Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Published: August 12, 2016 doi: 10.3791/54255
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4, 5, 1,2,6
1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University

Abstract

Os monócitos são células imunitárias inatas que podem ser ativadas por patógenos e inflamação associados a certas doenças inflamatórias crónicas. A activação de monócitos induzem funções efectoras e um deslocamento concomitante da oxidativo ao metabolismo glicolítico que é acompanhada por um aumento da expressão do transportador de glucose. Este aumento do metabolismo glicolítico é também observada para a imunidade treinada de monócitos, uma forma de memória imunológica inata. Embora os protocolos in vitro que examinam a expressão do transportador de glucose e a captação de glicose pelos monócitos foram descritos, nenhum foi examinado por fluxo multi-paramétrico citometria em sangue total. Descreve-se um protocolo de citometria de fluxo multi-paramétrica para a medição da absorção de glucose análogo 2-NBDG fluorescente no sangue total pelo total de monócitos e a clássica (CD16 ++ CD14 -), intermediário (CD14 ++ CD16 +) e não clássico ( CD14 + CD16 ++) de monócitossubpopulações. Este método pode ser usado para examinar a expressão do transportador de glucose e a captação de glucose para o total de monócitos e subpopulações de monócitos durante a homeostase e doenças inflamatórias, e pode ser facilmente modificado para analisar a absorção de glucose por outros leucócitos e subpopulações de leucócitos de sangue dentro.

Introduction

Os monócitos são um dos principais componentes do sistema imune inato humano que são rapidamente mobilizados para os locais de infecção e inflamação 1. Activação dos monócitos é fundamental para limitar os danos aguda por patógenos e também é central para a patogênese de diversas doenças crônicas, incluindo a aterosclerose 2, do cancro de 3, e HIV 4,5.

O metabolismo de repouso e monócitos ativados difere radicalmente, com monócitos descansando utilizando metabolismo oxidativo e monócitos activados utilizando metabolismo glicolítico (ou seja, a fermentação da glicose em lactato) 6. A activação de monócitos induz a expressão dos transportadores de glicose que permite maior captação de glicose para o metabolismo glicolítico 7. transportador de glucose de monócitos 1 (GLUT1) é um tal transportador regulada positivamente durante a activação e a sua expressão tem sido mostrado para levar a produção de citocinas pro-inflamatórias em vITRO e no tecido adiposo de ratos obesos 8. A infecção de uma linha celular monocítica de sarcoma de Kaposi associada herpesvírus leva à sobre-regulação celular da Glut1 9, e, recentemente, mostraram que durante a infecção crónica pelo HIV um aumento da percentagem de monócitos que expressam GLUT1 estão presentes durante a infecção tratados com terapia anti-retroviral não tratada e 10 combinação. Tomados em conjunto, estes estudos mostram que a absorção de glicose e metabolismo glicolítico por monócitos são aspectos importantes de muitas doenças inflamatórias. Assim, um método simples para medir a expressão de monócitos GLUT1 e a absorção de glicose durante a homeostase e doença inflamatória é provável que seja de utilização de uma vasta gama de pesquisadores.

Os monócitos humanos são heterogéneo, sendo compreendido de três subconjuntos distintos que podem ser examinados por expressão diferencial de CD14 a marcadores da superfície celular CD16 e 11,12. Classical monócitos expressam um alto nível de expressão de CD14, mas não expressam CD16 (CD14 ++ CD16 -), monócitos intermediários expressam um alto nível de CD14 e um nível intermediário de CD16 (CD14 ++ CD16 +), e não-clássica monócitos expressam um baixo nível de CD14 e um alto nível de CD16 (CD14 + CD16 ++). Os monócitos que expressam CD16 são denominados CD16 + monócitos, que em comparação com CD16 - monócitos têm alta expressão de citoquinas inflamatórias e a capacidade para mais efectivamente apresentar antigénios 13,14. Aproximadamente 10% dos monócitos expressam CD16 durante a homeostase com percentagens mais elevadas observadas durante a inflamação 15. Subpopulações de monócitos estão associados com certos estados de doença e podem ser marcadores biológicos úteis de doença e progressão da doença 16.

