Summary
人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 + CD34 -周皮細胞およびCD34 + CD146 -外膜細胞、ヒト心筋から。
Introduction
心臓は長い有糸分裂後の臓器と考えられてきました。しかし、最近の研究では、成人の心臓1で制限された心筋細胞のターンオーバーの存在を実証しました。心筋細胞の分化能を持つネイティブ幹/前駆細胞はまた、cardiosphere形成、SCA-1 +、c-キット+を含め、大人の齧歯動物と人間の心の中に心筋内で同定され、そして最近でてきた、血管周囲の前駆細胞2,3。これらの細胞は、細胞移植またはインサイチュ増殖の刺激を介して心臓の修復/再生を増強することを目的とした治療のための魅力的な候補を表します。
間葉系幹/間質細胞（MSC）は、MSCの治療適用の4,5臨床試験は、心血管修復6、移植片対宿主病7のような複数の病理学的条件のために行われているほとんどすべてのヒト組織から単離されています8。有益な効果は、へのMSCの能力に起因している：炎症9のサイトへの家。異なる細胞型10に分化。プロ修復分子11を分泌します 。そして、宿主免疫応答12を調節します 。 MSCの単離は、伝統的に、プラスチック基板への優先的な遵守に依存してきました。しかし、得られた細胞の集団は、一般的に13著しく不均一です。から（ - / CD34 - / CD45 - / - CD56 CD146 + / CD31）キーの血管周囲細胞マーカーの組み合わせで選別（FACS）、蛍光活性化細胞を使用することにより、我々は、多能MSCのような前駆体集団を単離および精製することができました大人の骨格筋や白色脂肪14を含む複数のヒト組織。
様々な非心臓組織における血管周囲の細胞集団は、幹細胞/前駆細胞の特性を有することが示されていますNDは、心血管の設定で臨床使用のために検討されています。周皮細胞、最もよく知られている血管周囲細胞サブセットの一つは、新しい血管15の開発を含むいくつかの病態生理学的役割を果たして不均一な集団であり、血圧16、及び血管の完全17,18の維持の調節。複数の組織に示すように、周皮細胞の特定のサブセットは、ネイティブMSC抗原を発現し、FACS精製後に14初代培養でのMSCのような表現型を維持します。また、これらの細胞を安定に培養内での長期的な表現型を維持したMSC 19,20と同様の多系列分化能を示します。これらの結果は、周皮細胞は、とらえどころのないMSC 14の起源の一つであることを示唆しています。周皮細胞の治療可能性は、虚血負傷者への移植後の心筋瘢痕化および強化された心機能の低下と実証されています心21。最近、我々は成功し、ヒト心筋から周皮細胞を精製し、骨格筋形成3の不在で、そのMSCのような表現型および多分化（脂肪生成、軟骨形成および骨形成）を実証しました。また、心筋周皮細胞が他の臓器から精製されたカウンターパートと比較した場合、差動心筋電位と血管新生能力を示しました。
多能血管周囲の幹/前駆細胞、外膜細胞の第二集団は、陽性のCD34発現22に基づいて、ヒト伏在静脈から単離されています。静脈外膜細胞はクローン原性ポテンシャル、中胚葉分化能およびインビトロでの血管新生促進の可能性を有することが示されています。マウスの虚血損傷した心臓へのこれらの細胞の移植は、間質性線維症の減少、血管新生および心筋の血流の増加、減少、心室DILをもたらしエーション、および増加した心臓の駆出率23。興味深いことに、脂肪外膜細胞が刺激24と周皮細胞の表現型の採用を示唆し、CD34発現を失い、アンジオポエチンII処理に応答して、培養中のCD146の発現をアップレギュレートすることが示されています。心臓内、しかし、外膜の細胞集団は、まだ前向きにFACSにより精製および/または十分に特徴付けられていません。次のセクションで説明した細胞単離手順を用いて、我々は現在、心筋外膜細胞を特徴付けると再生アプリケーションのための彼らの可能性を調査しています。
ここで我々は、ヒト胎児または成人の心筋から血管周囲の幹/前駆細胞の2亜集団を分離し、精製するための方法について説明します。この前向き細胞単離方法は、比較研究やfurtheのためのヒト心臓生検から同質遺伝子血管周囲の幹/前駆細胞サブセットを取得するために研究者を可能にしますrの様々な心臓の病的状態におけるそれらの治療の可能性を探ります。
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Protocol
人間の心臓のサンプルの1処理
- すべての流体、コンテナ、機器、および専用の操作領域が無菌であることを確認してください。
- 20％ウシ胎児血清（FBS）、氷上で1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を含む冷却したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）から成る記憶媒体（組織バンクまたは外科チームによって調達）心臓組織試料を置き輸送3。
