Summary
tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.
Introduction
O coração tem sido considerada um órgão de pós-mitótico. No entanto, estudos recentes têm demonstrado a presença de volume de negócios de cardiomiócitos limitada nos corações humanos adultos 1. As células-tronco / progenitoras nativas com potencial de diferenciação de cardiomiócitos também foram identificados dentro do miocárdio em roedores adultos e corações humanos, incluindo Sca-1 +, c-kit +, formando-cardiosphere e, mais recentemente, as células precursoras perivasculares 2,3. Estas células representam candidatos atraentes para terapias destinadas a reforçar cardíaca reparação / regeneração por meio de transplante de células ou a estimulação da proliferação in-situ.
Mesenquimais estaminais / células do estroma (MSC) foram isoladas a partir de quase todos os tecidos humanos 4,5 ensaios clínicos das aplicações terapêuticas de MSC foram realizadas para várias condições patológicas, tais como a reparação cardiovascular 6, reacção do enxerto contra o hospedeiro de doença 7 8. Efeitos benéficos têm sido atribuídas à capacidade de MSCs para: lar de locais de inflamação 9; diferenciarem em diferentes tipos de células 10; secretam moléculas pró-reparadoras 11; e modular a resposta imune do hospedeiro 12. O isolamento de MSCs tem tradicionalmente contado com a sua adesão preferencial aos substratos de plástico. No entanto, a população resultante de células é tipicamente sensivelmente 13 heterogénea. Através da utilização de células activadas fluorescentes (FACS) com uma combinação de marcadores chave de células perivasculares, fomos capazes de isolar e purificar uma população precursora MSC como multipotentes (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) a partir de vários tecidos humanos, incluindo adultos músculo esquelético e gordura branca 14.
populações de células em vários tecidos perivasculares não cardíacos foram mostrados como tendo propriedades / progenitoras de células-tronco umnd estão sendo investigados para uso clínico no cenário cardiovascular. Pericitos, um dos subconjuntos de células perivasculares mais conhecidos, são uma população heterogênea que desempenhar vários papéis fisiopatológicos, incluindo no desenvolvimento de novos vasos 15, a regulação da pressão arterial 16, e manutenção da integridade vascular 17,18. Como mostrado em vários tecidos, subconjuntos específicos de pericitos nativamente expressar antigénios MSC e sustentar seus fenótipos MSC-like em cultura primária após FACS purificação 14. Além disso, estas células de manter de forma estável os seus fenótipos de longo prazo no interior da cultura e exibem potencial de diferenciação de multi-linhagem, semelhante ao MSC 19,20. Estes resultados sugerem que pericitos são uma das origens da MSC evasivo 14. O potencial terapêutico dos pericitos foi demonstrada com uma redução na formação de cicatrizes do miocárdio e função cardíaca melhorada após o transplante em feridas isquemicamentecorações 21. Recentemente, purificado com sucesso pericitos do miocárdio humano e demonstrou seus fenótipos MSC-like e multipotency (adipogênese, condrogênese e osteogênese) com a ausência de tecido muscular esquelético 3. Além disso, pericitos do miocárdio apresentaram diferenciais cardiomiogênico capacidades potenciais e angiogénicos quando comparado com os seus homólogos purificados a partir de outros órgãos.
A segunda população de células estaminais / progenitoras multipotentes perivasculares, a célula adventícia, foi isolado a partir de veias safenas humanas com base na expressão positiva CD34 22. Células adventícias venoso foram mostrados como tendo um potencial clonogénico, capacidade de diferenciação mesodérmicos e potencial pró-angiogénico in vitro. Transplante destas células para os corações de ratos lesionados por isquemia resultou numa redução na fibrose intersticial, um aumento na angiogénese e o fluxo sanguíneo do miocárdio, reduzida dil ventricularção, e aumento da ejecção cardíaca fracção 23. Interessantemente, as células adiposas adventícia foram mostrados a perder expressão de CD34 e CD146 regular a expressão na cultura em resposta ao tratamento angiopoietina II, sugerindo que a adopção de um fenótipo de pericitos estimulação com 24. Dentro do coração, no entanto, a população de células da adventícia ainda não foi prospectivamente purificado por FACS e / ou bem caracterizados. Utilizando os procedimentos de isolamento celular descritos nas seções a seguir, estamos actualmente a caracterizar células adventícias do miocárdio e investigar o seu potencial para aplicações regenerativas.
