Abstract
במבחנת מבחני שעתוק פותחו בשימוש נרחב במשך שנים רבות כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים שעתוק. תהליך זה דורש RNA פולימראז רב למקטע תלוי DNA (RNAP) וסדרה של גורמי שעתוק שפועלים כדי להשפיע על פעילותם של RNAP במהלך ביטוי גנים. רצף ג'ל אלקטרופורזה של תמלילי רדיואקטיבי משמשת כדי לספק מידע מכניסטית מפורט על איך תמורת שעתוק ומה פרמטרים יכול להשפיע על זה. במאמר זה נתאר את הפרוטוקול ללמוד כיצד גורם התארכות החיונית נוסה מסדיר ששהייה תעתיק, כמו גם שיטה לזיהוי סוכן אנטיבקטריאלי מיקוד ייזום שעתוק באמצעות עיכוב של היווצרות holoenzyme RNAP. שיטות אלה יכולים לשמש כפלטפורמה לפיתוח גישות נוספות כדי לחקור את מנגנון הפעולה של גורמי התעתוק אשר עדיין אינו ברור, כמו גם Agen אנטיבקטריאלי חדשts מיקוד שעתוק אשר מהווה יעד תרופה מנוצלים במחקר ופיתוח אנטיביוטי.
Introduction
תמלול הוא התהליך שבו RNA מסונתז מתבנית DNA ספציפית. בתאים איקריוטיים ישנם שלושה RNAPs ברורים: RNAP שאני מעתיק מבשרי rRNA, RNAP השנייה אחראי לסינתזה של mRNA ו RNAs הגרעיני הקטן מסוים, ואת הסינתזה של 5S rRNA ו tRNA מבוצעת על ידי RNAP III. אצל חיידקים, יש רק אחד RNAP אחראי שעתוק של כל סוגי RNA. ישנם שלושה שלבים של שעתוק: ייזום, התארכות והפסקה. תמלול הוא אחד התהליכים המוסדרים הגבוה ביותר בתא. כל שלב במחזור שעתוק מייצג מחסום להסדרת ביטוי גנים 1. לקבלת החניכה, RNAP יש לשייך גורם סיגמא לגבש holoenzyme, אשר נדרש לכוון את האנזים לאתרים ספציפיים בשם היזמים 2 כדי ליצור תסביך האמרגן פתוח. בהמשך לכך, חבילה גדולה של גורמי שעתוק האחראים o תקנהf RNAP פעילויות במהלך שלבי התארכות והפסקה. גורם השכפול נבחן כאן הוא החלבון השמור ביותר וחיוני, נוסה. הוא מעורב בויסות שהשהית שעתוק והפסקה, כמו גם סיום אנטי במהלך סינתזת rRNA 3-5.
במבחנה מבחני שעתוק פותחו כלים רבי עוצמה כדי ללמוד את הצעדים הרגולטוריים מורכבים במהלך שעתוק 6. באופן כללי, שבר ליניארי של DNA כולל אזור האמרגן נדרש כתבנית עבור שעתוק. תבנית ה- DNA בדרך כלל מופק על ידי PCR או על ידי ליניאריזציה פלסמיד. חלבונים NTPs מטוהרים (כולל רדיואקטיבי אחד NTP למטרות זיהוי) מתווספים אז המוצר ניתח בעקבות התקופה הנדרשת של דגירה. שימוש בתבניות מתאימות ותנאי תגובה, בכל שלבי שעתוק נבחנו באמצעות גישה זו אשר אפשרה אפיון מולקולרי מפורט של transcription לעומת מחצית המאה הקודמת 7. בשילוב עם מידע על המבנה 3-הממדי של RNAP זה גם יכל לחקור את המנגנון המולקולרי של עיכוב שעתוק על ידי אנטיביוטיקה מובילה אנטיביוטי, ולהשתמש במידע זה בפיתוח תרופות חדשות, שיפור 8-10.
