॉडी के बराबर मात्रा में जोड़ें। धीरे पिपेट कोशिकाओं के साथ एंटीबॉडी का मिश्रण है और 20 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी ट्यूबों सेतेअंधेरे में मि।
  5. पांच polystyrene दौर नीचे प्रवाह cytometry ट्यूबों में मध्यम धोने के 100 μl के लिए सकारात्मक मोतियों की एक बूंद को जोड़ने के द्वारा मुआवजा नियंत्रण मोती तैयार करें। (: 100 सभी 1) 5 नलियों से प्रत्येक के लिए अलग-अलग CD34-पे, CD45 एपीसी-Cy7, CD56 पीई Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, और CD146-AF647 एंटीबॉडी जोड़ें। अंधेरे में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी ट्यूबों को सेते हैं।
  6. ऊष्मायन के दौरान, सेल संग्रह ट्यूबों endothelial वृद्धि मध्यम-2 से 4 डिग्री सेल्सियस पर (ईजीएम -2) संस्कृति के माध्यम से और जगह के 500 μl के साथ प्रत्येक तैयार करते हैं।
  7. एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, अनबाउंड एंटीबॉडी हटाने के लिए आदेश में कोशिकाओं और मोती धोने के लिए मध्यम धोने के 5 मिलीलीटर जोड़ें। अपकेंद्रित्र 4 मिनट के लिए 200 XG पर सभी ट्यूबों। कपड़े धोने और centrifugation कदम दोहराएँ। जब फिर से निलंबित कोशिकाओं ध्यान से धीरे सतह पर तैरनेवाला और पिपेट छानना।
  8. 250 μl के अनुसार लगभग 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में मध्यम धोने में फिर से निलंबित। कपड़े धोने मीटर के 100 μl में मोती पुनः निलंबितedium।
  9. अंधेरे में बर्फ पर सेल सॉर्टर के लिए सभी सेल और मनका निलंबन परिवहन। नकारात्मक मोतियों की 1 बूंद सकारात्मक मनका मुआवजा नियंत्रण ट्यूबों में जोड़ें और प्रतिदीप्ति मुआवजा निर्धारित करने के लिए इन का उपयोग करें।
  10. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की स्थापना और निम्नलिखित के लिए voltages सेट करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार बेदाग नियंत्रण कक्षों चलाएँ: एफएससी 150V; एसएससी 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V। निर्माता के निर्देशों के अनुसार भागो isotypes नियंत्रण पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति गैर विशिष्ट बंधन से संबंधित थ्रेसहोल्ड की स्थापना। बहु रंग दाग नमूना चलाने के लिए और (चित्रा 1) pericyte और संग्रह ट्यूबों में adventitial सेल आबादी इकट्ठा।
    नोट: इष्टतम व्यवहार्य सेल पैदावार pericytes के लिए कुल जीना सेल हदबंदी के लगभग 3% और adventitial कोशिकाओं के लिए 4% है।

4. सेल संस्कृति

  1. FACS छँटाई के परिणाम के अनुसार उपयुक्त आकार संस्कृति प्लेटों का चयन करें। विकास क्षेत्र के 2 सेमी प्रति बाँझ 0.2% जिलेटिन समाधान के 100 μl जोड़ें और पूरे कुओं कोट करने के लिए मैन्युअल रूप से आंदोलन। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं और पूरी तरह से जिलेटिन समाधान निकालने। संस्कृति प्लेटों की तैयारी कर रहा whilst बर्फ पर एकत्र कोशिकाओं रखें।
    नोट: हौसले से हल किया pericytes और adventitial कोशिकाओं अच्छी तरह से विकसित जब जिलेटिन लेपित संस्कृति सतह पर 30,000 से 40,000 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर वरीयता प्राप्त।
  2. 4 मिनट के लिए 200 XG पर हौसले से एकत्र कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और धीरे ईजीएम 2.Seed का एक उचित मात्रा में जिलेटिन में लिपटे प्लेटों पर कोशिकाओं में सेल गोली फिर से निलंबित।
    नोट: कोशिकाओं की वास्तविक संख्या अच्छी तरह से और की ईजीएम -2 जोड़ा जा करने के लिए राशि प्रति वरीयता प्राप्त किए जाने की प्लेट चयन पर निर्भर करते हैं। उदाहरण के लिए, 0.5 मिलीग्राम और 1 मिलीलीटर ईजीएम -2 अच्छी तरह से प्रति 48 और 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए क्रमशः की जरूरत है।
  3. एक्सचेंज ईजीएम -2 परिवाहकीय सेल के विकास के लिए मध्यम (DMEM दोनों pericytes और adventitial कोशिकाओं के लिए 20% FBS और 1% पी / एस) के साथ पूरक एक बार कोशिकाओं (कम से कम 72 घंटे के बाद) बसे और प्लेट का पालन किया है। मीडिया पर फिर से हर 72 घंटा बदलें। 5% सीओ 2 में और 37 डिग्री सेल्सियस प्रारंभिक और बाद के सभी incubations बाहर ले।
  4. 0.05% trypsin EDTA का उपयोग करते समय pericytes और adventitial कोशिकाओं 80 से 90% संगम तक पहुँचने की कोशिकाओं को अलग कर देना। पीबीएस में 20% FBS, 4 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र के साथ बुझाना, एक 1 पर परिवाहकीय सेल मध्यम विकास में कोशिकाओं को फिर से निलंबित, और फिर मार्ग: uncoated polystyrene संस्कृति प्लेटों पर 3 अनुपात। पारित होने के बाद से 2, एक 1 में पारित होने कोशिकाओं: 5 अनुपात (या कम से लगभग 7000 कोशिकाओं / 2 सेमी) uncoated polystyrene संस्कृति प्लेटों या बोतल करने के लिए।

