Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

In vitro-transskription Analyser og deres anvendelse i Drug Discovery

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54256

Abstract

In vitro er blevet udviklet transskription assays og bredt anvendt i mange år til at undersøge de molekylære mekanismer, der er involveret i transskription. Denne proces kræver multi-subunit DNA-afhængig RNA-polymerase (RNAP) og en række transkriptionsfaktorer, som virker til at modulere aktiviteten af ​​RNAP under genekspression. Sekventering gelelektroforese af radioaktivt mærkede udskrifter bruges til at give detaljerede mekanistisk information om, hvordan transskription provenu og hvilke parametre kan påvirke den. I denne artikel beskriver vi protokollen at undersøge, hvordan det væsentlige elongeringsfaktor NusA regulerer transkriptionel pause, såvel som en fremgangsmåde til at identificere et antibakterielt middel målretning transkriptionsinitiering gennem hæmning af RNAP holoenzym formation. Disse metoder kan anvendes en som platform for udvikling af yderligere fremgangsmåder til at udforske virkningsmekanismen for de transkriptionsfaktorer, som stadig uklart, såvel som nye antibakterielle agents målretning transkription, som er en underudnyttet lægemiddelmål i antibiotisk forskning og udvikling.

Introduction

Transkription er den proces, hvor RNA syntetiseres ud fra en specifik DNA-skabelon. I eukaryote celler der er tre forskellige RNAPs: RNAP I transskriberer rRNA forstadier, RNAP II er ansvarlig for syntesen af ​​mRNA og visse små nukleare RNA'er, og syntesen af ​​5S rRNA og tRNA udføres ved RNAP III. I bakterier, er der kun én RNAP ansvarlig for transkriptionen af ​​alle klasser af RNA. Der er tre stadier af transskription: initiering, forlængelse og ophør. Transskription er en af ​​de mest stærkt regulerede processer i cellen. Hver fase i transskription cyklus repræsenterer en kontrolpost for regulering af genekspression 1. For initiering, RNAP har at associere med en sigma faktor til dannelse holoenzym, som er nødvendige for at dirigere enzymet til specifikke steder kaldes promotorer 2 til dannelse af et åbent promotorkompleks. Efterfølgende en stor suite af transkriptionsfaktorer er ansvarlige for regulering of RNAP aktiviteter i løbet af forlængelse og opsigelse faser. Transkriptionsfaktoren undersøgt her er den stærkt konserveret og essentielt protein, NusA. Det er involveret i reguleringen af transskription pause og opsigelse, samt anti-afslutning i løbet af rRNA syntese 3-5.

In vitro er blevet udviklet transskription analyser som effektive værktøjer til at studere de komplekse regulerende trin under transskription 6. Generelt er et lineært fragment af DNA, herunder en promotorregion kræves som template for transkription. DNA-templaten er normalt dannet ved PCR eller ved linearisering af et plasmid. Oprensede proteiner og NTP'er (herunder en radioaktivt mærket NTP til afsløring formål) tilsættes derefter og produkt analyseret efter den krævede inkubationstid. Brug passende skabeloner og reaktionsbetingelser, har alle faser af transskription blevet undersøgt ved hjælp af denne metode, som har gjort det muligt detaljeret molekylær karakterisering af transcription løbet af det sidste halve århundrede 7. I kombination med oplysninger om den 3-dimensionelle struktur RNAP har det også været muligt at undersøge den molekylære mekanisme af transskription hæmning af antibiotika og antibiotiske kundeemner, og bruge denne information til udvikling af nye og forbedrede lægemidler 8-10.