בעבודה זו אנו מספקים דוגמאות לאופן מבחני שעתוק יכולים לשמש כדי לקבוע את מנגנון הוויסות ידי התארכות שעתוק / גרם סיום נוסה, ואיך את מנגנון הפעולה של עופרת מעכב ייזום שעתוק רומן ניתן לקבוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זהירות: ניסויים כרוכים בשימוש של איזוטופ רדיואקטיבי 32 P ולא עבודה צריכה להתבצע עד שכל תנאי הבטיחות המתאימים מולאו. באופן כללי אנשים נדרשים להשתתף בקורס בטיחות ועוברים בפועל בפיקוח לפני ניסויים באמצעות ריאגנטים רדיואקטיבי. אנא בציוד מגן אישי (מד מינון thermoluminescent, משקפי מגן, כפפות, מעילים במעבדה חדר קרינה, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעליים) בעת ביצוע התגובה.
1. הכנת חומרי Assay
- השג את הנדרש חלבונים עבור assay תמלול.
- לצורך הניסוי המתואר כאן, overproduce ולטהר E. coli RNAP במעבדה כמתואר 11, או להשיג ממקור מסחרי (רשימת חומרים).
הערה: שניהם מספקים תוצאות דומות. שיטות אחרות לטיהור RNAP שכותרתו יליד או זיקה יכולות לשמש גם 12,13. גורמי Sigma / נוסה ניתן להשיג גם דescribed בעבודה קודמת 14,15.
- לצורך הניסוי המתואר כאן, overproduce ולטהר E. coli RNAP במעבדה כמתואר 11, או להשיג ממקור מסחרי (רשימת חומרים).
- הכנת Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים
הערה: לחילופין, RNase ללא מים ניתן להשיג ממקורות מסחריים (רשימת חומרים).- הוסף 1 מ"ל diethyl pyrocarbonate (DEPC) עד 1 ליטר של מים מטוהרים (0.1% v / v) ומערבבים לילה.
- מים וטיפים DEPC החיטוי פעמיים.
- הכנת תבנית ה- DNA
- לטהר פלסמיד pSG1154 16 ו / או pIA226 17 באמצעות ערכת טיהור פלסמיד (רשימת חומרים) על פי הוראות היצרן.
- כדי להגביר את תבנית עבור מבחני שעתוק נגר (שבר 360 נ"ב המקיף באזור P xyl האמרגן), להרכיב תגובת PCR על הקרח כולל 25 μl תערובת 2x PCR (חומרים רשימה), 2 μl כל אחד פריימרים (5 מיקרומטר) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(קדימה) 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (הפוכה), 1 μl pr פלסמיד pSG1154eparation (250 מיקרומטר) ו -20 μl מים מטוהרים).
- או לחלופין, עבור מבחני שעתוק סיבוב בודד, להגביר שבר 447 נ"ב המקיף באזור האמרגן λ P R מ pIA226 17. הגדרת תגובת PCR על הקרח באמצעות 25 μl תערובת 2x PCR, 2 μl כל אחד פריימרים (5 מיקרומטר): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(קדימה) 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (הפוכה), 1 μl pIA226 17 הכנה פלסמיד (250 מיקרומטר) ו -20 μl מים מטוהרים).
הערה: תבנית זו נעדרת ציטוזין עד לתפקיד +26 NT, המהווה את נוקלאוטיד -26 מאתר תחילת שעתוק. לכן, שעתוק באמצעות תבנית זו תאפשר ייזום, אישור אמרגן השתהות בבית +26 NT להקים קומפלקס התארכות שעתוק יציב (EC) כאשר ATP, UTP בלבד GTP נוכחי התגובה.
- או לחלופין, עבור מבחני שעתוק סיבוב בודד, להגביר שבר 447 נ"ב המקיף באזור האמרגן λ P R מ pIA226 17. הגדרת תגובת PCR על הקרח באמצעות 25 μl תערובת 2x PCR, 2 μl כל אחד פריימרים (5 מיקרומטר): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(קדימה) 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (הפוכה), 1 μl pIA226 17 הכנה פלסמיד (250 מיקרומטר) ו -20 μl מים מטוהרים).
- הגדרת תגובת PCR עם התנאים הבאים: 95 °; צלזיוס למשך 30 שניות, 50 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות, חוזרות במשך 30 מחזורים.