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Representative Results

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एकल कक्षों आगे और पक्ष बिखराव वितरण के आधार पर मलबा और दोहरी से प्रतिष्ठित किया गया। जीवित कोशिकाओं DAPI डाई को लेने के लिए उनकी असफलता से पहचान की गई। Gating रणनीति इस लाइव, पूरे हृदय सेल हदबंदी (चित्रा 1) का निर्धारण नियंत्रण लेबलिंग के आधार पर चुना गया था। जीवित कोशिकाओं से, CD45 + कोशिकाओं पहले, बाहर gated थे CD56 + कोशिकाओं द्वारा पीछा किया। CD144 + endothelial कोशिकाओं तो CD56 से हटा दिया गया - अंश। इस अंतिम जनसंख्या से, CD146 + / CD34 - pericytes और CD146 - / CD34 + adventitial कोशिकाओं चयन किया गया था और बाद में (चित्रा 2) एकत्र। इसके तत्काल बाद सेल संग्रह के बाद, प्रत्येक उप-जनसंख्या का एक छोटा सा नमूना (500-1,000 कोशिकाओं) सॉर्टर के माध्यम से है कि सेल वितरण प्रारंभिक प्रकार में दर्ज था पुष्टि करने के लिए फिर से चलाया गया था। FACS शुद्ध दौरे Peric ytes और adventitial कोशिकाओं दोनों संस्कृति में सेल आकारिकी (चित्रा 3) तारामय करने के लिए एक धुरी दिखा रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1:। लेबल निर्धारण नियंत्रण के FACS gating रणनीति प्रतिनिधि डॉट्स भूखंडों अलग मानव हृदय कोशिकाओं क्रमबद्ध फाटकों की स्थिति को समझाना .. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Myocardial perivascular कोशिकाओं की FACS शोधन एक भी मानव दौरे नमूना से हृदय परिवाहकीय अग्रदूत कोशिकाओं के दो उप-जनसंख्या के प्रतिनिधि छँटाई।।es / ftp_upload / 54252 / 54252fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। संस्कृति में Perivascular सेल आकारिकी दो हृदय परिवाहकीय अग्रदूत सेल आबादी, pericytes (बाएं पैनल) और adventitial कोशिकाओं (दाएं) FACS शुद्धि द्वारा एकरूपता को हल और आगे बीतने 3, स्केल सलाखों में संस्कृति (में विस्तार किया गया = 50 माइक्रोन )। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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बढ़ती सबूत चोट के बाद वयस्क मानव हृदय के एक सीमित पुनर्योजी क्षमता का समर्थन करता है। पहचान और घायल दिलों में इस तरह के पुनर्योजी प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार मूल निवासी अग्रदूत साबित कोशिकाओं के लक्षण वर्णन दोनों संबद्ध तंत्र और संकेत दे रास्ते की समझ और दृष्टिकोण के विकास उपचारात्मक इन कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

पिछले प्रोटोकॉल मानव कंकाल की मांसपेशी 25 से perivascular अग्रदूत सेल सबसेट के अलगाव का वर्णन किया है। हालांकि, हृदय के ऊतकों के लिए इन तकनीकों का सीधा आवेदन अक्सर बहुत गरीब सेल पैदावार में यह परिणाम है। नतीजतन, हम आदेश परिवाहकीय अग्रदूत साबित कोशिकाओं, अर्थात् pericytes और adventitial कोशिकाओं, मानव दौरे बायोप्सी से की दो असतत उप-जनसंख्या को समृद्ध करने और दोनों के एक साथ सबसेट शुद्धि की सुविधा के लिए प्रोटोकॉल के प्रमुख समायोजन कर दिया है। s से दोनों सेल आबादी के अलगावAME नमूना न केवल कीमती हृदय ऊतक बायोप्सी के उपयोग का अनुकूलन लेकिन यह भी अलग परिवाहकीय सेल सबसेट के प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है।