I dette arbejde er der mange eksempler på, hvordan transskription assays kan anvendes til at bestemme mekanismen for regulering af transkription forlængelse / termineringsfaktor NusA, og hvordan kan bestemmes virkningsmekanismen af ​​et hidtil ukendt transkriptionsinitiering inhibitor bly.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsigtig: Forsøg indebærer brug af den radioaktive isotop 32 P og bør foretages intet arbejde indtil alle passende sikkerhedsbetingelser er opfyldt. Generelt personale er forpligtet til at deltage i et sikkerhedskursus og gennemgå superviseret praksis forud for forsøg med radioaktive reagenser. Venligst bære personlige værnemidler (termonuminiscente dosimeter, sikkerhedsbriller, handsker, stråling værelse kitler, fuld længde bukser, lukket-tå sko), når du udfører reaktionen.

1. Fremstilling af Assay Materials

  1. Finde et Proteiner kræves for transskription assay.
    1. For eksperimentet beskrevet her, overproducere og oprense E. coli RNAP i laboratoriet, som beskrevet 11, eller få fra en kommerciel kilde (Materialer List).
      Bemærk: Begge giver lignende resultater. Andre fremgangsmåder til oprensning af nativt eller affinitet mærket RNAP kan også anvendes 12,13. Sigma / nusa faktorer kan fås som described i tidligere arbejde 14,15.
  2. Fremstilling af diethylpyrocarbonat (DEPC) behandlet vand
    Bemærk: Alternativt kan fås RNase-frit vand fra kommercielle kilder (Materialer liste).
    1. Tilsæt 1 ml diethylpyrocarbonat (DEPC) til 1 l renset vand (0,1% v / v) og blandes natten over.
    2. Autoklave DEPC vand og tips to gange.
  3. DNA Template Preparation
    1. Oprense plasmid pSG1154 16 og / eller pIA226 17 under anvendelse af et plasmid-oprensningskit (Materialer List) ifølge producentens instruktioner.
    2. At amplificere template for run-off transskription assays (en 360 bp fragment omfattende den P xyl promotorregionen), samle en PCR-reaktion på is including 25 pi 2x PCR-blanding (Materialer List), 2 pi af hver af primerne (5 uM) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(fremad) og 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (tilbage), 1 pi pSG1154 plasmid preparation (250 uM) og 20 pi oprenset vand).
      1. Eller alternativt for enkelt runde transskription assays, amplificere et 447 bp fragment, der omfatter λ P R promotorregion fra pIA226 17. Opsætning af en PCR-reaktion på is under anvendelse af 25 pi 2x PCR-blanding, 2 pi hver af primerne (5 uM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(fremad) og 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (revers), 1 pi pIA226 17 plasmidpræparat (250 uM) og 20 pi oprenset vand).
        Bemærk: Denne skabelon mangler cytosin indtil 26 nt position, som er den 26. nukleotid fra transkriptionsstartstedet. Derfor transkription ved hjælp af denne skabelon vil tillade initiering, promotor clearance og motorstop på +26 nt at danne en stabil transskription forlængelse kompleks (EF) når kun ATP, UTP og GTP er til stede i reaktionen.
    3. Opsæt en PCR-reaktion med følgende betingelser: 95 °; C i 30 sek, 50 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek, gentaget i 30 cykler.
    4. Oprens produktet med en PCR clean-up kit (Materialer List) ifølge producentens instruktioner og eluer i 100 pi transskription buffer for transkriptionen assay.
    5. Bestem template-DNA koncentration på en fluorospectrometer (Materialer List).
  4. NTP Forberedelse
    Bemærk: NTP'er kan fås fra forskellige kommercielle kilder (Materialer List).
    1. Opløs NTP'er (≥99% rent) i DEPC-behandlet vand til at gøre en M bestand, portion 1 ml af opløsningen i 1,5 ml rør (50 pi i hvert rør) og opbevares ved -20 ° C.
    2. Ordre α- 32P UTP (3.000 Ci / mmol) forud for eksperimentet. 32p har en kort halveringstid på 14.29 dage.
      Bemærk: Brug af alpha-mærket UTP undgår at sammenligne intensiteten af ​​bånd med forskellig længde.
  5. RNA Ladder Forberedelse
    1. Saml opfølgninging reaktion ved stuetemperatur: 0,5 ug RNA skabelon Mix (Materialer List), 80 mM HEPES-buffer pH 7,5, 12 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 pi a-32P UTP, 0,5 pi T7 RNAP (Materialer List), DEPC-behandlet vand til 20 pi.
    2. Tillad reaktionen at forløbe ved 37 ° C i 1 time. Anvendes straks eller opbevares ved -80 ° C.