- לטהר את המוצר באמצעות ערכת ניקוי PCR (רשימת חומרים) על פי הוראות היצרן ו elute חיץ שעתוק 100 μl עבור assay שעתוק.
- קבע את ריכוז ה- DNA תבנית באמצעות fluorospectrometer (רשימת חומרים).
- הכנת NTP
הערה: NTPs ניתן להשיג ממקורות מסחריים שונים (רשימת חומרים).- ממיסים NTPs (≥99% טהור) במים DEPC שטופלו לעשות 1 M מלאי, aliquot 1 מ"ל של התמיסה לתוך צינורות 1.5 מ"ל (50 μl בצינור אחד) ולאחסן ב -20 ° C.
- להזמין α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol) לפני הניסוי. 32 P יש זמן מחצית חיים קצר של 14.29 ימים.
הערה: UTP שימוש שכותרתו אלפא ימנע השוואת עוצמת להקות עם אורך שונה.
- הכין סולם RNA
- הרכב את המעקבing התגובה בטמפרטורת החדר: 0.5 מיקרוגרם Mix תבנית רנ"א (רשימת חומרים), 80 pH7.5 חיץ HEPES מ"מ, 12 מ"מ MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 מ"מ DTT, 2 מ"מ ATP / CTP / GTP, 0.5 מ"מ UTP, 2 μl α- 32 P UTP, 0.5 μl RNAP T7 (רשימת חומרים), DEPC שטופלו מים עד 20 μl.
- אפשר תגובה להמשיך ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. להשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C.
2. הכנת RNA רצף ג'ל
- הכנת ג'ל
- נקה את הצלחות מן מנגנון ג'ל רצף (רשימת חומרים) פעמים עם אתנול 70% ומים מטוהרים, ולהרכיב את התא עם מסרק ושני מפרידים.
הערה: צלחת אחת יכולה להיות מצופים מגיב siliconizing (רשימת חומרים) כדי להקל על הסרת ג'ל שלב 4.2. - ממיסים אוריאה 33.6 גרם ב -22 מ"ל מים 16.4 מ"ל של 5x טריס / Borate / EDTA חיץ (TBE) (54 גרם טריס (hydroxymethyl) aminomethane; 27.5 גרם חומצת בור; 10 מ"ל של 1 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), pH 7.4 ב 1 מי L) באמצעות בוחש מגנטי.
- להוסיף 16 מ"ל של 40% Acrylamide / bis-acrylamide פתרון (19: 1) לפתרון אוריאה ולסנן דרך פילטר 0.45 מיקרומטר.
- להוסיף 514 μl 10% (w / v) persulfate אמוניום מוכן טרי במים ואחריו 51.4 μl N, N, N ', N' -Tetramethylethylenediamine (TEMED) לפתרון מסוננים.
- בעדינות להפוך את הפתרון ג'ל כדי למנוע אוורור יתר ולהזריק מייד בצורה חלקה לתוך התא רצף מראש ארז הממוקם אופקי מחור ההזרקה התחתון. תשמור על עצמך כדי להימנע בועות במהלך הזרקה.
- אפשר 1-1.5 שעות עד הג'ל מוגדר לחלוטין לפני השימוש ב assay שעתוק. הג'ל ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר למשך יומיים או שלושה, כאשר עטוף רקמה מים רטוב על החלק העליון של התא רצף.
- נקה את הצלחות מן מנגנון ג'ל רצף (רשימת חומרים) פעמים עם אתנול 70% ומים מטוהרים, ולהרכיב את התא עם מסרק ושני מפרידים.
בתגובה שעתוק 3.
- Assay השהיית תמלול התארכות
- כינונה של קומפלקס התארכות שעתוק
- הוסף 1 μl של אנזים הליבה rnab (1 מיקרומטר המניות חיץ שעתוק) לצינור 1.5 מ"ל.
- הוסף 1 μl של גורם סיגמא-70 מטוהרים (σ 70; 3 מיקרומטר המניות חיץ שעתוק) אל RNAP דגירה על קרח למשך 10 דקות כדי ליצור RNAP holoenzyme.