Aqui nós descrevemos um método para isolar e purificar duas subpopulações de células estaminais / progenitoras perivasculares do miocárdio fetal ou adulto humano. Este método de isolamento de células prospectivo vai permitir aos investigadores obter subconjuntos de células tronco / progenitoras perivasculares isogênicas de biópsias cardíacas humanas para estudos comparativos e furtheR explorar o seu potencial terapêutico em várias condições patológicas cardíacas.
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Protocol
1. Processamento de Cardiac Humano Amostra
- Certifique-se que todos os fluidos, recipientes, instrumentos e da área operacional dedicado são estéreis.
- Colocar a amostra de tecido cardíaco (adquiridos pelo banco de tecidos ou equipa cirúrgica) em meio de armazenamento composto de forma refrigerada de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) contendo 20% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) em gelo para o transporte 3.
- Retirar a amostra cardíaca a partir do meio de armazenamento e lava-se com um meio de lavagem constituído por soluto salino tamponado com fosfato (PBS) suplementada com 2% de FBS e 1% de P / S. Ao manusear a amostra, utilize uma pinça bem cotado para captar grandes vasos ou pericárdio e minimizar o esmagamento do miocárdio.
- Submergir a amostra em meio de lavagem em uma placa de Petri e retire o pericárdio, endocárdio e grandes vasos sanguíneos com tesoura de íris esterilizadas e uma pinça de ponta fina, tal como descrito 3.
- Corte o restante myocardium em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm3 utilizando uma única lâmina de barbear lado ou um par de íris tesoura afiada. Nota: As maiores produções de células será obtida se as amostras são processadas imediatamente. Se um atraso é inevitável, a armazenagem do tecido cardíaco processada no meio de armazenamento de fresco (> 5 ml por 1 cm3 de tecido) a 4 ° C durante até 72 h, é possível, no entanto, presumivelmente com um declínio associado no rendimento celular.
2. Digestão do tecido e Isolamento de células
- Recentemente fazer-se a solução de digestão que compreende 1,5 ml de cada de colagenase I, II, colagenase, e a colagenase IV (todos a 0,5 mg / ml em DMEM) e aquecido a 37 ° C num banho de água.
Nota: O volume e concentração de colagenases são adequados para amostras de aproximadamente 1 cm3. - Filtrar os pedaços de tecido em suspensão através de um filtro de 100 um e lavar duas vezes com PBS. Transferir os pedaços de tecido para um recipiente estéril de 30 ml comuma tampa hermeticamente fechado.
Nota: potes de largura curtas em vez de tubos estreitos altos dar melhores resultados. Como alternativa, pedaços de tecido colocado num tubo estéril de 50 ml e colocar na horizontal, se um recipiente de 30 ml não está disponível. - Adicionar todas as soluções de digestão (4,5 mL no total) e colocar o recipiente dentro de um saco de plástico selado num banho de água com agitação a 37 ° C definida para 120 rpm. Alternativamente, selar o recipiente com película de parafina e coloque em um agitador orbital aquecida definido para 120 rpm.
- Após 15 min, remover e inverter o pote três vezes antes de substituir durante mais 15 min. Remover e extinguir as colagenases com 5 ml de DMEM suplementado com 20% de FBS e 1% de P / S.
- Tritura-se o produto da digestão por pipetagem suave dez a vinte vezes com uma pipeta de 10 ml serológico para quebrar quaisquer aglomerados de tecido. Filtra-se a suspensão sequencialmente através de 100 um, 70 um e, finalmente, 40 filtros celulares uM para remover materiais não digeridos e se obter uma suspensão de célula única.
