Abstract
في المختبر وتم وضع المقايسات النسخ وتستخدم على نطاق واسع لسنوات عديدة لدراسة الآليات الجزيئية تشارك في النسخ. وتتطلب هذه العملية متعددة فرعية تعتمد على الحمض النووي RNA البلمرة (RNAP) ومجموعة من عوامل النسخ التي تعمل على تعديل نشاط RNAP خلال التعبير الجيني. ويستخدم هلام التسلسل الكهربائي من النصوص رديولبلد لتوفير المعلومات الآلية مفصلة حول كيفية عائدات النسخ، وما هي مواصفات يمكن أن تؤثر عليه. في هذه الورقة وصفنا بروتوكول لدراسة كيفية عامل استطالة ضروري نوسا ينظم التوقف النسخي، وكذلك وسيلة للتعرف على مادة مضادة للبكتريا التي تستهدف بدء النسخ من خلال تثبيط RNAP تشكيل عميم الإنزيم. هذه الأساليب يمكن أن تستخدم كمنصة لتطوير مناهج إضافية لاستكشاف آلية العمل من عوامل النسخ التي ما زالت تزال غير واضحة، وكذلك آجا المضادة للبكتيريا جديدةنهاية الخبر تستهدف النسخ وهو الهدف المخدرات غير مستخدمة بالقدر الكافي في البحث والتطوير للمضادات الحيوية.
Introduction
النسخ هو العملية التي يتم توليفها من الحمض النووي الريبي DNA قالب معين. في الخلايا حقيقية النواة هناك ثلاثة RNAPs متميزة: RNAP أنا المحاضر السلائف الريباسي، RNAP الثاني هو المسؤول عن تخليق مرنا وبعض الرنا نووية صغيرة، ويتم تنفيذ تركيب 5S الريباسي والحمض الريبي النووي النقال من قبل RNAP الثالث. في البكتيريا، لا يوجد سوى RNAP واحدة مسؤولة عن نسخ من جميع الطبقات من الحمض النووي الريبي. هناك ثلاث مراحل النسخ: بدء، واستطالة وإنهاء الخدمة. النسخ هي واحدة من العمليات الأكثر ينظم غاية في الخلية. كل مرحلة من مراحل دورة النسخ تمثل نقطة تفتيش لتنظيم التعبير الجيني 1. لبدء، RNAP أن اقترانه عامل سيغما لتشكيل عميم الإنزيم، وهو مطلوب لتوجيه الإنزيم إلى مواقع معينة تسمى المروجين 2 لتشكيل مجمع المروج مفتوحة. وفي وقت لاحق، مجموعة كبيرة من عوامل النسخ هي المسؤولة عن تنظيم سالأنشطة و RNAP خلال استطالة وإنهاء مراحل. عامل النسخ فحص هنا هو البروتين الحفظ جدا وأساسي، نوسا. وتشارك في تنظيم التوقف النسخ وإنهاء الخدمة، وكذلك مكافحة إنهاء خلال التوليف الريباسي 3-5.
في المختبر تم تطويرها المقايسات النسخ كأدوات قوية لدراسة الخطوات التنظيمية المعقدة خلال النسخ 6. بشكل عام، لا بد من جزء طولي من الحمض النووي بما في ذلك منطقة المروج كقالب لالنسخ. عادة يتم إنشاء قالب الحمض النووي عن طريق PCR أو linearizing البلازميد. ثم تضاف تنقية البروتينات والبرامج الوطنية (بما في ذلك رديولبلد واحد NTP لأغراض الكشف) والمنتج تحليل بعد فترة المطلوبة من الحضانة. باستخدام القوالب المناسبة وظروف التفاعل، وقد تم فحص جميع مراحل النسخ باستخدام هذا النهج الذي مكن التوصيف الجزيئي مفصل من transcription خلال نصف القرن الماضي 7. جنبا إلى جنب مع معلومات عن هيكل 3-الأبعاد من RNAP كان من الممكن أيضا للتحقيق في الآلية الجزيئية لتثبيط النسخ بواسطة المضادات الحيوية ويؤدي للمضادات الحيوية، واستخدام هذه المعلومات في تطوير جديدة، والمخدرات تحسين 8-10.
في هذا العمل ونحن تقديم أمثلة عن كيف يمكن استخدام المقايسات النسخ لتحديد آلية التنظيم من قبل النسخ استطالة / عامل إنهاء نوسا، وكيف أن آلية عمل رواية بدء النسخ المانع الرصاص يمكن تحديدها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تحذير: تجارب تنطوي على استخدام المشعة النظائر 32 P، وينبغي أن يضطلع بها أي عمل حتى يتم استيفاء جميع شروط السلامة المناسبة. عموما هناك حاجة الموظفين لحضور دورة في السلامة والخضوع لممارسة تحت إشراف قبل التجارب باستخدام الكواشف الإشعاعية. يرجى ارتداء معدات الحماية الشخصية (مقياس الجرعة الحراري الضوئي، ونظارات السلامة والقفازات، وغرفة الأشعة معاطف معمل، كامل طول السراويل مغلقة اصبع القدم أحذية) عند تنفيذ رد فعل.
1. إعداد مواد الفحص
- الحصول على البروتينات المطلوبة لفحص النسخ.
- للتجربة وصفها هنا، تحفيزه وتنقية E. القولونية RNAP في المختبر كما هو موضح 11، أو الحصول عليها من مصدر تجاري (قائمة المواد).
ملاحظة: كل من يقدم نتائج مماثلة. ويمكن أيضا أساليب أخرى لتنقية RNAP الأصلي أو تقارب المسمى استخدامها 12،13. ويمكن الحصول على سيغما / العوامل نوسا كما دescribed في العمل السابق 14،15.
- للتجربة وصفها هنا، تحفيزه وتنقية E. القولونية RNAP في المختبر كما هو موضح 11، أو الحصول عليها من مصدر تجاري (قائمة المواد).
- المياه إعداد اثيل Pyrocarbonate (DEPC) المعالجة
ملاحظة: بدلا من ذلك، ريبونوكلياز خالية من المياه يمكن الحصول عليها من مصادر تجارية (قائمة المواد).- إضافة 1 مل اثيل pyrocarbonate (DEPC) إلى 1 لتر من المياه النقية (0.1٪ ت / ت) وتخلط بين عشية وضحاها.
- المياه DEPC الأوتوكلاف ونصائح مرتين.
- إعداد قالب الحمض النووي
- تنقية البلازميد pSG1154 16 و / أو pIA226 17 باستخدام طقم تنقية البلازميد (قائمة المواد) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- لتضخيم القالب لفحوصات النسخ الاعادة (جزء 360 نقطة أساس لدراسة منطقة XYL المروج P)، التجمع تفاعل PCR على الجليد بينهم 25 ميكرولتر مزيج 2X PCR (قائمة المواد)، 2 ميكرولتر كل من الاشعال (5 ميكرومتر) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 "(إلى الأمام) و5'-CCCATTAACATCACCATC-3" (عكس)، 1 ميكرولتر pSG1154 البلازميد العلاقات العامةeparation (250 ميكرون) و 20 ميكرولتر المياه النقية).
- أو بدلا من ذلك، لفحوصات النسخ مستديرة واحدة، وتضخيم شظية 447 نقطة أساس يشمل λ P المنطقة R المروج من pIA226 17. إعداد تفاعل PCR على الجليد باستخدام 25 ميكرولتر 2X PCR المزيج، 2 ميكرولتر كل من الاشعال (5 ميكرومتر): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 "(إلى الأمام) و5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3" (عكس)، pIA226 1 ميكرولتر 17 إعداد البلازميد (250 ميكرون) و 20 ميكرولتر المياه النقية).
ملاحظة: هذا القالب يفتقر السيتوزين حتى موقف +26 الإقليم الشمالي، وهو النوكليوتيدات 26 عشر من موقع النسخ البداية. ولذلك، النسخ باستخدام هذا القالب سيسمح بدء، إزالة المروج والمماطلة في +26 الإقليم الشمالي لتشكيل مجمع استطالة النسخ مستقر (EC) عندما الوحيد ATP، UTP وGTP موجودة في رد الفعل.
- أو بدلا من ذلك، لفحوصات النسخ مستديرة واحدة، وتضخيم شظية 447 نقطة أساس يشمل λ P المنطقة R المروج من pIA226 17. إعداد تفاعل PCR على الجليد باستخدام 25 ميكرولتر 2X PCR المزيج، 2 ميكرولتر كل من الاشعال (5 ميكرومتر): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 "(إلى الأمام) و5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3" (عكس)، pIA226 1 ميكرولتر 17 إعداد البلازميد (250 ميكرون) و 20 ميكرولتر المياه النقية).
- إعداد تفاعل PCR مع الشروط التالية: 95 °؛ مئوية لمدة 30 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتكرار لمدة 30 دورات.
- تنقية المنتج باستخدام مجموعة PCR تنظيف (قائمة المواد) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وأزل في 100 العازلة ميكرولتر النسخ لفحص النسخ.
- تحديد تركيز الحمض النووي القالب باستخدام fluorospectrometer (قائمة المواد).
- إعداد NTP
ملاحظة: يمكن الحصول على هذه البرامج الوطنية من مصادر تجارية مختلفة (قائمة المواد).- حل هذه البرامج الوطنية (≥99٪ نقية) في المياه المعالجة DEPC لجعل 1 M الأسهم، قسامة 1 مل من محلول إلى 1.5 مل أنابيب (50 ميكرولتر في كل أنبوب) ومخزن في -20 درجة مئوية.
- أجل α- 32 P UTP (3000 تسى / ملمول) قبل التجربة. 32 P لديها قصيرة نصف الحياة من 14.29 يوما.
ملاحظة: استخدام UTP المسمى ألفا يتجنب مقارنة كثافة من عصابات مع طول مختلفة.
- إعداد RNA سلم
- تجميع متابعةجي رد فعل في درجة حرارة الغرفة: 0.5 ميكروغرام RNA قالب مزيج (قائمة المواد)، 80 ملي HEPES العازلة pH7.5، 12 ملي MgCl 2، 10 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي DTT، 2 ملم ATP / CTP / GTP، 0.5 ملي UTP، 2 ميكرولتر ألفا 32 P UTP، 0.5 ميكرولتر T7 RNAP (قائمة المواد)، والمياه DEPC المعالجة إلى 20 ميكرولتر.
- تسمح رد فعل على المضي قدما في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. استخدامها على الفور أو تخزين في -80 درجة مئوية.
2. إعداد RNA تسلسل جل
- تحضير هلام
- تنظيف لوحات من جهاز هلام التسلسل (قائمة المواد) مرتين مع 70٪ من الإيثانول والمياه النقية، وتجميع الخلية مع مشط واثنين من الفواصل.
ملاحظة: يمكن أن تطلى لوح واحد مع siliconizing كاشف (قائمة المواد) لتسهيل إزالة هلام في الخطوة 4.2. - حل 33.6 ز اليوريا في 22 مل من الماء و 16.4 مل من 5X تريس / بورات / EDTA (TBE) العازلة (54 ز تريس (hydroxymethyl) aminomethane، 27.5 غ حمض البوريك و 10 مل من 1 M ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، ودرجة الحموضة 7.4 في 1 لتر ماء) باستخدام محرك مغناطيسي.
- إضافة 16 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد حل (19: 1) إلى محلول اليوريا وتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون.
- إضافة 514 ميكرولتر 10٪ (ث / ت) الطازجة فوق كبريتات الأمونيوم في الماء تليها 51.4 ميكرولتر N، N، N '، N' -Tetramethylethylenediamine (TEMED) إلى حل تصفيتها.
- عكس بلطف الحل هلام لتجنب التهوية المفرطة وحقن فورا وسلاسة في الخلية التسلسل معبأة قبل وضعه أفقيا من ثقب حقن السفلي. الحرص على تجنب الوقوع في فقاعات أثناء الحقن.
- السماح 1-1.5 ساعة حتى يتم تعيين تماما هلام قبل استخدامها في فحص النسخ. الجل يمكن أن يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين أو ثلاثة أيام عندما ملفوفة مع الأنسجة المياه الرطب على أعلى الخلية التسلسل.
- تنظيف لوحات من جهاز هلام التسلسل (قائمة المواد) مرتين مع 70٪ من الإيثانول والمياه النقية، وتجميع الخلية مع مشط واثنين من الفواصل.
3. رد فعل النسخ
- النسخ الاستطالة إن الإيقاف المؤقت الفحص
- تشكيل مجمع استطالة النسخ
- إضافة 1 ميكرولتر من RNAP انزيم الأساسية (1 ميكرومتر الأسهم في المخزن النسخ) لأنبوب 1.5 مل.
- إضافة 1 ميكرولتر من تنقية سيغما 70 عامل (σ 70، 3 ميكرومتر الأسهم في المخزن النسخ) إلى RNAP واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة لتشكيل RNAP عميم الإنزيم.
- إضافة 3 ميكرولتر 500 نانومتر قالب تنقية الحمض النووي (λ P R المروج من المنتج pIA226 PCR) في المخزن النسخ لعميم الإنزيم RNAP واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشكيل المجمع مفتوحة.
- تحضير خليط من مكونات رد الفعل في أنبوب آخر 1.5 مل باستخدام 5 ميكرولتر من 10X العازلة النسخ (قائمة المواد: 400 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 1.6 M بوكل، 100 ملي MgCl 2 و 10 ملي DTT و 50٪ الجلسرين، ودرجة الحموضة 7.9 في DEPC المعالجة الماء)، 2 ميكرولتر من 250 ميكرومتر كل GTP وUTP، 1 ميكرولتر من 1 ملي اعبي التنس المحترفين، و 1 ميكرولتر من α- 32 P UTP (3000 تسى / ملمول). إضافة DEPC المياه المعالجة إلى 41 ميكرولتر.
لاالشركة المصرية للاتصالات: ريبونوكلياز المانع (قائمة المواد) يمكن استخدامها للحد من التلوث ريبونوكلياز. - نقل الحل الخليط إلى الأنبوب الذي يحتوي على مجمع مفتوح واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتشكيل توقف مجمع النسخ استطالة في +26 الإقليم الشمالي.
- نقل رد فعل على درجة حرارة الغرفة (~ 21 درجة مئوية) وإضافة 1 ميكرولتر من 2.5 ملغ / مل ريفامبيسين إلى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل.
- إضافة 1 ميكرولتر من 0.1 ملي تنقية نوسا إلى خليط التفاعل واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 2 ميكرولتر من 250 ميكرومتر CTP إلى خليط التفاعل لجعل الحجم النهائي من 50 ميكرولتر وقياس وقت رد الفعل باستخدام جهاز توقيت.
- نقل 5 ميكرولتر من محلول التفاعل إلى 2 ميكرولتر من العازلة RNA هلام تحميل (95٪ الفورماميد، 0.05٪ برموفينول الأزرق و 0.05٪ سيانول زايلين) في 30، 60، 120، 240، 480، و 1،200 ثانية لإرواء رد الفعل.
- التخلص من النصائح 32 P UTP والأنابيب في تابع النفايات المشعةainer.
- تشكيل مجمع استطالة النسخ
- النسخ بدء الفحص
- تشكيل مجمع الفتح
- تمييع تنقيته σ 70-،5 ميكرومتر.
- كرر الخطوات 3.1.1.1 ل3.1.1.3 باستخدام 0.5 ميكرومتر (بدلا من 3 ميكرومتر) تنقيته σ 70، والقالب الحمض النووي (ف المنطقة XYL المروج من المنتجات pSG1154 PCR).
- تثبيط بدء النسخ فحص
- إضافة المانع تهدف إلى منع تشكيل عميم الإنزيم RNAP لانزيم الأساسية RNAP قبل إضافة σ 70 (بعد خطوة 3.1.1.1)، تليها خطوات 3.1.1.2 و3.1.1.3 لفحص ما إذا كان المانع هو قادرة على تعطيل عميم الإنزيم تشكيل.
- بدلا من ذلك، بعد الخطوة 3.1.1.2، إضافة مثبط لدراسة ما إذا كانت قادرة على كبح تنافسية σ 70 ملزمة لRNAP.
- استخدام نفس الكمية من DMSO، ومذيب للالمانع، بدلا من المانع الصورةتوك في التفاعلات السيطرة.
- الانتهاء من رد فعل
- حل الهيبارين في الماء لتركيز الأسهم من 1 ملغ / مل والأوراق المالية في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: الهيبارين هو منافس من الحمض النووي التي يمكن عزل RNAP التي لم تشكل مجمع مفتوح. مرة واحدة يتم تشكيل مجمع مفتوح، الهيبارين لا يمكن أن يدخل الموقع الحمض النووي ملزم من RNAP ويمنع النسخ من مجمع مفتوح شكلت مسبقا. ولذلك، مطلوب الهيبارين فقط لفحوصات جولة واحدة؛ لا حاجة لذلك لفحوصات متعددة الجولة. - تحضير خليط التفاعل باستخدام 5 ميكرولتر من 10X العازلة النسخ (قائمة المواد)، 1 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل الهيبارين، 1 ميكرولتر من 10 ملي كل اعبي التنس المحترفين، GTP، وCTP، 2.5 ملي UTP، و 1 ميكرولتر من α- 32 P UTP (3000 تسى / ملمول). إضافة DEPC المياه المعالجة إلى 45 ميكرولتر.
- مزج خليط التفاعل مع النسخ فتح المجمع، وتدور النبض واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- نقل 10 ميكرولتر من رد فعل لذلكlution إلى 5 ميكرولتر من العازلة RNA هلام تحميل (95٪ الفورماميد، 0.05٪ برموفينول الأزرق و 0.05٪ سيانول زايلين) لإرواء رد الفعل.
- حل الهيبارين في الماء لتركيز الأسهم من 1 ملغ / مل والأوراق المالية في -20 درجة مئوية.
- تشكيل مجمع الفتح
4. RNA جل الجري والتنمية
- تشغيل بولي أكريلاميد جل تغيير طبيعة
- تشغيل هلام في 50 درجة مئوية و 50 W في المخزن 1X TBE لحوالي 1.5 ساعة حتى درجة حرارة جل والمخزن المؤقت مستقرا عند 50 درجة مئوية.
- عينات الحرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ونقلها على الجليد تحميل مسبق على هلام.
- نماذج تحميل في الآبار في الجزء العلوي من هلام جنبا إلى جنب مع حارة واحدة تحتوي على 2 ميكرولتر RNA سلم (1: 100 تمييع).
- تشغيل هلام في 50 واط و 50 درجة مئوية في المخزن 1X TBE حتى يصل برموفينول صبغة زرقاء ~ 2/3 أسفل هلام.
- هلام علاج
- فتح ببطء وبعناية فصل لوحة العلوي من الخلية التسلسل. كل الحرص لتجنب كسر هلام.
- قطع chromatograpاتش واى ورقة (قائمة المواد) لتتناسب مع حجم جل من أعلى إلى برموفينول صبغة زرقاء. استخدام عداد جيجر لتأكيد موقف التقريبي للنسخ الرنا المسمى بالإشعاع.
- تغطية بعناية الجل مع ورقة الترشيح، واضغط بشدة حتى هلام تلتزم ورقة الترشيح. قطع وتجاهل الجزء السفلي من هلام لالنفايات المشعة كما تشغيل هذه البرامج الوطنية الفردية في الجزء السفلي من هلام، والتي يمكن أن تكون ساخنة جدا.
- ضع قطعة مماثلة الحجم من ورق الترشيح على السرير التجفيف آلة فراغ التجفيف، ووضع بعناية ورقة هلام المغلفة على ذلك مع هلام لأعلى.
- تغطية الجل مع غلاف بلاستيكي وجافة عند 60 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
- التفاف على الجانب الآخر من هلام المغلفة ورقة فلتر مع غلاف بلاستيكي، ووضع على لوحة الفوسفور photostimulable في حالة التصوير، مع مدة التعرض المناسبة، التي يمكن أن تختلف من 1 ساعة إلى يتوقف بين عشية وضحاها على كفاءة التفاعل.
- صورة لوحة الفوسفور باستخدامماسح تصوير وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحديد شدة الفرقة النسبية باستخدام برنامج ImageJ وفقا لدليل البرامج.
- استخدام عداد جيجر لفحص التلوث الإشعاعي في منطقة العمل، والقضاء على العناصر المشتبه بهم والمنطقة مع الأنسجة وعامل تنظيف والتخلص من الأنسجة في حاوية التخلص منها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كفاءة النسخ يمكن تحديد ذلك عن طريق قياس مستوى الإشعاع في نطاقات في نقاط زمنية مختلفة. فحص التوقف لاختبار وظيفة عامل نوسا تمكين التصور من وقفة، وإنهاء الخدمة، وجريان المنتجات (الشكل 1A). في وجود مجال ن الطرفية نوسا (نوسا الأمراض الاستوائية المهملة، بقايا الأحماض الأمينية 1-137)، تأخر ظهور منتجات RNA بشكل ملحوظ مقارنة التجربة السيطرة تفتقر نوسا. (بقايا K36، K37، R104، Q108، K111، Q112، Q116، وR119) أدى حذف بقايا الأحماض الأمينية 104-137 (اللولب 3) من جزء نوسا، أو تغيير في ألانين من سلسلة من الأحماض الأمينية في كامل فقدان النشاط وقفة نوسا. عرضت الحلزون 3 بقايا R104 و K111 على أنها ضرورية للنشاط وقفة نوسا الأمراض الاستوائية المهملة ومع R104A ويبني K111A إعطاء قفة مماثلة القيم نصف الحياة إلى السيطرة حيث كان نوسا NTD غائب (الشكل 1B). انهاتجدر الإشارة hould معها أن حذف اللولب 3 أو تغيير هذه المخلفات من الأحماض الأمينية هما ليس له تأثير على نوسا ملزمة لRNAP 15. وأشارت ونتيجة لذلك R104 و K111 كانت الأحماض الأمينية الأساسية المطلوبة لتنظيم النشاط وقفة نوسا.
وبالمثل، كما هو مبين في الشكل 2A، أظهر منحنى الاستجابة للجرعة تثبيط النسخ في المختبر (متعددة على مدار) باستخدام تركيزات مختلفة من التي تم تشخيصها حديثا النسخ مثبط للبكتيريا C5 14. وقد تم تحديد C5 بعد في شاشة سيليكون من مشروع لاستهداف بعقلانية تفاعل σ 70 مع موقع ملزم كبير على RNAP تسمى المنطقة المشبك اللولب 18. مع إضافة C5 في رد فعل النسخ، ويمكن هذا المركب منافسة σ 70 للربط إلى RNAP، وبالتالي تحول دون النسخ. ميكانيكيا، إضافة C5 إلى RNAP تليها σ <سوب> كان 70 عاملا إلى خليط التفاعل بشكل ملحوظ أكثر كفاءة لتثبيط النسخ من التجربة باستخدام C5 بعد تشكيل عميم الإنزيم RNAP (الشكل 2B). وأظهرت هذه النتائج أن σ 70 لا يمكن أن تحل محل C5 بد أن RNAP، أو أن C5 لا يمكن أن تحل محل σ 70 بد أن RNAP في مقايسة جولة واحدة بكفاءة.
الشكل 1: آثار المسخ نوسا NTD في النسخ (A) المقايسات النسخ وقفة دون نوسا، وذلك باستخدام نوسا NTD (+ نوسا)، نوسا NTD مع الحلزون 3 حذف (Δ اللولب)، ونوسا NTD مع بدائل ألانين في بقايا K36، K37 ، R104، Q108، K111، Q112، Q116، وR119 (جميع علاء). P، الموقع وقفة. T، الموقع الإنهاء؛ ريال عماني، الاعادة. أسافين فوق هلام تظهر نقاط الوقت العينة (0.5، 1، 1.5، 2، 5 و 10 دقيقة) 15؛ (ب) النشاط وقفة من حياة نصف من متحولة نوسا الأمراض الاستوائية المهملة نسبة إلى البرية من نوع البروتين. متوسط 3 تجارب مع SD. تم تعديل هذا الرقم من الأحماض النووية بحوث 43 (5)، 2829-2840 (2015). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النسخ عن طريق تثبيط C5 مجمع (A) منحنى تثبيط E. القولونية RNAP النسخ التي كتبها C5 مجمع في متعددة على مدار فحص 14. تم تحديد النسبة المئوية للتثبيط من النسخ من قبل المنتج RNA نسبة إلى عنصر تحكم (لا C5 الحاضر) ضد تركيز C5 المستخدمة في رد الفعل. (ب) نسبة النشاط المثبطة من C5 مجمع في الجولة ثلاالمقايسات anscription مع إضافة C5 قبل (مجمع + σ 70، الرمادي) وبعد (عميم الإنزيم + C5، أسود) عميم الإنزيم تشكيل. تم تعديل هذا الرقم من ACS تصيب. ديس 2، 39-46 (2016). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في جميع الكائنات الحية، والنسخ هو عملية تنظيم محكم. في المختبر وضعت المقايسات النسخ لتوفير منصة لاختبار آثار عوامل النسخ، والجزيئات الصغيرة ومثبطات النسخ. في هذه الورقة الأسلوب، وقد وصفت مقايسة لنسخ البكتيرية العام. المقايسات النسخ جنبا إلى جنب مع تسلسل هلام الكهربائي من النصوص مهمة جدا لدراسات الميكانيكية لأنها تسمح التصور لجميع المنتجات النسخ على طول الخط. ونتيجة لذلك، وهذه الطريقة هي قادرة على تحديد تأثير التغيرات الطفيفة في ظروف التفاعل والكشف عن آلية مقبولة للعمل. وعلاوة على ذلك، يصبح من الممكن تصميم المقايسات النسخ محددة فيما يتعلق ظيفة من عوامل النسخ مع آليات غير معروفة للعمل.
في هذه الورقة وصفنا أيضا طريقة لتأكيد آلية عمل مثبط لRNAP holoenتشكيل إنزيم. الطريقة الموصوفة هنا يمكن عرض تغيير كل نسخة الرنا مع مرور الوقت، ومع التعديل المناسب يمكن تمكين اختبار وكلاء المضادة للبكتيريا ضد كل خطوة من النسخ حسب الاقتضاء. مقايسة متعددة على مدار يمكن أن تستخدم النسبي طريقة فحص بسيط لتحديد النسخ التي تستهدف مثبطات جديدة، في حين أن الفحص جولة واحدة يمكن استخدامها لدراسة آلية مثبطات، مثل خصائص تنافسية / غير تنافسية. لاحظ أن تجميع الجزيئات الصغيرة يمكن أن يسبب إصابات إيجابية كاذبة باسم مثبطات غير تنافسية في عملية اكتشاف المخدرات واحدة دراسة الآلية الجولة قد توفير نهج شامل لتقييم الكر إلى الرصاص. ونتيجة لذلك، فإن هذه العملية النسخ تسيطر قادرة على الكشف عن بالضبط كيف يؤثر المانع النسخ، والتي يمكن أن تساعد في دي نوفو تصميم الأدوية ترشيد. جنبا إلى جنب مع معلومات عالية الدقة على مواقع الربط المانع بواسطة الأشعة السينية ستو البلوراتيموت، وتصميم الأدوية العقلاني القائم على بنية تكون قابلة للغاية لتطبيق في اكتشاف المخدرات تستهدف النسخ.
وعلى الرغم من النتائج الإنتاجية العالية لا يمكن الحصول عليها مع فحوصات في المختبر النسخ، فهي مفيدة للغاية في تشريح آليات دقيقة المرتبطة السيطرة على النسخ. مكونات وشروط الفحص يمكن تعديلها بسهولة لتلبية الاحتياجات الفردية. عوامل مختلفة (على سبيل المثال، نوسا) 4، 15، جزيئات صغيرة (على سبيل المثال، ppGpp) 19 و / أو النسخ مثبطات (على سبيل المثال، ريفامبيسين) 20 من الفائدة يمكن أن تضاف إلى اختبار وظائف في تنظيم النسخ. قالب الحمض النووي يجب أن تكون مصممة بشكل فردي، مع اختيار دقيق من المروجين قوي، تسلسل وقفة والإنهاء. من أجل تحقيق استنساخ عالية من الفحص، يجب أن البروتينات العالية النقاء وخالية من النشاط ريبونوكلياز المتبقية، والعازلة النسخ، قالب الحمض النووي، وحل سهم يجب أن يتم في DEPC ركائز NTP تعامل المياه. وقد وصفت استخدام هذه البرامج الوطنية المشعة في هذه الورقة، ولكن النيوكليوتيدات الفلورسنت ويمكن أيضا أن تستخدم 21. نوعية القالب الحمض النووي هو أمر حاسم لنجاح فحص النسخ. يجب تضمين تباعد كافية بين المروج / إيقاف مؤقت / فاصل، والسماح للمنتجات النسخ المختلفة لفصلها وفحصها بشكل صحيح. هلام تسلسل يجب أن تصب بشكل صحيح ويجب استخدام عازلة TBE جديدة نسبيا بالنسبة الكهربائي لتحقيق أعلى دقة ممكنة من النصوص الحمض النووي الريبي. إذا لاحظت تدهور المنتج النسخ، ويجب أن تدمج جودة عالية المانع ريبونوكلياز في خليط التفاعل النسخ. أنابيب ونصائح ماصة يجب تعقيمها مزدوجة وقفازات يجب أن ترتديه في جميع الأوقات عند إجراء الفحص، وذلك للحد من إدخال ريبونوكلياز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