- הוסף 3 תבנית ה- DNA מטוהרים μl 500 ננומטר (האמרגן R P λ מהמוצר pIA226 PCR) במאגר שעתוק אל holoenzyme RNAP לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי ליצור המתחם פתוח.
- הכינו תערובת של מרכיבי התגובה אחרת צינור 1.5 מ"ל באמצעות 5 μl של חיץ שעתוק 10x (רשימת חומרים: 400 מ"מ טריס- HCl, 1.6 KCl M, 100 מ"מ MgCl 2, 10 mM DTT, 50% גליצרול, pH 7.9 ב DEPC שטופלו מים), 2 μl של 250 מיקרומטר אחד GTP ו UTP, 1 μl של 1 מ"מ ATP, ו 1 μl של α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol). מוסיפים מים מטופלים DEPC ל -41 μl.
לאטה: מעכב RNase (רשימת חומרים) שניתן להשתמש בהם כדי למזער את זיהום RNase. - מעביר את פתרון תערובת הצינור המכיל המתחם הפתוח לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי ליצור את מורכבות התארכות שעתוק עצר +26 NT.
- להעביר את התגובה לטמפרטורת החדר (~ 21 ° C) ולהוסיף 1 μl של 2.5 מ"ג / מ"ל ריפמפיצין לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
- הוסף 1 μl של 0.1 מ"מ מטוהרים נוסה לתערובת התגובה דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 2 μl של 250 מיקרומטר CTP לתוך התערובת לתגובה ליצור נפח סופי של 50 μl ולמדוד את זמן התגובה באמצעות טיימר.
- העברת 5 μl של פתרון התגובה לתוך 2 μl של חיץ טעינת ג'ל RNA (לפוראמיד 95%, 0.05% bromophenol כחול cyanol קסילן 0.05%) ב 30, 60, 120, 240, 480, ו -1,200 שניות כדי להרוות את התגובה.
- השלך 32 P UTP טיפים וצינורות בתוך המשך פסולת רדיואקטיביתainer.
- כינונה של קומפלקס התארכות שעתוק
- תמלול ייזום Assay
- כינונה של הקומפלקס להרחיב
- לדלל מטוהרים σ 70 כדי 0.5 מיקרומטר.
- חזור על שלבים 3.1.1.1 כדי 3.1.1.3 באמצעות 0.5 מיקרומטר (במקום 3 מיקרומטר) מטוהרים σ 70, ואת תבנית ה- DNA (באזור האמרגן P xyl ממוצר pSG1154 PCR).
- עיכוב של assay ייזום שעתוק
- מוסיפים את מעכבי שנועדו למנוע היווצרות RNAP holoenzyme כדי אנזים הליבה RNAP לפני תוספת של σ 70 (אחרי 3.1.1.1 שלב), ואחריו צעדים 3.1.1.2 ו 3.1.1.3 לבחון האם מעכב הוא מסוגל לשבש holoenzyme היווצרות.
- לחלופין, לאחר שלב 3.1.1.2, להוסיף מעכב לבחון האם הוא מסוגל לעכב תחרותי σ 70 קשירה RNAP.
- משתמש באותה הכמות של DMSO, הממס של המעכב, במקום מעכב היםטוק בתגובות שליטה.
- השלמת התגובה
- ממיסים הפרין במים לריכוז מלאי של 1 מ"ג / מ"ל ו המניה ב -20 ° C.
הערה: הפרין הוא מתחרה של ה- DNA שיכול לעקל RNAP שלא יצר מורכבות פתוחות. לאחר במתחם הפתוח נוצר, הפרין לא יכול להיכנס לאתר DNA המחייב של RNAP ומעכב שעתוק מתסביך פתוח מראש יצר. לכן, הפרין נדרש רק עבור מבחני יחיד עגול; זה אינו נחוץ עבור מבחנים רבים-עגולים. - מכינים את תערובת התגובה באמצעות 5 μl של 10x חיץ שעתוק (רשימת חומרים), 1 μl של 1 מ"ג / פתרון הפרין מ"ל, 1 μl של 10 מ"מ כל ATP, GTP, ו CTP, 2.5 מ"מ UTP, ו 1 μl של α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol). מוסיפים מים מטופלים DEPC 45 μl.