Nota:Não enxaguar entre filtros celulares para evitar célula debrisgenerated pelo processo de digestão enzimática. - Centrifugar a suspensão de células a 200 xg durante 4 min, decanta-se cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos durante 2 min à temperatura ambiente antes de se diluir com 4 ml de meio de lavagem.
- Repetir o passo de centrifugação e re-suspender o sedimento em 1 ml de meio de lavagem. Misturar bem e tomar 10 ml da suspensão de células para contagem das células.
- Misturar 10 ul da suspensão celular com 10 ul de tripano mancha azul e colocar 10 ul da mistura em um hemocitómetro padrão para contagem das células. Contar o número de células vivas, redondo presente nas quatro esquinas (cada uma subdividida em dezesseis pequenos quadrados) e dividir por 4 para obter a média por metro quadrado de canto. Multiplicar a média de 2 a conta para o factor de diluição e, em seguida, mancha por 10 4 para se obter o número total de células por 1 ml de amostra.
- Adicionar 50 ul de soro de ratinho para a suspensão de células e incubar a 4 ° C durante 20 min para bloquear o anticorpo não específico de ligação.
- Centrifugar a suspensão de células com soro de ratinho a 200 xg durante 4 min, remover o sobrenadante, e re-suspensão em meio de lavagem, a uma concentração de 1 x 10 6 células por 100 ul.
- Alíquota de 50 ul cada da suspensão de células para o isotipo e em controlos não coradas de poliestireno de fundo redondo de dois tubos de citometria de fluxo, em seguida, colocar o volume remanescente para um terceiro tubo para a coloração de multi-cor.
- Adicionar CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, e anticorpos CD146-AF647 (todos 1: 100) para a suspensão de células individuais para a coloração de multi-cor. Para o controle isotipo, adicione volumes equivalentes de PE-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- e anticorpos do isotipo AF647-conjugados. Suavemente pipeta para misturar os anticorpos com as células e incubar todos os tubos a 4 ° C durante 20min no escuro.
- Prepare esferas de controlo de compensação pela adição de uma gota de grânulos positivas para 100 l de meio de lavagem em cada cinco poliestireno rodada tubos de citometria de fluxo de fundo. Adicionar CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, e anticorpos CD146-AF647 (todos 1: 100) individualmente para cada um dos 5 tubos. Incubar todos os tubos a 4 ° C durante 20 min no escuro.
- Durante a incubação, preparar tubos de colheita de células, cada uma com 500 uL de Meio de Crescimento Endotelial-2 (EGM-2) meio de cultura e colocar a 4 ° C.
- A seguir à incubação do anticorpo, adicionam-se 5 ml de meio de lavagem para lavar as células e os grânulos a fim de remover anticorpo não ligado. Centrifugar todos os tubos a 200 xg durante 4 min. Repetir o passo de lavagem e centrifugação. Cuidadosamente decantar o sobrenadante e pipeta suavemente quando as células re-suspensão.
- Re-suspender em meio de lavagem, a uma concentração de aproximadamente 1 x 10 6 células por 250 ul. Re-suspender as contas em 100 ml de lavar medium.
- Transportar todas as suspensões celulares e talão para a separação de células em gelo no escuro. Adicione 1 gota de contas negativas aos tubos de controlo positivo de compensação de contas e usá-los para definir a compensação de fluorescência.
- Execute as células de controlo não coradas de acordo com as instruções do fabricante para determinar a fluorescência de fundo e definir as tensões com o seguinte: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. controlos isotipos executado de acordo com as instruções do fabricante para estabelecer os limites de fluorescência de fundo relacionada com a ligação não-específica. Execute o multi-color amostra corada e recolher o pericyte e populações de células adventícias nos tubos de recolha (Figura 1).
NOTA: os rendimentos de células viáveis óptimas são de aproximadamente 3% da dissociação de células vivas totais para pericitos e 4% para células adventícias.