- 記憶媒体からの心臓サンプルを除去し、2％FBSおよび1％P / Sを補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）からなる洗浄媒体で洗浄します。サンプルを取り扱う際は、大型船や心膜を把握し、心筋の破砕最小限にするために、微細な先端鉗子を使用します。
- ペトリ皿の中で洗浄媒体にサンプルを沈めると3に記載されているように滅菌アイリスはさみや先の細いピンセットで心膜、心内膜および大血管を削除します。
- 残りmyocaをカット片面カミソリの刃や鋭いアイリスハサミを用いて約1ミリメートル3の小片にrdium。注：サンプルは即座に処理されている場合は最高の細胞収量が得られることになります。遅延が避けられない場合、新鮮な記憶媒体で処理された心臓組織の保存（> 1 cm 3の組織あたり5ml）で最大72時間、4℃でしかし、おそらく細胞収率の関連する低下と、可能です。
細胞の組織および単離の2消化
- たて水浴中で消化1.5ミリリットルコラゲナーゼの各Iを含む溶液、コラゲナーゼII、およびコラゲナーゼIV（すべてのDMEM中ミリリットルの0.5mg /時）と37°Cまでのウォームを構成しています。
注：ボリュームとコラゲナーゼの濃度は、約1cm 3の試料に適しています。 - 100μmのストレーナを介して吊り下げ組織片を濾過し、PBSで2回洗浄します。滅菌30ミリリットルの容器に組織片を移し密閉蓋。
注意：ショートワイドポットではなく、背の高い狭い管がより良い結果を与えます。また、無菌の50mlチューブに組織片を入れて、30ミリリットルの容器が利用できない場合、水平方向に配置します。 - すべての消化液（4.5ミリリットル合計）を追加し、120 rpmのに設定し、37℃の振盪水浴中で密封されたビニール袋内のコンテナを配置します。また、120回転に設定された加熱オービタルシェーカーにパラフィンフィルムと場所で容器を密閉。
- 15分後、三回、さらに15分間、交換する前に、ポットを取り外して反転。削除し、20％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM 5 mlのコラゲナーゼを急冷。
- 静かに任意の組織塊を破壊するために10ミリリットルの血清学的ピペットで1020年に回ピペッティングすることによってダイジェストを粉砕します。未消化の物質を除去し、単一細胞懸濁液を得るために、100ミクロン、70ミクロン、最後に40μmのセルストレーナーを介してサスペンションを連続してフィルタリングします。
注意：酵素消化プロセスによってdebrisgeneratedセルを回避するために、セルストレーナーの間で洗わないでください。 - 遠心分離機4分間、200×gで細胞懸濁液を、注意深く上清をデカントし、洗浄媒体の4ミリリットルで希釈する前に、室温で2分間のバッファを溶解赤血球の1ミリリットル中にペレットを再懸濁します。
- 遠心分離工程を繰り返し、洗浄媒体の1ミリリットル中にペレットを再懸濁。よく混ぜ、細胞計数のために細胞懸濁液10μlを取ります。
- トリパンブルー染色の10μlの細胞懸濁液10μlを混合し、細胞計数のための標準的な血球計数器に液10μlを配置します。コーナー平方あたりの平均値を得るために4で4隅の正方形内に存在する明るい、円形細胞の数（それぞれが16小さな正方形に細分化）し、除算を数えます。染色希釈係数を考慮するために2で平均値を乗算した後、10 4は、サンプルを1mlあたりの細胞の総数を取得することによって。
- 細胞懸濁液をマウス血清の50μLを添加し、非特異的抗体結合をブロックするために20分間4℃でインキュベートします。
- 遠心分離機4分間、200×gでマウス血清を用いて細胞懸濁液を、上清を除去し、そして100μlあたり1×10 6細胞の濃度で洗浄媒体に再懸濁します。
- アリコート2のポリスチレン丸底に50μlのアイソタイプおよび非染色コントロールの細胞懸濁液のそれぞれは、管は、マルチカラー染色のための第三のチューブに残りの容量を配置し、フローサイトメトリー。
- マルチカラー染色のための単一細胞懸濁液に：CD34-PE、CD45-APC-Cy7を、CD56-PE-Cy7を、CD144-PerCPを-Cy5.5標識、およびCD146-AF647抗体（100すべて1）を追加します。アイソタイプコントロールのために、PE-、APC-Cy7-、PE-Cy7-、PerCPを-Cy5.5-とAF647コンジュゲートアイソタイプ抗体の同等のボリュームを追加します。静かにピペットは、細胞と抗体を混合し、20 4℃で全てのチューブをインキュベートします暗所で分。