- מערבב את תערובת התגובה עם מורכבות שעתוק פתוחות, הספין הדופק לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- העבר 10 μl של תגובה כהlution לתוך 5 μl של חיץ טעינת ג'ל RNA (לפוראמיד 95%, 0.05% bromophenol כחול cyanol קסילן 0.05%) כדי להרוות את התגובה.
- ממיסים הפרין במים לריכוז מלאי של 1 מ"ג / מ"ל ו המניה ב -20 ° C.
- כינונה של הקומפלקס להרחיב
ריצה ופיתוח 4. RNA ג'ל
- הרצת ג'ל denaturing polyacrylamide
- הפעל את הג'ל על 50 מעלות צלזיוס ו -50 W במאגר 1x TBE כ 1.5 שעות עד לטמפרטורה של ג'ל למאגר יציב ב -50 ºC.
- מחמם דגימות ב 90 ºC למשך 30 שניות ולהעביר אותם על טעינה לפני קרח על הג'ל.
- דגימות טען לתוך הבורות העליון של ג'ל לצד נתיב אחד המכיל 2 סולם RNA μl (1: 100 דילול).
- הפעל את הג'ל על 50 וואט ו -50 ºC במאגר 1x TBE עד לצבוע בכחול bromophenol מגיע ~ 2/3 למטה הג'ל.
- הג'ל הטיפולי
- להרחיב לאט ובזהירות להפריד את הצלחת העליונה מתא הרצף. להקדיש תשומת לב רבה כדי למנוע את שבירת ג'ל.
- Cut chromatograpHY נייר (רשימת חומרים) כדי להתאים את גודל ג'ל מלמעלה צבע כחול bromophenol. השתמש מונה גייגר כדי לאשר את המיקום המשוער של תעתיקי רנ"א שכותרתו רדיואקטיבית.
- בזהירות לכסות את הג'ל עם נייר הסינון, ולחץ בחוזקה עד הג'ל שומר על נייר הסינון. חותכים וזורקים את החלק התחתון של הג'ל פסולת רדיואקטיבית כמו NTPs מאוגדים עד לבסיסו של ג'ל, אשר יכול להיות חם מאוד.
- מניח פיסה בגודל דומה של נייר סינון על מיטת הייבוש של מכונת ואקום ייבוש, ובזהירות להניח את הנייר מצופה-ג'ל על זה עם הצד ג'ל.
- מכסים את ג'ל עם בניילון יבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
- עוטפים את הצד השני של נייר הסינון מצופה ג'ל בניילון נצמד, ומניחים על צלחת זרחן photostimulable במקרה הדמיה, עם זמן חשיפה מתאימה, אשר יכול לנוע בין 1 hr לילה תלוי יעילות התגובה.
- תמונת צלחת זרחן באמצעותסורק תרמי על פי הוראות היצרן. לקבוע את עוצמת הלהקה יחסית באמצעות תוכנת ImageJ פי הוראות התוכנה.
- השתמש מונה גייגר לבדוק את זיהום רדיואקטיבי באזור העבודה, לנגב את הפריטים החשודים ואזור עם רקמות חומר ניקוי ולהיפטר הרקמה בתוך המיכל לרשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יעילות השעתוק יכול להיקבע על ידי מדידת רמת הקרינה הלהקות בנקודות זמן שונות. את assay השהיה כדי לבדוק את הפונקציה של גורם נוסה לאפשר הדמיה של הפסקה, פיטורין, לבין נגר מוצרים (איור 1 א). בנוכחות של תחום N-terminal של נוסה (נוסה NTD; שאריות חומצת אמינו 1-137), חזות של מוצרי RNA התעכבה באופן משמעותי לעומת ניסוי השליטה החסר נוסה. מחיקת שאריות חומצת אמינו 104-137 (Helix 3) של שהבר נוסה, או יישונה אלאנין של סדרה של חומצות אמינו (שאריות K36, K37, R104, Q108, K111, Q112, Q116, ו R119) הביאו מלא אובדן פעילות הפסקה נוסה. Helix 3 שאריות R104 ו- K111 הוצגו להיות חיוני לפעילות הפסקה נוסה NTD ועם R104A ובונה K111A נותן ערכים מחצית החיים הפסקה דומה בשלט שבו נוסה NTD נעדר (איור 1B). זה זהhould לציין כי מחיקה של Helix 3 או שינוי של שני אלה שאריות חומצת אמינו אין כל השפעה על נוסה מחייב RNAP 15. התוצאה הציעה R104 ו- K111 היו חומצות אמינו המפתח דרוש הסדרת פעילות הפסקה נוסה.