आदेश कोशिकाओं की अधिकतम उपज प्राप्त करने के लिए, ऊतक के नमूने की ताजगी के महत्व का है। pericytes और adventitial कोशिकाओं के लिए अधिक से अधिक व्यवहार्य सेल पैदावार लगभग 3% और क्रमशः कुल जीना सेल हदबंदी के 4% है। पैदावार सबसेट प्रति लगभग 30,000 400,000 कोशिकाओं से काफी भिन्न है और राशि और शुरू ऊतकों की गुणवत्ता और संरक्षण अवधि सहित कारकों की एक संख्या है, पर अत्यधिक निर्भर हो सकता है। Perivascular कोशिकाओं अपेक्षाकृत नाजुक होते हैं; autolytic परिवर्तन के सबूत दिखा नमूने सदा ही FACS के बाद कम सेल नंबर निकलेगा। इसी तरह, perivascular कोशिकाओं कठोर पाचन तकनीक के प्रति संवेदनशील हैं, और अधिक पाचन भी एक कम व्यवहार्य सेल उपज में परिणाम होगा। पाचन समय और आंदोलन की गति के लिए अनुकूलित समायोजन individua द्वारा आवश्यक हो सकता हैएल प्रयोगशालाओं। अंत में, दाता उम्र और नमूने का आकार भी सेल पैदावार पर प्रमुख प्रभाव पड़ेगा।

हम बड़े पैमाने पर इस तरह से 3 में प्राप्त हृदय pericytes की विशेषता है। इन कोशिकाओं को कोई endothelial सेल संदूषण के साथ संस्कृति में एकरूपता का प्रदर्शन किया। जनसंख्या मार्ग 3 और 12 के बीच लगभग 60 घंटे का समय के दोहरीकरण दोनों आम pericyte मार्करों के अनुरूप अभिव्यक्ति के साथ नोट कर रहे थे (alkaline फॉस्फेट, NG2 और α-SMA) और क्लासिक एमएससी मार्कर (CD44, CD73, CD90 और CD105) इस अवधि में। दिलचस्प, यह पाया गया कि demethylation के बाद, हृदय pericytes का एक अंश cardiomyogenic प्रतिलेखन व्यक्त Nkx2.5 और GATA4 कारकों। जब सह-सुसंस्कृत नवजात चूहे cardiomyocytes साथ, demethylated हृदय pericytes का एक अंश sarcomeric प्रोटीन मार्कर अल्फा-actinin और हृदय ट्रोपोनिन टी, एक छोटी सी समूह के आगे सहज cytoplasmic कैल्शियम अपशिष्टों का प्रदर्शन के साथ व्यक्त किया। साथ में ले ली, इन निष्कर्षों suggeसेंट कि हृदय pericytes की एक उप-जनसंख्या cardiomyogenic संभावित पास है और इसलिए आंतरिक दौरे की मरम्मत की प्रक्रिया में एक भूमिका निभा सकते हैं। pericytes के साथ तुलना में, हृदय कोशिकाओं adventitial काफी हद तक uncharacterized रहते हैं। हमारे अप्रकाशित प्रारंभिक आंकड़े बताते हैं कि हृदय कोशिकाओं adventitial ऐसे PDGFR-β और NG2 के रूप में कुछ pericyte मार्करों, यद्यपि हृदय pericytes की तुलना में निचले स्तर पर, संस्कृति में CD34 खोने whilst व्यक्त करते हैं। इन कोशिकाओं को भी क्लासिक एमएससी मार्कर व्यक्त करने और osteogenic और adipogenic भेदभाव क्षमता दिखा। एन्जियोजेनिक और समर्थक हृदयजनित संपत्तियों सहित हृदय adventitial कोशिकाओं के आगे के अध्ययन से चल रहे हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक मानव हृदय के ऊतकों के नमूने से हृदय pericytes और adventitial कोशिकाओं के एक साथ, भावी शुद्धि सक्षम बनाता है। इन कोशिकाओं को संभावित cardiomyogenic गुणों के साथ उपन्यास हृदय अग्रदूत सेल आबादी है कि उपयुक्त candidat साबित हो सकता है प्रतिनिधित्वभविष्य सेल उपचार के लिए तों।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit Molecular Probes A-10344
Collagenase I Gibco 17100-017 Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II Gibco 17101-015
Collagenase IV Gibco 17104-019
anti-human CD34-PE BD Pharmingen 555822 Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen 557747 Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
anti-human CD146-AF647 AbD Serotec MCA2141A647 Keep sterile
EGM2-BulletKit Lonza CC-3162 For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate ThermoFischer Scientific 10566-016
Fetal Bovine Serum ThermoFischer Scientific 10500-064 Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin Sigma Aldrich G1393 Dilute with sterile water
IgG1k-PE BD Pharmingen 559320 Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7 BD Pharmingen 557873 Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7 BD Pharmingen 557872 Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
IgG1k-647 AbD Serotec MCA1209A647 Keep sterile
Mouse serum Sigma Aldrich M5905 Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M Sigma Aldrich P7793
Penicillin-Streptomycin Gibco 15979-063 Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4 ThermoFischer Scientific 10010-023 Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max Sigma Aldrich R7757 Keep sterile
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x) Invitrogen 15400-054
 FACSARIA FUSION BD Pharmingen Fluorescence Activated Cell Sorter

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References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324, (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33, (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98, (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94, (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81, (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21, (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15, (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35, (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47, (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20, (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31, (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6, (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51, (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15, (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314, (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67, (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121, (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109, (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21, (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
मानव हृदय के ऊतकों से Perivascular multipotent अग्रदूत सेल आबादी के अलगाव
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Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).More

Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).

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