- ボトムフローサイトメトリーチューブラウンド5ポリスチレンで洗浄媒体100μlに正のビーズの1滴を追加することによって、補償制御ビーズを準備します。 5管のそれぞれに個別に：CD34-PE、CD45-APC-Cy7を、CD56-PE-Cy7を、CD144-PerCPを-Cy5.5標識、およびCD146-AF647抗体（100すべて1）を追加します。暗所で20分間、4℃ですべてのチューブをインキュベートします。
- インキュベーションの間、細胞採取管内皮増殖培地-2 4℃（EGM-2）培地と場所500μlの各準備をします。
- 抗体インキュベーション後、非結合抗体を除去するために、細胞およびビーズを洗浄するための洗浄培地5mlを加えます。 4分間200×gで遠心分離は全てのチューブ。洗浄および遠心分離ステップを繰り返します。慎重に優しく時に再懸濁し、細胞上清およびピペットをデカント。
- 250μLあたり約1×10 6細胞の濃度で、洗浄媒体に再懸濁します。洗濯メートル100μlの中のビーズを再懸濁edium。
- 暗所で氷上でセルソーターに全ての細胞およびビーズ懸濁液を輸送。正ビーズ補償制御管に負のビーズの1滴を加え、蛍光補正を設定するためにこれらを使用しています。
- バックグラウンド蛍光を確立し、以下に電圧を設定するための製造元の指示に従って染色されていないコントロール細胞を実行します。FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V。製造業者の指示に従って実行アイソタイプ対照は、非特異的結合に関連したバックグラウンド蛍光の閾値を確立します。マルチカラー染色されたサンプルを実行し、収集チューブ（ 図1）に周皮細胞および外膜細胞集団を収集します。
注：最適な生存細胞収量は周皮細胞の総生細胞解離の約3％と外膜の細胞は4％です。
4.細胞培養
- FACS選別の結果に応じて適切なサイズの培養プレートを選択します。成長面積1cm 2あたりの滅菌0.2％ゼラチン溶液100μlを添加して、被覆するために、手動で全体の井戸を攪拌します。 4℃で10分間、プレートをインキュベートし、完全にゼラチン溶液を除去。培養プレートを準備しながら、氷上で回収した細胞を保管してください。
注：ゼラチンコーティングした培養表面上3万40,000細胞/ cm 2の密度で播種したときにたてソート周皮細胞および外膜細胞がよく育ちます。 - 4分間、200×gで新鮮に採取した細胞を遠心分離し、静かにEGM-2.Seed適切な量のゼラチンコートプレート上の細胞に細胞ペレットを再懸濁。
注：セルの実際の数はウェルあたり播種すると追加されるEGM-2の量は、プレート選択によって異なります。例えば0.5 mlおよび1mlのEGM-2は、それぞれ、48および24ウェルプレートのウェル当たりに必要とされます。 - 交換EGM-2血管周囲細胞増殖培地用（細胞は（）は、少なくとも72時間後に定住し、プレートに付着した後、DMEMは、周皮細胞および外膜細胞の両方のために20％FBSおよび1％P / S）を補充しました。その後、上からメディアごとに72時間を変更します。 C、5％CO 2中、37℃で初期および後続のすべてのインキュベーションを行います。
- 周皮細胞および外膜細胞が80〜90％コンフルエンスに達したときに、0.05％トリプシンEDTAを用いて細胞を解離します。コーティングされていないポリスチレン培養プレート上に3：1の比で、次に継代の細胞を血管周囲細胞増殖培地中に再懸濁し、PBS中20％FBS、4分間、200×gで遠心分離してクエンチしました。継代2から以降、1で継代細胞：5の比率（または約7,000細胞/ cm 2）コーティングされていないポリスチレン培養プレートまたはフラスコに。
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Representative Results
単一細胞は、前方および側方散乱分布に基づいて破片や二重から区別されました。生細胞は、DAPI染料を取るために彼らの失敗によって同定しました。ゲーティング戦略はこのライブ、全心筋細胞解離（ 図1）のアイソタイプ対照用標識に基づいて選択されました。生きた細胞から、CD45 +細胞が最初にCD56 +細胞に続いて、ゲートアウトしました。分数- CD144 +内皮細胞は、その後CD56から除去しました。周皮細胞およびCD146 - -この最後の集団、CD146 + / CD34から/ CD34 +外膜細胞（ 図2）を選択し、続いて回収しました。すぐに細胞採取後、各亜集団（500〜1,000細胞）の少量の試料は、最初のソートに記録されている細胞分布があったことを確認するためにソーターを介して再実行しました。 FACS精製した心筋のperic ytesと外膜細胞の両方は、培養中の細胞形態（ 図3）星状スピンドルを呈します。
図1：FACS ゲーティング戦略の標識アイソタイプコントロールの代表的なドットプロットは、人間の心臓の細胞は、ソートゲートの位置を示して解離.. この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 心筋血管周囲細胞のFACS精製単一のヒト心筋サンプルから心臓血管周囲の前駆細胞の2亜集団の代表的なソート。エス/ ftp_upload / 54252 / 54252fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： 培養における血管周囲の細胞形態 2の心臓血管周囲の前駆細胞集団、周皮細胞（左パネル）および外膜細胞（右）は=50μmのFACS精製により均質にソートされ、さらに培養で増殖（継代3で、スケールバーました）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
増加する証拠は、損傷後の成人の心臓の限られた再生能力をサポートしています。傷ついた心の中で、このような回生応答を担当するネイティブ前駆細胞の同定および特徴付けは、関連機構とシグナル伝達経路の理解と治療的にこれらの細胞を利用するアプローチの開発の両方のために重要です。
以前のプロトコルでは、ヒト骨格筋25から血管周囲の前駆細胞サブセットの単離を記載しています。しかしながら、心臓組織へのこれらの技術の直接的な適用は、しばしば非常に乏しい細胞収量をもたらします。その結果、我々は人間の心筋生検からの血管周囲の前駆細胞、すなわち、周皮細胞および外膜細胞、の2つの別個の亜集団を豊かにし、両方のサブセットの同時精製を容易にするために、プロトコルへの主要な調整を行いました。 sの両方の細胞集団の単離雨のサンプルだけでなく、貴重な心臓組織生検の使用を最適化するだけでなく、明確な血管周囲細胞サブセットの直接比較を可能にします。
セルの最大収率を得るために、組織サンプルの鮮度は、極めて重要です。周皮細胞および外膜細胞のための最大生存細胞収率はそれぞれ約3％、総生細胞解離の4％です。収量はサブセットあたり約3万400,000細胞から大きく変化量及び出発組織の品質と保存期間を含む多数の要因に大きく依存している場合があります。血管周囲細胞は、比較的繊細です。自己分解の変化の証拠を示したサンプルは、常にFACS後の低細胞数を得ました。同様に、厳しい消化技術に敏感であり、過剰消化血管周囲細胞も減少生存細胞収率をもたらします。消化時間および攪拌速度のカスタマイズ調整がindividuaによって必要な場合がありますリットルの実験室。最後に、ドナーの年齢とサンプルサイズはまた、細胞収量に大きな影響を持つことになります。
我々は、この方法3で得られた心臓の周皮細胞を広範囲に特徴づけています。これらの細胞はない内皮細胞の混入で培養中の均質性を実証しました。通路3と12の間で約60時間の倍加時間人口はこの期間にわたって共通の周皮細胞マーカー（アルカリホスファターゼ、NG2およびα-SMA）および古典的MSCマーカー（CD44、CD73、CD90およびCD105）の両方の一貫性のある表現で注目されました。興味深いことに、それは脱メチル化の後、心臓の周皮細胞の画分が心筋転写因子Nkx2.5およびGATA4を発現することが見出されました。とき新生児ラット心筋細胞と共培養し、脱メチル化心臓周皮細胞の割合はマイナーグループはさらに自発的な細胞質カルシウムフラックスを示すとともに、筋節タンパク質マーカーアルファ - アクチニンと心筋トロポニンTを表明しました。まとめると、これらの知見は、sugge心臓周皮細胞の亜集団は、心筋の可能性を有しているため、固有心筋の修復過程において役割を果たし得ることを目。周皮細胞と比較して、心臓の外膜細胞は、主に特徴付けられていないままです。私たちの未発表の予備データは、心外膜細胞が培養中のCD34を失う一方で、心臓の周皮よりも低いレベルではあるが、そのようなPDGFR-βおよびNG2のようないくつかの周皮細胞のマーカーを発現することを示唆しています。これらの細胞はまた、古典的なMSCマーカーを発現し、骨形成および脂肪生成分化能を示します。血管新生およびプロ心原性特性を含む心臓外膜細胞のさらなる研究が進行中です。
ここで説明するプロトコルは、単一のヒト心臓組織サンプルから心臓周皮細胞および外膜細胞の同時、将来の精製を可能にします。これらの細胞は、適切なcandidatになるかもしれない潜在的な心筋特性を有する新規の心臓前駆細胞集団を表します将来の細胞治療用のエス。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film - Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
References
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