Nosso objetivo foi identificar um método que pode medir a expressão transportador de glicose e captação de glicose pelos monócitos humanos e subpopulações de monócitos em condições tão próximas phycondições fisiológi- possível. Estudos anteriores medido expressão do transportador de glucose de monócitos e a absorção de glicose 17,18, embora estes métodos examinados monócitos isolados que pode ter alterado a expressão da proteína em comparação com as condições fisiológicas 19, e nenhum estudo anterior examinou subpopulações de monócitos humanos. Usando fluxo multi-paramétrico citometria, nós descrevemos um método para examinar a expressão do transportador de glucose e a absorção do análogo de glucose fluorescente 2-NBDG pelo total de monócitos e subpopulações de monócitos (com base em CD14 e CD16 expressão) dentro de sangue inteiro não manipulada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: HIV-infectados e indivíduos não infectados pelo HIV foram recrutados a partir da Unidade de Doenças Infecciosas no Hospital Alfred de Melbourne, VIC, Austrália e da comunidade local, respectivamente. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes, e a pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa Alfred Hospital.

Detecção de Superfície Celular 1. Glut1 em monócitos e de monócitos subpopulações

  1. Recolha de sangue em tubos anticoagulantes ACD-B citrato e começar os experimentos em uma cabine de segurança biológica dentro de 1 hora da coleta.
  2. Adicionar 100? L de sangue para tubos de polipropileno. Adicionar 2 ml de solução de lise 1x (ver Materiais Tabela) para tubos em gelo, enquanto, pipetando cuidadosamente para misturar. Incubar durante 15 min em gelo. Centrifugar a 220 xg durante 5 min.
  3. Decantar e lavar duas vezes por adição de cerca de 2-4 ml de solução de lavagem (0,5% de BSA em PBS 1x) e centrifugação a 220 xg durante 5 min.
  4. Use um tubotte para remover cuidadosamente o máximo de solução de lavagem possível. Colocar os tubos em gelo e re-suspensão em 100 uL de solução de lavagem.
  5. Para identificar subpopulações de monócitos específicos corar as células com o seguinte volume de anticorpos por cada 100 ul de suspensão de células preparada no Passo 1.4: 5 uL de anti-CD3-PE, 5 uL de anti-CD14-APC, 5 uL de anti-CD16-PECy7, 5 ul GLUT1 -FITC ou IgG2b-FITC (tubo de controlo de isotipo).
  6. Colocar em gelo durante 30 min no escuro. Lavar 2 vezes com solução de lavagem. Fix com 200-300 ul de 0,5% de formaldeído feita em PBS 1x.
  7. Analisar num citómetro de fluxo capaz de detectar a 4 cores dentro de 24 horas, dentro do seguinte excitação e emissão de comprimentos de onda: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. Glucose captação pelos monócitos

  1. Pipeta de 90 mL de sangue coletado na etapa 1.1 em tubos de polipropileno. Adicionam-se 10 ul de uma solução de trabalho de 14,60? M 2-a NBDGos 90 l de sangue (concentração final de 1,46 mM) e filme suavemente para misturar. É crítico para limitar 2-NBDG exposição à luz, cobrindo tubos com folha de alumínio.
  2. Incubar a 37 ° C no escuro durante 15-30 minutos e, em seguida, colocar imediatamente em gelo. Adicione 4 ml de 1x FACS lise solução para tubos, enquanto no gelo. Centrifugar a 220 xg a 4 ° C durante 5 min.
  3. Lavar uma vez por adição de 4 ml de solução de lavagem (0,5% de BSA em PBS 1x). Centrifugar a 220 xg a 4 ° C durante 5 min. Decantar e colocar no gelo.
  4. células mancha com anticorpos: 5 ul anti-CD3-PE, 5 jul anti-CD14-APC, 5 l anti-CD16-PECy7. Misturar e colocar em gelo durante 30 min no escuro.
    NOTA: Durante este período, certifique-se o citômetro de fluxo está pronto para análise imediata. Adquirir células dentro do seguinte excitação e emissão de comprimentos de onda: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), a APC (633, 660).
  5. Adicione 4 ml de tampão de gelo lavagem a frio (0,5% BSA em 1x PBS) para tubos.Lavar uma vez por centrifugação a 220 xg, a 4 ° C durante 5 min. Decantar e adicionar 200-300 mL de gelo antigo PBS e manter em gelo no escuro (coberto com folha de alumínio). Analisar num citómetro de fluxo dentro de 10 min, utilizando excitação e de emissão de ajuste de comprimento de onda como no passo 2.4.

3. Aquisição e Análise de Dados

NOTA: O conhecimento de análise de dados de citometria de fluxo e é assumido.