Cultura 4. celular
- Selecione placas de cultura de tamanho adequado de acordo com o resultado da triagem FACS. Adicionar 100 ul de solução estéril de gelatina 0,2% por cm2 de área de crescimento e agitar manualmente para revestir os poços inteiras. Incubar as placas a 4 ° C durante 10 min e remover a solução de gelatina completamente. Manter as células recolhidas no gelo enquanto prepara placas de cultura.
Nota: pericitos recentemente classificada e células adventícias crescem bem quando semeadas a uma densidade de 30.000 a 40.000 células / cm2 sobre a superfície de cultura revestidos com gelatina. - Centrifugar as células recolhidas recentemente a 200 xg durante 4 min e suavemente re-suspender o sedimento de células em uma quantidade apropriada de AGE-2.Seed as células em placas revestidas com gelatina.
Nota: O número real de células a serem semeadas por poço e a quantidade de AGE-2 a ser adicionado depende da selecção placa. Por exemplo, 0,5 ml e 1 ml de EGM-2 são necessários por poço para placas de 48 poços e 24, respectivamente. - Troca EGM-2 para meio de crescimento celular perivascular (DMEM suplementado com 20% FBS e 1% de P / S) para ambos os pericitos e células adventícias uma vez as células se estabeleceram e aderiu à placa (depois de pelo menos 72 horas). Troque a mídia cada 72 horas a partir de então. Levar a cabo as incubações subsequentes iniciais e todos em 5% de CO 2 e a 37 ° C.
- Separar as células utilizando EDTA de tripsina a 0,05% quando pericitos e células adventícias atingir 80 a 90% de confluência. Extingue-se com 20% de FBS em PBS, centrifugação a 200 xg durante 4 min, re-suspender em meio de crescimento celular perivascular, e, em seguida, a passagem das células a uma razão de 1: 3 em placas de cultura de poliestireno não revestidas. De passagem 2 em diante, as células de passagem a uma relação de 1: 5 (ou em cerca de 7.000 células / cm2) para placas de cultura de poliestireno não revestidas ou frascos.
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Representative Results
As células individuais foram distinguidos dos detritos e dupletos na base de distribuições dispersão frontal e lateral. células vivas foram identificados por sua incapacidade de absorver o corante DAPI. A estratégia gating foi escolhido com base na rotulagem deste vivo, dissociação de células inteiras cardíaca (Figura 1) controlo de isotipo. A partir das células vivas, células CD45 + foram fechado em primeiro lugar para fora, seguido de células CD56 +. Células endoteliais CD144 + foram então removidos do CD56 - fracção. A partir desta população final, CD146 + / CD34 - pericitos e CD146 - células / CD34 + adventícia foram seleccionados e posteriormente recolhido (Figura 2). Imediatamente após a colheita de células, uma pequena amostra de cada subpopulação (500-1000 células) foi re-executar através do classificador para confirmar que a distribuição celular era como registrado na classificação inicial. peric miocárdio FACS purificado ytes e células adventícias ambas exibem um eixo para estreladas morfologia das células em cultura (Figura 3).
Figura 1:. FACS Estratégia Gating pontos representativos parcelas de controlo de isotipo marcado dissociada células cardíacas humanas ilustrar o posicionamento dos portões de classificação .. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A purificação por FACS de células do miocárdio perivasculares triagem representativas das duas subpopulações de células precursoras perivasculares cardíacas a partir de uma única amostra de miocárdio humano..es / ftp_upload / 54252 / 54252fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Perivascular celular Morfologia em Cultura As duas populações de células precursoras perivasculares cardíacas, pericitos (painel da esquerda) e células adventícias (direita) foram classificados até à homogeneidade através de purificação por FACS e mais expandidas em cultura (na passagem 3, barra de escala = 50 uM ). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A evidência crescente suporta uma capacidade regenerativa limitada do coração humano adulto após a lesão. Identificação e caracterização de células precursoras nativas responsáveis por estas respostas regenerativos em corações feridos são crítica, tanto para a compreensão dos mecanismos associados e vias de sinalização e o desenvolvimento de abordagens para utilizar estas células terapeuticamente.
Protocolos anteriores descreveram o isolamento de subconjuntos de células precursoras perivasculares a partir do músculo esquelético humano 25. No entanto, a aplicação directa destas técnicas para tecidos cardíacos resulta frequentemente em rendimentos de células muito pobres. Consequentemente, temos feito grandes ajustes para o protocolo a fim de enriquecer duas subpopulações distintas de células precursoras perivasculares, nomeadamente pericitos e células adventícias, a partir de biópsias do miocárdio humanos e facilitar a purificação simultânea de ambos os subconjuntos. O isolamento de ambas as populações de células a partir das samostra ame não só otimiza o uso de preciosas biópsias de tecido cardíaco mas também permite a comparação directa de subpopulações de células perivasculares distintas.
A fim de obter o rendimento máximo das células, a frescura da amostra de tecido é de importância crítica. os rendimentos máximos de células viáveis para pericitos e células adventícias são aproximadamente 3% e 4% do total de dissociação de células vivas, respectivamente. Os rendimentos podem variar muito, de cerca de 30.000 a 400.000 células por subconjunto e são altamente dependentes de um número de factores, incluindo a quantidade e qualidade do tecido de base e a duração de preservação. células perivasculares são relativamente delicada; As amostras que evidenciem sinais de mudança autolítico, invariavelmente, deu números de celulares de baixo depois de FACS. Do mesmo modo, as células perivasculares são sensíveis às técnicas de digestão duras, e sobre-digestão também vai resultar num rendimento reduzido de células viáveis. ajustes personalizados do tempo de digestão e velocidade de agitação pode ser necessário por individual laboratórios. Finalmente, idade do doador e do tamanho da amostra também terá grandes impactos sobre os rendimentos celulares.
Temos caracterizado extensivamente pericitos cardíacas, obtidas desta forma 3. Estas células demonstraram homogeneidade na cultura sem contaminação de células endoteliais. População tempos de duplicação de cerca de 60 horas entre as passagens 3 e 12 foram anotados com a expressão consistente de ambos os marcadores pericyte comuns (fosfatase alcalina, NG2 e α-SMA) e marcadores MSC clássicos (CD44, CD73, CD90 e CD105) durante este período. Curiosamente, verificou-se que, após desmetilação, uma fracção de pericitos cardíacas expressa a transcrição cardiomiogênico factores Nkx2.5 e GATA4. Quando co-cultivadas com cardiomiócitos de ratos neonatais, uma fracção de pericitos cardíacas desmetilados expressa o sarcomérica marcadores de proteína alfa-actinina e troponina-T, com um grupo menor exibindo mais fluxos de cálcio citoplasmático espontâneas. Tomados em conjunto, estes resultados sugger que uma subpopulação de pericitos cardíacas possui potencial cardiomiogênico e, portanto, pode desempenhar um papel no processo de reparação intrínseca do miocárdio. Na comparação com pericitos, células adventícias cardíacas permanecem em grande parte não caracterizado. Os nossos dados preliminares sugerem que as células não publicados adventícias cardíacos expressam alguns marcadores, tais como pericitos PDGFR-β e NG2, embora em níveis mais baixos do que os pericitos cardíacos, enquanto a perda de CD34 na cultura. Estas células também expressam marcadores MSC clássicos e mostrar osteogênico e potencial de diferenciação adipogênica. Mais estudos de células adventícias cardíacas, incluindo propriedades angiogênicos e pró-cardiogênicos estão em andamento.
O protocolo aqui descrito permite simultânea purificação, prospectivo de pericitos cardíacas e células adventícias a partir de uma única amostra de tecido cardíaco humano. Estas células representam populações de células precursor cardíaca novos com potenciais propriedades cardiomiogênico que podem revelar-se adequado candidates para terapias com células futuras.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film - Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
References
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