באופן דומה, כפי שמוצג באיור 2 א, עקום מנת התגובה הפגין העיכוב של שעתוק במבחנה (סיבוב רב) באמצעות ריכוזים שונים של מעכב שעתוק בקטריאלי חדש מזוהה C5 14. C5 זוהה בעקבות במסך סיליקון מפרויקט למקד את האינטראקציה של σ 70 רציונלים עם אתר הקישור העיקרי שלה על RNAP נקרא אזור קלאמפ-Helix 18. עם תוספת של C5 לתוך התגובה שעתוק, המתחם הזה יכול להתחרות נגד σ 70 עבור מחייב RNAP, ובכך שעתוק עכבות. באופן מכני, תוספת של C5 כדי RNAP ואחריו σ <sup> 70 גורם לתערובת התגובה היתה משמעותית יותר יעיל עיכוב שעתוק מאשר הניסוי באמצעות C5 אחרי היווצרות של holoenzyme rnab (איור 2 ב). תוצאות אלו הראו כי σ 70 לא יכלו לעקור C5 כבול RNAP, או כי C5 לא יכלו לעקור σ 70 כבול ביעילות RNAP ב assay יחיד עגול.
איור 1:. אפקטים של Mutant נוסה NTD בתעתיק (א) מבחני הפסקה תמלול ללא נוסה, באמצעות נוסה NTD (+ נוסה), נוסה NTD עם סליל 3 נמחק (Δ Helix), ו נוסה NTD עם החלפות אלאנין על שאריות K36, K37 , R104, Q108, K111, Q112, Q116, ו R119 (כל עלא). P, אתר הפסקה; T, אתר סיום; RO, נגר. טריזים מעל ג'ל להדגים את נקודות הזמן שנדגמו (0.5, 1, 1.5, 2, 5 ו -10 דקות) 15; (ב) פעילות הפסקה של זמן מחצית חיים של היחסים נוסו NTD מוטציה לחלבון wild-type. ממוצע של 3 ניסויים עם SD. נתון זה יש הבדל בין מיל חומצות גרעין. 43 (5), 2829-2840 (2015). לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. עיכוב תמלול ידי תרכובת C5 (א) עקום עיכוב של E. coli RNAP שעתוק על ידי תרכובת C5 ב assay רב-עגול 14. עיכוב של שעתוק אחוז נקבע על ידי יחסי מוצר RNA על פקד (ללא נוכחות C5) נגד הריכוז של C5 בשימוש התגובה. (B) אחוז פעילות המעכבת של C5 המתחם tr יחיד עגולמבחני anscription עם תוספת של C5 לפני (מורכבים + σ 70; אפור) ואחרי (holoenzyme + C5; שחור) holoenzyme היווצרות. נתון זה יש הבדל בין להדביק ACS. דיס. 2, 39-46 (2016). לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכל היצורים, שעתוק הוא תהליך מוסדר בחוזקה. מבחני שעתוק במבחנה פותחו כדי לספק פלטפורמה לבדיקת ההשפעות של גורמי שעתוק, מולקולות קטנות ומעכבי שעתוק. במאמר בשיטה זו, assay שעתוק חיידקים כללי תוארה. מבחני תמלול בשילוב עם ג'ל אלקטרופורזה רצף של תמלילים חשובים מאוד עבור מחקרים מכניסטית, מאחר שהם מאפשרים הדמיה של כל מוצרי השעתוק לאורך ציר זמן. כתוצאה מכך, בשיטה זו היא מסוגלת לזהות את ההשפעה של שינויים קלים בתנאי תגובה ומגלה מנגנון מתקבל על דעת של פעולה. יתר על כן, הוא הופך להיות ריאלי לתכנן מבחני שעתוק ספציפיים בדבר הפונקציה של גורמי שעתוק עם מנגנונים לא ידועים של פעולה.
במאמר זה אנו גם תארנו את השיטה כדי לאשר את מנגנון הפעולה של מעכבים של RNAP holoenהיווצרות תֶסֶס. השיטה המתוארת כאן יכול להציג את השינוי אצל כל תעתיקי הרנ"א עם הזמן, ועם שינוי המתאים יכול לאפשר בדיקה של סוכני אנטיבקטריאלי נגד כל צעד של שעתוק על פי הצורך. את assay רב העגול יכול לשמש כשיטה הקרנה יחסית פשוטה לזהות מעכבי מיקוד שעתוק חדשים, בעוד assay הסיבוב הבודד יכול לשמש כדי לחקור את המנגנון של מעכבים, כגון תכונות תחרותיות / לא תחרותיות. שים לב צבירה מולקולרית קטנה יכולה לגרום להיטים חיוביים כוזבים כמעכבים הלא תחרותיים בתהליך גילוי סמי המחקר מכניסטית הסיבוב הבודד עשויים לספק גישה מקיפה להערכת להיט-to-Lead. כתוצאה מכך, תהליך השעתוק נשלט זה מסוגל לחשוף בדיוק איך מעכב משפיע שעתוק, אשר יכול לעזור עם רציונליזציה דה תכנון תרופות נובו. יחד עם מידע ברזולוציה גבוהה באתרים מעכבים מחייבים ידי סטיו crystallographic רנטגןמת, עיצוב רציונאלי של תרופות מבוססות מבנה יהיה נוח מאוד עבור יישום בתעתיק מיקוד גילוי תרופות.
למרות תוצאות תפוקה גבוהה לא ניתן להשיג עם מבחני שעתוק במבחנה, הם שימושיים מאוד לשלוף את המנגנון המדויק קשורים המלא של שעתוק. הרכיבים ותנאי assay יכול להיות שונה בקלות עבור הצרכים האישיים. גורמים שונים (למשל, נוסה) 4, 15, מולקולות קטנות (למשל, ppGpp) 19 ו / או שעתוק מעכבים (למשל, ריפמפיצין) 20 של עניין ניתן להוסיף לבדוק תפקידיהם בתקנה שעתוק. תבנית ה- DNA צריך להיות מתוכננת באופן אינדיבידואלי, עם בחירה זהירה של יזמים חזקים, רצף הפסקת terminators. על מנת להשיג שחזור גבוה של assay, חלבונים חייבים להיטהר מאוד וחופשיים מפעילת RNase שיורית, ואת חיץ שעתוק, תבנית ה- DNA, ופתרון מניות של מצעי NTP חייבת להתבצע DEPC מי מטופלים. שימוש NTPs רדיואקטיבי תואר במאמר זה, אולם נוקלאוטידים ניאון גם יכולים להיות מועסק 21. איכות של תבנית ה- DNA הוא קריטי להצלחת assay שעתוק. ריווח מספיק בין האמרגן / Pause / Terminator חייב להיכלל, מה שמאפשר את מוצרי השעתוק השונים כדי להפריד כראוי ובחן. הג'ל הרצף חייב להיות שפך כראוי חיץ TBE טרי יחסית חייב לשמש אלקטרופורזה כדי להשיג רזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית של תעתיקי רנ"א. אם השפלה של מוצר שעתוק הוא הבחין, מעכב RNase באיכות גבוהה חייב להיות משולב בתערובת התגובה שעתוק. צינורות טיפים פיפטה חייבים להיות autoclaved כפול וכפפות חייבות להיות משוחקות בכל העת כאשר ביצוע assay, על מנת למזער כניסתה של RNase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