  1. Usando um citômetro de fluxo capaz de análise de, pelo menos, 4 cores, a remuneração definida usando amostras não coradas e corados individualmente.
    NOTA: coloração utilizando um único CD4 marcado com FITC e CD14 podem ser usados ​​para GLUT1 e de compensação 2-NBDG.
  2. Configurar e rotular janelas apropriadas antes de adquirir amostras. Desenhar uma porta em torno da população de monócitos, e adquirir 100.000 a 300.000 eventos por amostra na taxa média. 50.000 eventos por amostra de compensação é suficiente.
    NOTA: A compensação pode ser realizada antes de provaraquisição ou em software de análise de uma única célula, seguindo procedimentos padrão.
  3. Exportação e salvar dados em um local apropriado. Abra o software de análise única célula, como FlowJo ou outro software de análise (Suplementar Figura 1) e as amostras de arrastar e soltar, conforme especificado (Supplemental Figura 2).
  4. Clique duas vezes para abrir o arquivo (Supplemental Figura 3). Desenhar um círculo ao portão de monócitos com base em frente e propriedades de dispersão lado, como mostrado na Figura 1A e Suplementar Figura 4. Clique duas vezes a população de monócitos. Observar e desenhar uma caixa em torno do CD3 - população (Supplemental Figura 4).
  5. Clique duas vezes no CD3 - população. Para observar as subpopulações de monócitos CD14-APC seleccionar no eixo "X", e CD16-PECy7 sobre o 'eixo Y'-, e rotular em conformidade (Suplementar Figura 5).
  6. Onde não há distintapopulações positivas e negativas, medir a expressão de Glut1 ou absorção de 2-NBDG nas sub-populações específicas de monócitos. Determinar as intensidades de fluorescência média (IFM) de GLUT1 e 2-NBDG subtraindo-se o isotipo e sem fundo 2-NBDG (Suplementar Figura 6).
  7. Onde existem populações definidas, utilizar o IgG2b-FITC para definir a porta, e determinar a percentagem de células positivas (figura 3).
    NOTA: Utilize este procedimento para analisar totais CD14 + monócitos. Desde a absorção de 2-NBDG é normalmente marcado por uma mudança na fluorescência intensidades os dados são melhor representados por IFM e histogramas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A compensação deve ser realizada para fluorocromos individuais para evitar transbordamento de fluorescência. Os monócitos são primeiramente enriquecido por gating com base na dispersão frontal e lateral. As parcelas apresentados são representantes de pelo menos seis experiências independentes realizadas em sangue total a partir de seis ou mais participantes, como previamente relatado 10 A Figura 1A mostra a propagação inicial de monócitos por dispersão e a exclusão de células T de células por gating dentro do CD3 -. População. Os monócitos são então fechado para a expressão de CD14 por si só ou em combinação com o CD16 para identificar monócitos totais ou subpopulações de monócitos como mostrado na Figura 1B e figura 1C, respectivamente. Para a análise de sub-populações de monócitos, a seguinte nomenclatura deve ser aplicado como previamente descrito 12: monócitos clássicos (CD16 ++ CD14 -) deve expressar aproximadamente 100 vezes maior do CD14 IMF do que o controlo de isotipo e CD16 IMF deve ser semelhante ao do controlo isotipo; monócitos intermédios (CD14 ++ CD16 +) deve expressar aproximadamente 100 vezes maior do que o CD14 MFI de controlo de isotipo e de aproximadamente 10 vezes maior IMF CD16 em comparação com o controlo de isotipo; monócitos não clássicos (CD14 + CD16 ++) deve ter IMF semelhante para CD14 e o controlo de isotipo e, aproximadamente, 100 vezes maior do que o CD16 MFI de controlo de isotipo. Células sem expressão de CD14 e CD16 não são monócitos consideradas e não deve ser incluído no gating. Gated monócitos ou monócitos subpopulações pode então ser analisada para a expressão do transportador de glucose. Tal como indicado na Figura 2, pode ser observado populações distintas de células CD14 + GLUT1 + monócitos, mais notavelmente em células obtidas a partir de indivíduos HIV +, onde a infecção é caracterizada por um estado de inflamação crónica. Semelhante mas raras CD14 + células + GLUT1 pode ser observed dentro de subgrupos de monócitos específicas em pessoas não infectadas pelo HIV (Figura 3A), mas são mais pronunciada em indivíduos HIV + (Figura 3B). Notável, na ausência de populações distintas, pode ser apropriado para representar os resultados como média ou intensidades florescence mediano, que leva em consideração o aumento acumulado na expressão na superfície celular GLUT1.