2. Fremstilling af RNA Sequencing Gel

  1. gel Fremstilling
    1. Rengør pladerne fra en sekventering gel apparat (Materialer List) to gange med 70% ethanol og renset vand, og saml celle med en kam og to afstandsstykker.
      Bemærk: En plade kan overtrækkes med silikonebehandling reagens (Materialer List) for at lette gel fjernelse i trin 4.2.
    2. Opløs 33,6 g urinstof i 22 ml vand og 16,4 ml 5x Tris / Borat / EDTA (TBE) puffer (54 g tris (hydroxymethyl) aminomethan; 27,5 g borsyre; 10 ml 1 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), pH 7,4 i 1 liter vand) under anvendelse af en magnetisk omrører.
    3. Tilsættes 16 ml 40% acrylamid / bis-acrylamid-opløsning (19: 1) til urinstofopløsningen og filtreres gennem et 0,45 um filter.
    4. Tilføj 514 pi 10% (vægt / volumen) frisk fremstillet ammoniumpersulfat i vand efterfulgt af 51,4 ​​pi N, N, N ', N' tetramethylethylendiamin (TEMED) til den filtrerede opløsning.
    5. Vend forsigtigt gelen løsning til at undgå overdreven beluftning og injicere det samme og gnidningsløst ind i den horisontalt placeret færdigpakkede sekventering celle fra bunden indsprøjtning hul. Vær omhyggelig med at undgå at gøre bobler under injektion.
    6. Tillad 1-1,5 time indtil gelen er fuldstændigt indstillet før anvendelse i en transskription assay. Gelen kan opbevares ved stuetemperatur i to eller tre dage, hvor omviklet med vand-vådt væv på toppen af ​​sekventering celle.

3. transkriptionsreaktion

  1. Transskription Forlængelse Pause Assay
    1. Dannelse af en transskription forlængelse kompleks
      1. Tilsæt 1 pi RNAP core enzym (1 uM stamopløsning i transskription buffer) til et 1,5 ml rør.
      2. Tilsæt 1 pi oprenset sigma-70 faktor (σ 70; 3 uM stamopløsning i transskription buffer) til RNAP og inkuberes på is i 10 minutter til dannelse RNAP holoenzym.
      3. Tilsæt 3 pi 500 nM oprenset template-DNA (λ P R promotoren fra pIA226 PCR-produkt) i transkription puffer til RNAP holoenzym og inkuberes ved 37 * C i 5 minutter til dannelse af det åbne kompleks.
      4. Der fremstilles en blanding af reaktionskomponenterne i et andet 1,5 ml rør under anvendelse 5 pi 10x transkription puffer (Materialer List: 400 mM Tris-HCI, 1,6 M KCI, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, 50% glycerol, pH 7,9 i DEPC behandlet vand), 2 pi 250 uM hver GTP og UTP, 1 pi 1 mM ATP og 1 pi af α- 32P UTP (3.000 Ci / mmol). Tilføj DEPC behandlet vand til 41 pi.
        Ingente: RNase-inhibitor (Materialer List) kan anvendes til at minimere RNase kontaminering.
      5. Overfør blandingen løsning på røret med åben komplekset og inkuberes ved 37 * C i 15 minutter til dannelse af transkription forlængelse komplekset stoppet ved 26 nt.
      6. Flyt reaktion ved stuetemperatur (~ 21 ° C) og tilsæt 1 pi 2,5 mg / ml rifampicin til en slutkoncentration på 50 ug / ml.
      7. Tilsæt 1 pi 0,1 mM oprenset NusA til reaktionsblandingen og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
      8. Tilsæt 2 pi 250 pM CTP i reaktionsblandingen at foretage en endelig volumen på 50 pi og måle reaktionstiden ved hjælp af en timer.
      9. Overfør 5 pi af reaktionsopløsningen i 2 pi RNA gel loading buffer (95% formamid, 0,05% bromphenolblåt og 0,05% xylencyanol) ved 30, 60, 120, 240, 480 og 1.200 sek for at standse reaktionen.
      10. Bortskaf de 32 P UTP tips og rør i en cont radioaktivt affaldainer.
  2. Transkriptionsinitiering Assay
    1. Dannelse af Open Complex
      1. Fortynd oprenset σ 70 til 0,5pM.
      2. Gentag trin 3.1.1.1 til 3.1.1.3 hjælp 0,5 uM (i stedet for 3 uM) renset σ 70, og DNA-skabelon (P xyl promoter region fra pSG1154 PCR-produkt).
    2. Hæmning af transkriptionsinitiering assay
      1. Tilføj inhibitoren designet til at forhindre RNAP holoenzym formation for at RNAP kerne enzym før tilsætning af σ 70 (efter trin 3.1.1.1), efterfulgt af trin 3.1.1.2 og 3.1.1.3 at undersøge, om inhibitoren er i stand til at forstyrre holoenzym formationen.
      2. Alternativt efter trin 3.1.1.2, tilsæt inhibitor at undersøge, om det er i stand til kompetitivt hæmme σ 70 binding til RNAP.
      3. Brug den samme mængde DMSO, opløsningsmidlet af inhibitoren, i stedet for inhibitoren stock i kontrolreaktioner.
    3. Færdiggørelse af reaktionen
      1. Opløs heparin i vand til en stamkoncentration på 1 mg / ml og lager ved -20 ° C.
        Bemærk: Heparin er en konkurrent til DNA, der kan udskille RNAP, der ikke dannet et åbent kompleks. Når den åbne kompleks er dannet, kan heparin ikke komme ind i DNA-bindende site af RNAP og inhibere transkription fra prædannet åben kompleks. Derfor er heparin kun påkrævet for single-runde analyser; det er ikke nødvendigt for multi-runde assays.
      2. Forbered reaktionsblandingen under anvendelse af 5 pi 10x transkription puffer (Materialer List), 1 pi 1 mg / ml heparin-opløsning, 1 pi 10 mM hver ATP, GTP, og CTP, 2,5 mM UTP, og 1 pi af α- 32 P UTP (3.000 Ci / mmol). Tilføj DEPC behandlet vand til 45 pi.
      3. Bland reaktionsblandingen med transkriptionen åben kompleks, puls spin og inkuberes ved 37 ° C i 20 min.
      4. Overfør 10 ul af reaktionen sålution i 5 pi RNA gel loading buffer (95% formamid, 0,05% bromphenolblåt og 0,05% xylencyanol) for at standse reaktionen.

4. RNA Gel Løb og Udvikling

  1. Kørsel denatureringen Polyacrylamid Gel
    1. Kør gelen ved 50 ºC og 50 W i 1 x TBE-buffer i ca. 1,5 timer, indtil temperaturen af ​​gelen og bufferen er stabil ved 50 * C.
    2. Heat prøverne ved 90 ºC i 30 sek og flytte dem over på is før læsning på gelen.
    3. Indlæs prøver i brøndene på toppen af ​​gelen ved siden af ​​bane indeholdende 2 pi RNA stige (1: 100 fortynding).
    4. Kør gel ved 50 W og 50 ºC i 1x TBE-buffer, indtil bromphenolblåt farvestof når ~ 2/3 ned gelen.
  2. Gel Treatment
    1. Åbnes langsomt og forsigtigt adskille den øvre plade fra sekventering celle. Vær meget omhyggelig med at undgå at bryde gelen.
    2. Cut chromatography papir (Materialer List), der passer gelen størrelse fra toppen til bromphenolblåt-farvestof. Brug en geigertæller at bekræfte den omtrentlige position af radioaktivt mærkede RNA-transkripter.
    3. dækker forsigtigt gelen med filtrerpapir, og tryk fast indtil gelen klæber til filtrerpapiret. Afskåret og kassér bunden af ​​gelen til radioaktivt affald som de personlige NTP'er løber til bunden af ​​gelen, hvilket kan være meget varm.
    4. Placer en lignende størrelse stykke filtrerpapir på bed-tørring af vakuum-tørring maskine, og omhyggeligt lægge gel-coatede papir på det med gelen opad.
    5. Dæk gelen med en plastfolie og tør ved 60 ° C i 1,5 timer.
    6. Wrap den anden side af gelen coated filterpapir med plastfolie, og læg på en fotostimulerbare fosfor plade i imaging tilfældet, med den passende eksponeringstid, som kan variere fra 1 time til natten afhængigt af reaktionen effektivitet.
    7. Billede fosfor plade ved hjælpen billeddanner scanner ifølge producentens anvisninger. Bestem den relative band intensitet ved hjælp ImageJ software i henhold til den software manual.
    8. Brug en geigertæller til at kontrollere den radioaktive forurening i arbejdsområdet, tørre formodede poster og område med væv og et rengøringsmiddel og bortskaffes vævet i container bortskaffelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transskription effektivitet kan bestemmes ved måling af stråling i båndene på forskellige tidspunkter. Den pause assay til at teste funktionen af NusA faktor aktiveret visualisering af pausen, opsigelse, og afstrømning produkter (figur 1A). I nærvær af det N-terminale domæne af NusA (NusA NTD; aminosyrerester 1-137), blev forekomsten af ​​RNA-produkterne betydeligt forsinket sammenlignet med kontrollen eksperiment manglede NusA. Deletion af aminosyrerester 104-137 (Helix 3) i NusA fragment eller ændring til alanin af en serie af aminosyrer (resterne K36, K37, R104, Q108, K111, Q112, Q116, og R119) resulterede i det komplette tab af NusA pause aktivitet. Helix 3 rester R104 og K111 viste sig at være afgørende for NusA NTD pause aktivitet og med R104A og K111A konstruktioner giver tilsvarende pause halveringstider til kontrol, hvor NusA NTD var fraværende (figur 1B). Det should bemærkes, at deletion af Helix 3 eller ændring af disse to aminosyrerester har nogen virkning på NusA binding til RNAP 15. Resultatet foreslog, at R104 og K111 var de vigtigste aminosyrer, der kræves til regulering af NusA pause aktivitet.

Ligeledes som vist i figur 2A, dosis-respons-kurven demonstrerede inhibering af in vitro transkription (multi-round) under anvendelse af forskellige koncentrationer af et nyligt identificeret bakteriel transskriptionsinhibitor C5 14. C5 blev identificeret efter en i silico skærm fra projekt til rationelt målrette interaktionen af σ 70 med dens store bindingssted på RNAP kaldet Clamp-Helix region 18. Med tilsætning af C5 i transkriptionsreaktion, kan denne forbindelse konkurrere mod σ 70 for binding til RNAP, og dermed inhiberede transkription. Mekanistisk tilsætning C5 til RNAP efterfulgt af σ <sup> 70 faktor til reaktionsblandingen var signifikant mere effektiv til transskription inhibering end eksperiment ved hjælp C5 efter dannelsen af RNAP holoenzym (figur 2B). Disse resultater viste, at σ 70 ikke kunne fortrænge C5 bundet til RNAP, eller at C5 kunne ikke effektivt fortrænge σ 70 bundet til RNAP i en enkelt-runde-assay.

figur 1
Figur 1:. Effekter af Mutant NusA NTD i transskription (A) Transskription pause analyser uden NusA, der bruger NusA NTD (+ NusA), Nusa NTD med helix 3 udgår (Δ Helix), og NusA NTD med alaninsubstitutioner på rester K36, K37 , R104, Q108, K111, Q112, Q116, og R119 (All Ala). P, pause stedet; T, opsigelse stedet; RO, afstrømning. Kiler over gelen demonstrere tidspunkter udtages prøver af (0,5, 1, 1,5, 2, 5 og 10 min) 15; (B) Pause aktivitet af halveringstider på mutant NusA NTD forhold til vildtypeproteinet. Gennemsnit af 3 forsøg med SD. Dette tal er blevet ændret fra Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Transkription inhibering med forbindelse C5 (A) Inhibering kurve af E. coli RNAP transkription ved forbindelsen C5 i en multi-round assay 14. Procent inhibering af transkription blev bestemt ved RNA-produkt forhold til en kontrol (ingen C5 stede) mod koncentrationen af ​​C5 anvendes i reaktionen. (B) Procent inhiberende aktivitet af forbindelse C5 i single-round transcription analyser med tilsætning af C5 før (kompleks + σ 70, grå) og efter (holoenzym + C5, sort) holoenzym dannelse. Dette tal er blevet ændret fra ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I alle organismer, transkription er et tæt reguleret proces. In vitro transcription assays er blevet udviklet for at tilvejebringe en platform for afprøvning af effekten af transkriptionsfaktorer, små molekyler og transskription inhibitorer. I denne fremgangsmåde papir, blev et assay til generel bakteriel transkription beskrevet. Transskription assays kombineret med sekventering gelelektroforese af transkripter er meget vigtige for mekanistiske undersøgelser, da de tillader visualisering af alle transkriptionsprodukter langs en tidslinje. Som følge heraf er denne metode kan identificere indflydelse af mindre ændringer i reaktionsbetingelserne og afslørende en plausibel virkningsmekanisme. Endvidere bliver det muligt at designe specifikke transkriptionsfaktorer assays med hensyn til funktionen af ​​transkriptionsfaktorer med ukendte virkningsmekanismer.

I dette papir beskrev vi også metoden til bekræftelse af virkningsmekanismen af ​​en inhibitor af RNAP holoenzyme formation. Den her beskrevne metode kan vise ændringen af ​​hvert RNA transkript med tiden, og med passende modifikation kan aktivere afprøvning af antibakterielle midler mod hvert trin af transkription efter behov. Den multi-runde assay kan anvendes som en relativ simpel screeningsmetode til at identificere nye transskription målretning inhibitorer, medens enkelt runde assay kan anvendes til at studere den mekanisme af inhibitorer, såsom konkurrerende / ikke-konkurrerende egenskaber. Bemærk, at små molekylære sammenlægning kan give falske positive hits som ikke-kompetitive inhibitorer i lægemiddelforskning processen og enkelt runde mekanistisk forsøg kan give en samlet tilgang til hit-til-lead evaluering. Som følge heraf denne kontrollerede transskription proces er i stand til præcist at oplyse, hvordan en inhibitor påvirker transkription, som kan hjælpe med rationaliseres de novo drug design. Sammen med høj opløsning på inhibitor bindingssteder ved røntgen krystallografisk studør, strukturbaseret rationelt lægemiddeldesign vil være yderst modtagelig for anvendelse inden for lægemiddelforskning målretning transkription.

Selv om det ikke kan opnås med højt gennemløb resulterer med in vitro transcription assays, de er ekstremt nyttige i dissekere de præcise mekanismer, der er forbundet med regulering af transkription. Komponenterne og assaybetingelser kan let modificeres til individuelle behov. Forskellige faktorer (f.eks NusA) 4, 15, små molekyler (f.eks ppGpp) 19 og / eller transskription hæmmere (f.eks, rifampicin) kan tilføjes 20 af interesse for at teste deres funktioner i transskription regulering. DNA-skabelonen skal individuelt designet, med omhyggeligt valg af stærke promotorer, pause sekvens og terminatorer. For at opnå høj reproducerbarhed af assayet, skal proteiner højt oprenset og fri for tilbageværende RNase-aktivitet, og transkriptionen buffer, DNA-skabelon, ogstamopløsning af NTP substrater skal foretages i DEPC behandlet vand. Anvendelsen af radioaktive NTP'er blev beskrevet i dette dokument, men fluorescerende nukleotider kan også anvendes 21. Kvaliteten af ​​DNA-templaten er kritisk for succesen af ​​transskription assay. Tilstrækkelig afstand mellem promotor / pause / terminator skal medtages, så de forskellige transskription produkter, der skal ordentligt adskilt og undersøgt. Sekventeringsgelen skal være korrekt hældes og relativt frisk TBE buffer skal anvendes til elektroforese at opnå den højest mulige opløsning af RNA-transkripter. Hvis nedbrydning af transkriptionsprodukt er bemærket, skal høj kvalitet RNase inhibitor inkorporeres i transkription-reaktionsblandingen. Rør og pipettespidser skal dobbelt autoklaveres og handsker skal bæres på alle tidspunkter, når du udfører analysen, for at minimere indførelsen af ​​RNase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Obtain the proteins required for transcription assay
E. coli RNAP Epicentre S90250
Preparation of DEPC-treated water
diethyl pyrocarbonate (DEPC)  Sigma-Aldrich  D5758
RNase-free water 
Ambion Nuclease-Free Water ThermoFisher AM9937
DNA template preparation
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1330
ACCUZYME Mix Bioline BIO-25028
PCR primers
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281
NanoDrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific ND-3300
NTP Preparation
ATP Sigma-Aldrich  A6559
UTP Sigma-Aldrich  U1006
GTP Sigma-Aldrich  G3776
CTP Sigma-Aldrich  C9274
High Purity rNTPs GE Healthcare 27-2025-01
α-32P UTP  PerkinElmer   BLU007C001MC Radioactive compound
RNA ladder preparation 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb Millipore 69003
HEPES Sigma-Aldrich  H7006
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M8266
DTT Sigma-Aldrich DTT-RO
T7 RNAP Promega P2075
Gel preparation
Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell  Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich  SL2
urea   Sigma-Aldrich  U6504
tris(hydroxymethyl)aminomethane   Sigma-Aldrich  154563
boric acid  Sigma-Aldrich  B7901
ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich  ED
40% Acrylamide/bis-acrylamide  Sigma-Aldrich  A9926
ammonium persulfate  Sigma-Aldrich  A3678
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Transcription Assay
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
rifampicin   Sigma-Aldrich  R3501
formamide   Sigma-Aldrich  F9037
bromophenol blue  Sigma-Aldrich  B0126
xylene cyanol  Sigma-Aldrich  X4126
heparin  Sigma-Aldrich  84020
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Transcription buffer 
Tris base Sigma-Aldrich  T1503
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M2393
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
Filter paper
Whatman 3MM Chr Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-5
Radioactive decontaminant
Decon 90 decon decon90
Gel Treatment
Typhoon Trio+ imager GE Healthcare Life Sciences 63-0055-89

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
  2. Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
  3. Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
  4. Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
  5. Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
  6. Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
  7. Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
  8. Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
  9. Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
  10. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
  11. Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
  12. Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
  13. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
  14. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
  15. Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
  16. Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
  17. Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
  18. Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
  19. Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
  20. Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
  21. Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).

Tags

Genetik Molekylærbiologi transskription RNA-polymerase transskription faktorer Nusa sigma faktor antibakterielle midler
<em>In vitro-transskription</em> Analyser og deres anvendelse i Drug Discovery
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, X., Ma, C. In VitroMore

Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter