Summary
tejido cardíaco humano alberga poblaciones de células precursoras multipotentes perivasculares que pueden ser adecuados para la regeneración miocárdica. La técnica descrita aquí permite el aislamiento simultáneo y purificación de dos poblaciones de células estromales multipotentes asociados con vasos nativos sangre, es decir CD146 + CD34 - pericitos y CD34 + CD146 - células adventicias, desde el miocardio humano.
Introduction
El corazón ha sido considerado como un órgano de post-mitótico. Sin embargo, estudios recientes han demostrado la presencia de la facturación de los cardiomiocitos limitada en los corazones humanos adultos 1. Las células madre / progenitoras nativas con potencial de diferenciación de los cardiomiocitos también se han identificado dentro del miocardio en roedores adultos y los corazones humanos, incluyendo Sca-1 +, c-kit +, cardioesfera formando, y, más recientemente, las células precursoras perivasculares 2,3. Estas células representan candidatos atractivos para las terapias dirigidas a la mejora cardiaca reparación / regeneración a través de trasplante de células o la estimulación de la proliferación in-situ.
Mesenquimales madre / células del estroma (MSC) se han aislado a partir de casi todos los tejidos humanos 4,5 Los ensayos clínicos de las aplicaciones terapéuticas de MSC se han llevado a cabo para varias condiciones patológicas tales como la reparación cardiovascular 6, del injerto contra el anfitrión de la enfermedad 7 8. Los efectos beneficiosos se han atribuido a la capacidad de las MSC a: el hogar de los sitios de inflamación 9; diferenciarse en diferentes tipos de células 10; secretar moléculas pro-reparadoras 11; y modular respuestas inmunes del huésped 12. El aislamiento de las MSC se ha basado tradicionalmente en su adhesión preferencial a los sustratos de plástico. Sin embargo, la población resultante de células es típicamente marcadamente heterogénea 13. Mediante el uso de células activadas por fluorescencia (FACS) con una combinación de marcadores de células perivasculares clave, hemos sido capaces de aislar y purificar una población precursor MSC-como multipotentes (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) a partir de múltiples tejidos humanos, incluyendo adultos músculo esquelético y la grasa blanca 14.
poblaciones de células perivasculares en varios tejidos no cardíacos han demostrado tener propiedades madre / células progenitoras unand están siendo investigados para su uso clínico en el ajuste cardiovascular. Pericitos, uno de los más conocidos de los subconjuntos de células perivasculares, son una población heterogénea que juegan varios papeles fisiopatológicos incluidos en el desarrollo de nuevos vasos 15, la regulación de la presión arterial 16, y el mantenimiento de la integridad vascular 17,18. Como se muestra en múltiples tejidos, subconjuntos específicos de pericitos de forma nativa expresan antígenos MSC y sostener sus fenotipos MSC-como en cultivo primario después de la purificación FACS 14. Por otra parte, estas células establemente mantienen sus fenotipos largo plazo dentro de la cultura y exhiben potencial de diferenciación multi-linaje, similar a las MSC 19,20. Estos resultados sugieren que los pericitos son uno de los orígenes de la MSC 14 difícil de alcanzar. El potencial terapéutico de los pericitos se ha demostrado con una reducción en la cicatrización del miocardio y mejorar la función cardíaca después de un trasplante en lesionado por isquemia21 corazones. Recientemente, nos purifica con éxito pericitos del miocardio humano y demostrar sus fenotipos MSC-como múltiple y capacidad (adipogénesis, condrogénesis y osteogénesis) con la ausencia de la miogénesis esquelético 3. Además, los pericitos miocardio exhibieron diferenciales capacidades potenciales y angiogénicos cardiomiogénico en comparación con sus homólogos purificados a partir de otros órganos.
Una segunda población de células madre / progenitoras multipotentes perivasculares, la célula de la adventicia, se ha aislado de las venas safena humana sobre la base de la expresión de CD34 positivo 22. Células adventicias venosos han demostrado tener un potencial clonogénico, capacidad de diferenciación mesodérmica y el potencial proangiogénico in vitro. El trasplante de estas células en los corazones lesionados por isquemia de los ratones resultó en una reducción en la fibrosis intersticial, un aumento de la angiogénesis y el flujo sanguíneo miocárdico, la reducción de dil ventricularación, y el aumento de la fracción de eyección cardíaca 23. Curiosamente, se ha demostrado que células adventicias adiposas a perder la expresión de CD34 y regular al alza la expresión de CD146 en cultivo en respuesta al tratamiento angiopoyetina II, lo que sugiere la adopción de un fenotipo de pericitos con la estimulación 24. Dentro del corazón, sin embargo, la población de células de la adventicia todavía no se ha purificado de forma prospectiva por FACS y / o bien caracterizado. Utilizando los procedimientos de aislamiento de células que se describen en las siguientes secciones, actualmente estamos caracterizando células adventicias miocardio e investigar su potencial para aplicaciones regenerativas.
Aquí se describe un método para aislar y purificar dos subpoblaciones de células madre / progenitoras perivasculares de miocardio fetal o adulto humano. Este método de aislamiento de células prospectivo permitirá a los investigadores para obtener subconjuntos de células madre / progenitoras perivasculares isogénicas de biopsias cardíacas humanas para estudios comparativos y further explorar su potencial terapéutico en diversas condiciones patológicas cardíacas.
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Protocol
1. Tratamiento de la Muestra cardiaca humana
- Asegúrese de que todos los fluidos, contenedores, los instrumentos y el área operativa dedicada son estériles.
- Coloque la muestra de tejido cardíaco (adquiridos por el banco de tejidos, equipo quirúrgico) en el medio de almacenamiento se compone del medio refrigerado por Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 20% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) en el hielo para el transporte 3.
- Retirar la muestra cardíaco del medio de almacenamiento y lavar con un medio de lavado compuesto por solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado con 2% de FBS y 1% P / S. Al manipular la muestra, el uso de fórceps de punta fina para agarrar grandes vasos o el pericardio y minimizar el aplastamiento del miocardio.
- Sumergir la muestra en medio de lavado en una placa de Petri y retirar el pericardio, endocardio y grandes vasos sanguíneos con unas tijeras esterilizadas iris y pinzas de punta fina como se describe 3.
- Cortar el resto de myocardium en pequeños trozos de aproximadamente 1 mm 3 utilizando un solo lado de la hoja de afeitar o un par de tijeras afiladas iris. Nota: Se obtienen rendimientos más altos de células si las muestras se procesan inmediatamente. Si un retraso es inevitable, el almacenamiento del tejido cardíaco procesado en el medio de almacenamiento fresco (> 5 ml por 1 cm 3 de tejido) a 4 ° C por hasta 72 hr es posible, sin embargo, presumiblemente, con una disminución asociada en el rendimiento celular.
2. La digestión de los tejidos y Aislamiento de células
- Recién compensar la solución de digestión que comprende 1,5 ml cada uno de colagenasa I, colagenasa II, y la colagenasa IV (todos a 0,5 mg / ml en DMEM) y se calienta a 37 ° C en un baño de agua.
Nota: El volumen y la concentración de colagenasas son adecuados para muestras de aproximadamente 1 cm 3. - Filtrar los trozos de tejido en suspensión a través de un tamiz de 100 micras y lavar dos veces con PBS. La transferencia de las piezas de tejido a un recipiente de 30 ml estéril conuna tapa herméticamente cerrado.
Nota: Las ollas de ancho cortas en lugar de tubos estrechos altos dan mejores resultados. Alternativamente, poner trozos de tejido en un tubo estéril de 50 ml y colocar horizontalmente si un contenedor 30 ml no está disponible. - Añadir todas las soluciones de digestión (4,5 ml en total) y colocar el recipiente dentro de una bolsa de plástico sellada en un baño de agua agitando 37 ° C fijado a 120 rpm. Como alternativa, cerrar herméticamente el recipiente con una película de parafina y colocar en un agitador orbital de calefacción ajustada a 120 rpm.
- Después de 15 min, eliminar e invertir el bote tres veces antes de sustituir por un nuevo 15 min. Retirar y apagar las colagenasas con 5 ml de DMEM suplementado con 20% de FBS y 1% P / S.
- Se tritura el compendio pipeteando suavemente diez a veinte veces con una pipeta de 10 ml serológica para romper los grumos de tejido. Se filtra la suspensión a través secuencialmente 100 micras, 70 micras y, finalmente, 40 coladores celulares micras para eliminar los materiales no digeridos y obtener una suspensión de células individuales.
Nota:No enjuague entre los tamices de células para evitar celular debrisgenerated por el proceso de la digestión enzimática. - Centrifugar la suspensión de células a 200 xg durante 4 min, decantar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 2 minutos a temperatura ambiente antes de diluir con 4 ml de medio de lavado.
- Repetir la etapa de centrifugación y resuspender el sedimento en 1 ml de medio de lavado. Mezclar bien y tomar 10 l de la suspensión de células para el recuento celular.
- Mezclar 10 l de la suspensión celular con 10 l de Trypan mancha azul y colocar 10 l de la mezcla en un hemocitómetro estándar para el recuento de células. Contar el número de células brillantes, redondas presente en las cuatro esquinas (cada una subdividida en dieciséis pequeños cuadrados) y se dividen por 4 para obtener la media por metro cuadrado esquina. Multiplicar la media por 2 para tener en cuenta el factor de dilución mancha y luego por 10 4 para obtener el número total de células por 1 ml de muestra.
- Añadir 50 l de suero de ratón a la suspensión celular y se incuba a 4 ° C durante 20 min para bloquear la unión de anticuerpo no específica.
- Centrifugar la suspensión de células con suero de ratón a 200 xg durante 4 min, eliminar el sobrenadante y volver a suspender en medio de lavado a una concentración de 1 x 10 6 células por 100 l.
- Alícuota de 50 l cada uno de la suspensión celular para el isotipo y los controles no teñidas en fondo redondo de dos poliestireno citometría de flujo tubos luego colocar el volumen restante en un tercer tubo para la tinción de multi-color.
- Añadir CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, y los anticuerpos CD146-AF647 (todo 1: 100) a la suspensión de células individuales para la tinción de multi-color. Para el control de isotipo, añadir volúmenes equivalentes de PE, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- y los anticuerpos de isotipo AF647-conjugados. Suavemente la pipeta para mezclar los anticuerpos con las células e incubar todos los tubos a 4 ° C durante 20min en la oscuridad.
- Preparar bolas de control de compensación mediante la adición de una gota de perlas positivas para 100 l de medio de lavado en cinco poliestireno ronda tubos de citometría de flujo inferior. Añadir CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, y los anticuerpos CD146-AF647 (todo 1: 100) de forma individual a cada uno de los 5 tubos. Incubar todos los tubos a 4 ° C durante 20 min en la oscuridad.
- Durante la incubación, preparar los tubos de recogida de células, cada una con 500 l de medio de crecimiento endotelial-2 (EGM-2) medio de cultivo y a 4 ° C.
- Después de la incubación de anticuerpos, añadir 5 ml de medio de lavado para lavar las células y los granos con el fin de eliminar el anticuerpo no unido. Centrifugar todos los tubos a 200 xg durante 4 min. Repetir la etapa de lavado y centrifugación. decantar cuidadosamente el sobrenadante y la pipeta suavemente cuando las células re-suspensión.
- Volver a suspender en el medio de lavado a una concentración de aproximadamente 1 x 10 6 células por 250 l. Vuelva a suspender las perlas en 100 l de lavado medio.
- El transporte de todas las suspensiones celulares y talón al clasificador de células en hielo en la oscuridad. Añadir 1 gota de perlas negativas para los tubos positivos de control de compensación de cuentas y utilizar éstos para ajustar la compensación de fluorescencia.
- Ejecutar control de las células no teñidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante para establecer la fluorescencia de fondo y ajustar las tensiones a lo siguiente: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 620V 50; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480 V; R780 / 460 V 60. controles isotipos ejecutarán de acuerdo con las instrucciones del fabricante para establecer los umbrales de fluorescencia de fondo relacionadas con la unión no específica. Ejecutar el color de múltiples muestra teñida y recoger el pericitos y las poblaciones de células adventicias en los tubos de recogida (Figura 1).
NOTA: los rendimientos de células viables óptimas son aproximadamente el 3% de la disociación celular vivo total de los pericitos y 4% para células adventicias.
4. Cultura de la célula
- Seleccione el tamaño de las placas de cultivo adecuados de acuerdo a los resultados de la clasificación FACS. Añadir 100 ml de solución estéril de gelatina 0,2% por cm 2 de área de crecimiento y agitar manualmente para recubrir los pocillos enteras. Incubar las placas a 4 ° C durante 10 min y eliminar la solución de gelatina por completo. Mantener las células recogidas en el hielo, mientras que la preparación de las placas de cultivo.
Nota: pericitos recién ordenados y células adventicias crecen bien cuando se sembraron a una densidad de 30.000 a 40.000 células / cm 2 en la superficie de cultivo recubierta con gelatina. - Centrifugar las células recién recogidas a 200 xg durante 4 min y suavemente volver a suspender el sedimento celular en una cantidad apropiada de EGM-2.Seed las células en las placas revestidas de gelatina.
Nota: El número real de células que se sembró por pocillo y la cantidad de que se añade EGM-2 dependerá de la selección de placas. Por ejemplo, 0,5 ml y 1 ml de EGM-2 se necesitan por pocillo para placas de 48 y 24 pocillos, respectivamente. - Cambio de EGM-2 por medio de crecimiento celular perivascular (DMEM suplementado con 20% de FBS y 1% P / S) para ambos pericitos y células adventicias vez que las células se han establecido y se adhirieron a la placa (después de al menos 72 h). Cambiar el soporte de cada 72 horas a partir de entonces. Llevar a cabo las incubaciones posteriores iniciales y todas en 5% de CO2 y a 37 ° C.
- Disociar las células usando 0,05% de tripsina EDTA cuando pericitos y células adventicias alcanzan 80-90% de confluencia. Se inactiva con 20% de FBS en PBS, centrifugar a 200 xg durante 4 min, volver a suspender en medio de crecimiento celular perivascular, y luego paso las células a una proporción de 1: 3 en placas de cultivo de poliestireno no recubiertas. De Passage 2 en adelante, las células de paso en una relación 1: 5 (o aproximadamente a 7.000 células / cm 2) a placas o matraces de cultivo de poliestireno no recubiertas.
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Representative Results
Las células individuales se distinguen de escombros y dobletes sobre la base de dispersión frontal y lateral distribuciones. Las células vivas fueron identificados por su incapacidad para asumir el tinte DAPI. La estrategia gating fue elegido sobre la base de etiquetado de control de isotipo de este vivo, la disociación de células enteras cardíaca (Figura 1). A partir de las células vivas, las células CD45 + fueron cerrada primero, seguido de CD56 + células. Células endoteliales CD144 + se retiraron entonces del CD56 - fracción. De esta población final, CD146 + / CD34 - se seleccionaron células / CD34 + adventicia y posteriormente recogidos (Figura 2) - pericitos y CD146. Inmediatamente después de la recolección de células, una pequeña muestra de las diferentes subpoblaciones de células (500-1000) se vuelva a ejecutar a través del clasificador para confirmar que la distribución de células fue como se registra en la clasificación inicial. purificado por FACS peric infarto ytes y células adventicias ambos exhiben un husillo a la morfología de las células estrelladas en cultivo (Figura 3).
Figura 1: Estrategia de apertura de puerta. FACS parcelas puntos representativos de control de isotipo marcado disocian las células del corazón humanos ilustran la colocación de las puertas ordenar .. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La purificación FACS de las células del miocardio perivasculares clasificación Representante de las dos subpoblaciones de células precursoras perivasculares cardíacas a partir de una sola muestra de miocardio humano..en / ftp_upload / 54252 / 54252fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Perivascular Morfología celular en cultivo, las dos poblaciones de células precursoras perivasculares cardíacos, pericitos (panel izquierdo) y células adventicias (derecha) se clasificaron a homogeneidad mediante purificación FACS y más expandido en cultivo (en el paso 3, barras de escala = 50 micras ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
aumento de la evidencia apoya una limitada capacidad de regeneración del corazón humano adulto después de la lesión. Identificación y caracterización de células precursoras nativas responsables de tales respuestas regenerativas en los corazones lesionados son fundamentales tanto para la comprensión de los mecanismos y vías de señalización asociadas y el desarrollo de métodos para utilizar estas células terapéuticamente.
Protocolos anteriores han descrito el aislamiento de los subconjuntos de células perivasculares precursor de músculo esquelético humano 25. Sin embargo, la aplicación directa de estas técnicas a los tejidos cardíacos a menudo resulta en rendimientos celulares muy pobres. En consecuencia, hemos realizado importantes ajustes en el protocolo con el fin de enriquecer dos subpoblaciones discretas de células precursoras perivasculares, a saber, los pericitos y células adventicias, a partir de biopsias de miocardio humanos y para facilitar la purificación simultánea de ambos subconjuntos. El aislamiento de las dos poblaciones de células a partir de las smuestra de la llama no sólo optimiza el uso de biopsias de tejido cardiaco preciosos sino que también permite la comparación directa de los subconjuntos de células perivasculares distintas.
Con el fin de obtener el máximo rendimiento de las células, la frescura de la muestra de tejido es de importancia crítica. los rendimientos de células viables máxima para pericitos y células adventicias son de aproximadamente 3% y 4% del total de disociación de células vivas, respectivamente. Los rendimientos pueden variar en gran medida de alrededor de 30.000 a 400.000 células por subconjunto y dependen de una serie de factores, incluyendo la cantidad y la calidad del tejido de partida y la duración de conservación altamente. células perivasculares son relativamente delicada; Las muestras que muestran evidencia del cambio autolítico invariablemente producen bajo número de células después de FACS. Del mismo modo, las células perivasculares son sensibles a las técnicas de digestión duras, y el exceso de digestión también darán lugar a un rendimiento de células viables reducida. ajustes personalizados del tiempo de digestión y la velocidad de agitación pueden ser necesarios por individual laboratorios. Por último, la edad del donante y el tamaño de la muestra también tendrán un gran impacto en los rendimientos celulares.
Hemos caracterizado extensivamente pericitos cardíacas obtenidas de esta manera 3. Estas células demostraron homogeneidad en cultivo sin contaminación de las células endoteliales. Población tiempos de alrededor de 60 horas entre los pasos 3 y 12 de la duplicación se observó con la expresión coherente de ambos marcadores de pericitos comunes (fosfatasa alcalina, NG2 y α-SMA) y marcadores MSC clásicos (CD44, CD73, CD90 y CD105) durante este período. Curiosamente, se encontró que después de la desmetilación, una fracción de los pericitos cardíacos expresó la transcripción cardiomiogénico factores Nkx2.5 y GATA4. Cuando se co-cultivaron con cardiomiocitos de rata neonatal, una fracción de los pericitos cardíacos desmetilados expresó la sarcoméricas marcadores de proteínas alfa-actinina y cardíaco de troponina-T, con un grupo menor que exhibe más flujos de calcio citoplasmáticas espontáneas. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugerst que una subpoblación de pericitos cardíacos posee potencial cardiomiogénico y por lo tanto puede jugar un papel en el proceso de reparación del miocardio intrínseca. En comparación con los pericitos, células adventicias cardíacas siguen siendo en gran medida sin caracterizar. Nuestros datos preliminares no publicados sugieren que las células adventicias cardíacos expresan algunos marcadores de pericitos como PDGFR-β y NG2, aunque a niveles más bajos que los pericitos cardíacos, mientras que la pérdida de CD34 en cultivo. Estas células también expresan marcadores MSC clásicos y muestran potencial osteogénico y la diferenciación adipogénica. Otros estudios de células adventicias cardíacas incluyendo propiedades angiogénicas y pro-cardiogénico están en curso.
El protocolo descrito aquí permite la purificación simultánea, prospectivo de los pericitos y células adventicias cardíacas a partir de una sola muestra de tejido cardiaco humano. Estas células representan nuevas poblaciones de células precursoras cardiaca con potenciales propiedades cardiomiogénico que pueden resultar adecuados para ser candidatES para futuras terapias celulares.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film - Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
References
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