a absorção de glucose pode ser avaliada comparando sangue inteiro incubado com 2-NBDG ou controlo de veículo para monócitos fechado ou subpopulações de monócitos. Anteriormente mostrou que cerca de 50% de monócitos eram 2-NBDG positiva após uma incubação de 15 min a 10. Este nível de absorção permite a detecção de 2-NBDG sem saturação de alcançar, quando pode já não existir diferenças de monócitos captação de 2-NBDG. Análise da captação de 2-NBDG pelos monócitos de HIV não infectado e HIV + pessoas revelaram uma maior absorção pelas células de + pessoas HIV, queestá de acordo com os dados de expressão GLUT1 (Figura 4-5). No geral, estes resultados ilustram que os ensaios aqui descritos podem ser utilizados para estudar as actividades potencialmente monócitos metabólicas em contextos biológicos que provocam um estado inflamatório, tal como a diabetes, doenças cardiovasculares, e infecções virais e bacterianas.

figura 1
Figura 1:. Gating estratégia utilizada para analisar totais monócitos e subpopulações de monócitos a partir de HIV-representativo e as amostras de sangue VIH + Amostras de sangue total foram analisados ​​por citometria de fluxo para a expressão na superfície celular de monócitos GLUT1 dentro de 1 h de recolha. (A) células foram fechado com base na dispersão frontal e lateral e características de expressão de CD3. (B) Para examinar monócitos totais, CD3 - células foram então fechado para a expressão de CD14. (C por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:.. A análise da expressão GLUT1 superfície celular no total de monócitos de HIV representativa e amostras de sangue VIH + CD14 + monócitos de não infectados pelo HIV ou tratamento de pessoas ingênuas foram coradas com o controlo do isotipo marcado com FITC ou anticorpo GLUT1 HIV-infectados por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 3:. Análise de expressão GLUT1 superfície celular em subpopulações de monócitos de HIV amostras representativas e + de sangue de HIV subpopulações monócitos foram corados com controlo de isotipo marcado com FITC ou anticorpo GLUT1 para (B) de tratamento do HIV-infected (A) não infectados pelo HIV ou naïve amostras de sangue. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. A absorção de 2-NBDG pelo total de monócitos CD14 + a partir de HIV-representativo e HIV + amostras de sangue a partir de sangue de tratamento de pessoas infectadas pelo HIV virgens ou infectados pelo HIV foi incubado com veículo ou 2-NBDG a uma concentração final de1,46 mM durante 15 minutos antes da lavagem e incubação com anticorpos de superfície celular para monócitos portão conforme descrito na Figura 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5:. A absorção de 2-NBDG por subpopulações de monócitos a partir de HIV-representativo e HIV + amostras de sangue Sangue Total de tratamento pessoas naive não infectadas ou infectadas com HIV foi incubado com veículo ou 2-NBDG a uma concentração final de 1,46 mM para 15 min antes da lavagem e incubação com anticorpos de superfície celular para subpopulações de monócitos portão conforme descrito na Figura 1. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

together.within-page = "1"> Supp. figura 1
Suplementar Figura 1:. Janela Workspace para citometria de fluxo de software de análise de célula Por favor clique aqui para visualizar ou baixar este número suplementar.

Supp. Figura 2
Suplementar Figura 2:. Os dados da amostra são arrastados e caiu em esta área de trabalho Por favor, clique aqui para visualizar ou baixar este número suplementar.

55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
Suplementar Figura 3: Amostras no espaço de trabalho, os dados 085 é clicado duas vezes, e uma segunda janela apareceu mostrando as três maiores populações de células (linfócitos, monócitos e neutrófilos) dentro da amostra de sangue total fresco baseado em frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) . Por favor clique aqui para visualizar ou baixar este número suplementar.

Supp. Figura 4
Suplementar Figura 4: Os monócitos são fechados com base em frente (FSC) e dispersão lateral (SSC). A população foi clicado duas vezes, que trouxe uma nova janela. CD3 é selecionado na população eixo 'x' e CD3-negativo (Supressão de linfócitos) foi seleito. Por favor clique aqui para visualizar ou baixar este número suplementar.

Supp. Figura 5
Suplementar Figura 5: O CD3 - população de monócitos foi clicado duas vezes, que trouxe uma nova janela onde subpopulação de monócitos pode ser definida com base em CD16 e CD14 expressão. Por favor clique aqui para visualizar ou baixar este número suplementar.

Supp. Figura 6
Suplementar Figura 6: Msubpopulações onocyte estão selecionados e expressão na superfície celular GLUT1 (intensidade de fluorescência média: MFI) é obtida selecionando 'estatísticas' na janela do histograma, 'média' da 'adicionar estatísticas' janela, e selecionando GLUT1 do 'parâmetro' drop-down menu. Por favor clique aqui para visualizar ou baixar este número suplementar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O protocolo descrito aqui detalha um método simples para examinar a expressão transportador de glicose e captação analógica glucose fluorescente por monócitos e monócitos subpopulações em sangue total. Ao avaliar a absorção de 2-NBDG em sangue total, esta técnica permite condições semelhantes aos in vivo. Um estudo anterior analisou-6 em monócitos NBDG absorção separadas do sangue total por centrifugação de densidade de 17. No entanto, este estudo não avaliou subpopulações de monócitos e separação de monócitos a partir de sangue total pode potencialmente alterar a expressão de determinadas moléculas da superfície da célula 19. Marcadores radioactivos glicose também têm sido usados ​​para medir a absorção de monócitos de glicose 20,21, mas monócitos deve ser previamente isolado por este método e o uso de radioactividade requer precauções de segurança significativos. Nosso protocolo utiliza procedimentos de biosegurança de rotina e é minimamente manipuladora, permitindo assim a medição de citometria de fluxo de 2-NBDGcaptação por monócitos e subpopulações de monócitos que imitam as condições in vivo.

2-NBDG entra na via glicolítica e tem sido mostrado para ser metabolizado por células em moléculas não fluorescentes 22. Portanto, é crítico para limitar o metabolismo após 2-NBDG incubação, mantendo as células arrefecidas a 4 ° C. 6-NBDG é outro análogo de glucose fluorescente que pode ser utilizado, mas é menos útil, uma vez que não entra na via glicolítica e, portanto, não reflecte de forma precisa o estado de bioenergética as células 23.

Se fluorocromos com sobreposição de espectros são utilizados, a compensação torna-se fundamental para evitar transbordamento fluorocromo. Neste protocolo, usamos monócitos corados individualmente com CD14 e CD16 para definir os parâmetros de compensação, mas a compensação de marcadores de superfície celular também pode ser realizada utilizando esferas de compensação.

Granulócitos pode expressar CD16, mas pode ser excluída pela SupressãoCD15-expressando células. No entanto, gating rigorosas de monócitos com base nas propriedades de dispersão de luz pode limitar o número de granulócitos incluídos na análise. Se um fluxo é um citómetro disponíveis com mais canais, o marcador CD66b granulócitos pode também ser utilizada para excluir granulócitos a partir da análise.

O anticorpo GLUT1 utilizado neste estudo se liga a um epitopo da superfície celular e, portanto, não se liga a GLUT1 intracelular. Um anticorpo que se liga a um epitopo GLUT1 intracelular pode ser usado para medir a expressão total de Glut1 monócito, mas as células devem ser permeabilizadas antes de corar 10. Além de monócitos, esta técnica pode ser usada para analisar a absorção de glicose e o metabolismo em outros leucócitos encontrados dentro de sangue. Temos extensivamente examinada a captação de células T de 2-NBDG utilizando o método descrito aqui, e foram também examinados 2-NBDG absorção pelas células NK 24. Para a detecção de sucesso de expressão GLUT1 e absorção de 2-NBDG é imperativo para limitarvestígios do tampão de lise de glóbulos vermelhos por lavar as células com tampão de lavagem excesso de acordo com o protocolo, e descobrimos que FITC ou anticorpo GLUT1 APC marcado dar sinais melhores do que os conjugados de PE ou PerCP. Não investigámos as razões para isso.

Uma vez que as células são metabolicamente activas, mesmo a baixas temperaturas, é fundamental que, na sequência da incubação de 2 a 37 NBDG ° C, que os tubos são mantidos directamente em gelo e centrifugação conduzida a 4 ° C. No sinal forte ausência de 2 NBDG, verifique se a concentração correta está sendo usado, reduzir a exposição à luz no quarto e gabinete e tampa tubos de Biossegurança com papel alumínio, quando apropriado. Otimização pode ser exigido através da criação de um curso de tempo experimento captação de 2-NBDG para 5, 15, 20, 30, 60 e 90 min. Normalmente, o tempo ideal deve ser 10-60 min, dependendo de tipos de células e seu estado de ativação.

Uma das principais limitações com o ensaio de absorção de 2-NBDG é Sens luzitivity em conjunto com o facto de que está a ser utilizada pelas células. Assim, é importante limitar o número de amostras para garantir que a última amostra é analisada dentro de 30 minutos da primeira. Uma limitação biológica é que, embora a frequência de Glut1-expressando monócitos não clássicos, e expressão Glut1 em monócitos não clássicos eram significativamente maiores do que os monócitos clássicos, não existiam diferenças na absorção de 2-NBDG entre as duas subpopulações 10. Isto levanta a possibilidade de que outras, tais como Gluts GLUT3 e Glut4 expresso em monócitos pode estar envolvida no metabolismo da glicose em diferentes configurações de doença. É também possível que a actividade da Glut1 pode também ser regulada pós translacionalmente.

Uma grande vantagem do nosso protocolo de citometria de fluxo sobre a captação de glicose rotulagem radioisótopo é a capacidade de combinar com a técnica de análise imunofenotípicas para identificar e estudar subpopulações específicas de células imunes em Small de volume de sangue. Além disso, a actividade de APC-conjugado anti-GLUT1 pode ser aplicado para analisar simultaneamente a expressão da superfície celular GLUT1 e absorção de 2-NBDG. A mudança na expressão GLUT1 devido a absorção de 2-NBDG não foi demonstrado anteriormente, mas esta possibilidade não pode ser descartada.

O aumento da captação de glicose e metabolismo de células imunitárias é uma característica marcante de células T activadas e monócitos 25-27. Estas células podem ser activadas em resposta a infecção por patógenos, 28,29, e os sinais inflamatórios em condições tais como doenças auto-imunes como o lúpus 30-32, e a obesidade e diabetes 8,33. O aumento do metabolismo da glicose é também necessária para a sobrevivência de células de cancro, crescimento e metástases 34. Notavelmente, a desregulação metabólica em células imunes tem emergido como uma indicação de infecção por HIV, e está associada com a activação imunitária 24, inflamação 10, e infecciosidade de células T CD4 + 35-37. Portanto,este método vai ser de interesse para um público diversificado, incluindo aqueles com interesse em doenças mediadas inflamatórias, câncer, doenças infecciosas, imunologia e immunometabolism 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi financiada pelo Centro Australiano para HIV e Hepatite Virology Research (ACH 2) e uma subvenção de desenvolvimento de 2010 (CNIHR) da Universidade de Washington Center for AIDS Research (CFAR), um programa NIH financiados sob o número prêmio AI027757 que é apoiado pelo seguinte NIH institutos e centros (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP é um receptor da concessão 2 CNIHR e ACH. SMC é um destinatário de uma Health and Medical Conselho Nacional de Pesquisa da Austrália (NHMRC) principal Research Fellowship. Os autores agradecem a contribuição para este trabalho do Programa de Apoio Infra-estrutura Operacional Victorian recebido pelo Instituto Burnet. Nós reconhecemos a assistência de Geza Paukovic e Eva Orlowski-Oliver do Mecanismo AMREP Citometria de Fluxo Núcleo de citometria de fluxo formação e aconselhamento técnico. Agradecemos Angus Morgan para o treinamento de mídia e organização da gravação do vídeo. nossa gratidãopara Jesse Masson e Jehad Abdulaziz K. Alzahrani de assistência laboratório durante a gravação do vídeo. Agradecemos os esforços do Dr. David Simar da Faculdade de Ciências Médicas da UNSW, Austrália, que ofereceu aconselhamento metodológico crítico. CSP gostaria de agradecer www.nice-consultants.com de consultas gráficas.

CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES:

CSP concebeu o projeto, concebido e realizado experimentos, analisados ​​e interpretados de dados, e escreveu o manuscrito. JJA interpretado de dados e escreveu o manuscrito. TRB escreveu o manuscrito. JMM interpretado de dados, fizeram sugestões intelectuais críticos e revisão do manuscrito. SMC interpretado de dados, fizeram sugestões intelectuais críticos e revisão do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).

Tags

Immunology 114 Edição monócitos glicose 2-NBDG lactato sangue as PBMC HIV Glut Glut1 inflamação metabolismo immunometabolism glicólise fosforilação oxidativa
A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palmer, C. S., Anzinger, J. J.,… More

Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter