Abstract
В пробирке транскрипции анализы были разработаны и широко использовались в течение многих лет , чтобы изучить молекулярные механизмы , участвующие в транскрипции. Этот процесс требует множества субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы (РНКП) и ряд факторов транскрипции, которые действуют, чтобы модулировать активность РНКП во время экспрессии генов. Секвенирование гель-электрофорез радиоактивно меченных транскриптов используется, чтобы обеспечить подробную механистическую информацию о том, как Транскрипция происходит, и какие параметры могут повлиять на нее. В этой статье мы опишем протокол для изучения того, как существенный фактор элонгации Нуса регулирует транскрипционный приостановку, а также способ идентификации антибактериальный агент таргетирования инициации транскрипции путем ингибирования холофермента формирования РНКП. Эти методы могут быть использован в качестве платформы для разработки дополнительных подходов для изучения механизма действия факторов транскрипции, которые до сих пор остаются неясными, а также новые антибактериальные AgenТ.С. ориентации транскрипции, которая является объектом недоиспользованными наркотиков в исследования и разработки антибиотиков.
Introduction
Транскрипция является процессом, в котором РНК синтезируется из определенной ДНК-матрицы. В эукариотических клетках имеются три различных РНКП: РНК-полимераза I расшифровывает предшественников рРНК, РНК-полимераза II отвечает за синтез мРНК и определенных малых ядерных РНК, и синтез 5S рРНК и тРНК осуществляется РНКП III. У бактерий существует только одна РНК-полимераза отвечает за транскрипцию всех классов РНК. Есть три стадии транскрипции: инициация, удлинение и прекращение. Транскрипция является одним из наиболее регулируемых процессов в клетке. Каждая стадия в цикле транскрипции представляет собой контрольную точку для регуляции экспрессии генов 1. Для инициирования, РНК - полимераза должен ассоциировать с коэффициентом сигмы с образованием Голоэнзим, которое требуется , чтобы направить фермента к определенным узлам , называемые промоторами 2 с образованием открытого промотора комплекса. Впоследствии, большой набор факторов транскрипции отвечают за регулирование Oдеятельность F РНКП во время удлинения и терминации фаз. Фактор транскрипции рассматриваемых здесь является высоко консервативным и существенным содержанием белка, Нуса. Он участвует в регуляции транскрипции Приостановка и прекращение, а также анти-терминацию в процессе синтеза рРНК 3-5.
В пробирке транскрипции анализы были разработаны в качестве мощных инструментов для изучения сложных регуляторных мер во время транскрипции 6. В общем случае, линейный фрагмент ДНК, в том числе области промотора необходим в качестве матрицы для транскрипции. ДНК-матрицы, как правило, генерируются с помощью ПЦР или путем линеаризации плазмиды. Затем добавляют Очищенные белки и НТП (в том числе один меченый NTP для обнаружения целей) и продукт анализировали после необходимого периода инкубации. С использованием соответствующих шаблонов и условий реакции, все этапы транскрипции были исследованы с помощью этого подхода, который позволил подробную молекулярную характеристику Transcription за последние полвека 7. В сочетании с информацией о 3-мерной структуре РНКП это также оказалось возможным исследовать молекулярный механизм ингибирования транскрипции антибиотиков и антибиотиков приводит, и использовать эту информацию при разработке новых, усовершенствованных лекарств 8-10.
В данной работе мы приводим примеры того, как транскрипционные анализы могут быть использованы для определения механизма регуляции транскрипции путем удлинения / фактора прекращения Нуса, а также как механизм действия нового ингибитора инициации транскрипции свинца может быть определена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Внимание: Эксперименты предполагают использование радиоактивного изотопа 32 P и никакой работы не следует проводить до тех пор , все надлежащие условия безопасности не были соблюдены. Как правило, персонал обязаны посещать курс по технике безопасности и пройти практику под наблюдением перед экспериментами с использованием радиоактивных реагентов. Пожалуйста, носите средства индивидуальной защиты (термолюминесцентный дозиметр, защитные очки, перчатки, радиационная номер халатах, полные штаны длины, закрытые носок обуви) при проведении реакции.
1. Получение пробирного материалов
- Получение требуемой Белки Транскрипция для анализа.
- Для эксперимента , описанного здесь, избыточно и очищают E. палочка РНК - полимераза в лаборатории , как описано 11, или получить из коммерческих источников (список материалов).
Примечание: Оба обеспечивают аналогичные результаты. Другие способы очистки нативного или аффинная меченый РНКП также может быть использован 12,13. Sigma / Нуса факторы могут быть получены в виде dвневписанной в предыдущей работе 14,15.
- Для эксперимента , описанного здесь, избыточно и очищают E. палочка РНК - полимераза в лаборатории , как описано 11, или получить из коммерческих источников (список материалов).
- Получение диэтилпирокарбонат (DEPC) Очищенная вода
Примечание: В качестве альтернативы, РНКазы вода может быть получена из коммерческих источников (список материалов).- Добавляют 1 мл диэтилпирокарбонат (DEPC) до 1 л очищенной воды (0,1% об / об) и перемешивают в течение ночи.
- Автоклавы DEPC воды и советы дважды.
- ДНК шаблона Подготовка
- Очищают плазмиду pSG1154 16 и / или pIA226 17 с использованием набора для очистки плазмида (Материалы List) в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Чтобы усилить шаблон для вымывания транскрипции анализов (фрагмент 360 п.н. , охватывающий XYL участок промотора P), собрать реакцию ПЦР на льду в том числе 25 мкл 2x ПЦР смеси (Материалы List), 2 мкл каждого из праймеров (5 мкМ) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(вперед) и 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (обратный), 1 мкл pSG1154 плазмида прeparation (250 мкМ) и 20 мкл очищенной водой).
- Или в качестве альтернативы, для одного раунда анализов транскрипции, амплификации фрагмента 447 н.п. , охватывающую на λ P R промотор из pIA226 17. Настройка реакции ПЦР на льду с использованием 25 мкл ПЦР-смеси 2x, 2 мкл каждого из праймеров (5 мкМ): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(вперед) и 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (обратный), 1 мкл pIA226 17 плазмида препарат (250 мкМ) и 20 мкл очищенной водой).
Примечание: Этот шаблон не хватает цитозин до позиции +26 нт, который является 26 - й нуклеотид от сайта инициации транскрипции. Таким образом, транскрипция с помощью этого шаблона позволит инициацию, зазор промотор и сваливания на + 26 нт с образованием комплекса элонгации стабильной транскрипции (EC), когда только АТФ, УТФ и ГТФ присутствуют в реакции.
- Или в качестве альтернативы, для одного раунда анализов транскрипции, амплификации фрагмента 447 н.п. , охватывающую на λ P R промотор из pIA226 17. Настройка реакции ПЦР на льду с использованием 25 мкл ПЦР-смеси 2x, 2 мкл каждого из праймеров (5 мкМ): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(вперед) и 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (обратный), 1 мкл pIA226 17 плазмида препарат (250 мкМ) и 20 мкл очищенной водой).
- Настройка реакции ПЦР со следующими условиями: 95 °С в течение 30 сек, 50 ° C в течение 30 сек, 72 ° C в течение 30 сек, повторяющейся в течение 30 циклов.
- Очищают продукт, используя очистке набора ПЦР (список материалов) в соответствии с инструкциями изготовителя и элюции в 100 мкл буфера транскрипции для анализа транскрипции.
- Определить концентрацию ДНК-матрицы с использованием fluorospectrometer (список материалов).
- NTP Подготовка
Примечание: НПТ могут быть получены из различных коммерческих источников (список материалов).- Растворите НПТ (≥99% чистоты) в DEPC-обработанной воды, чтобы сделать 1 М запас, аликвоты 1 мл раствора в 1,5 мл пробирки (50 мкл в каждую пробирку) и хранят при -20 ° C.
- Порядок α- 32 Р UTP (3000 Ки / ммоль) до эксперимента. 32 Р имеет короткий период полураспада 14.29 дней.
Примечание: С помощью альфа-меченого UTP избегает сравнения интенсивности полос с различной длиной.
- РНК Ladder Подготовка
- Собрать последующиеИНГ реакции при комнатной температуре: 0,5 мкг РНК шаблон Mix (Список материалов), 80 мМ HEPES буфера рН 7,5, 12 мМ MgCl 2, 10 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 2 мМ АТФ / CTP / GTP, 0,5 мМ UTP, 2 мкл альфа- 32 P UTP, 0,5 мкл Т7 РНКП (материалы List), DEPC обработанной воды до 20 мкл.
- Разрешить реакции протекать при температуре 37 ° С в течение 1 часа. Используйте сразу или хранить при -80 ° С.
2. Получение РНК Секвенирование Gel
- Гель Приготовление
- Очистите пластины от устройства секвенирования гель (список материалов) в два раза с 70% этанола и очищенной воды, и собирают клетки с гребнем и двумя прокладками.
Примечание: Одна пластина может быть покрыта силицирования реагентом (список материалов) для облегчения удаления геля на шаге 4.2. - Растворить 33,6 г мочевины в 22 мл воды и 16,4 мл 5х Трис / борат / ЭДТА (КЭ) буфер (54 г трис (гидроксиметил); 27,5 г борной кислоты, 10 мл 1 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 7,4 в 1 л воды) с использованием магнитной мешалки.
- Добавить 16 мл 40% акриламида / бис-акриламида раствора (19: 1) с раствором мочевины и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
- Добавить 514 мкл 10% (вес / объем) Свежеприготовленный персульфата аммония в воде с последующим 51,4 мкл N, N, N ', N' тетраметилэтилендиамина (TEMED) для отфильтрованного раствора.
- Аккуратно инвертировать раствора геля, чтобы избежать чрезмерного аэрации и ввести немедленно и плавно переходит в горизонтально расположенной расфасована секвенирования ячейки от нижнего отверстия впрыска. Будьте осторожны, чтобы избежать пузырей во время инъекции.
- Разрешить 1-1.5 ч до тех пор, пока гель не полностью установлен перед использованием в анализе транскрипции. Гель можно хранить при комнатной температуре в течение двух или трех дней, когда обматывают смоченного водой ткани на верхней части секвенирования клетки.
- Очистите пластины от устройства секвенирования гель (список материалов) в два раза с 70% этанола и очищенной воды, и собирают клетки с гребнем и двумя прокладками.
3. Транскрипция реакции
- Транскрипция Удлинение Приостановка Анализ
- Формирование элонгации транскрипции комплекса
- Добавить 1 мкл основного фермента РНКП (1 мкМ складе в транскрипции буфере) в 1,5 мл трубки.
- Добавить 1 мкл очищенного сигма-70 фактора (a 70, 3 мкМ запас в транскрипции буфере) к РНК - полимеразы и инкубировать на льду в течение 10 мин , с образованием РНК - полимераза холофермента.
- Добавить 3 мкл 500 нМ очищено матрицы ДНК (А , P R промотор из продукта pIA226 ПЦР) в транскрипции буфере с РНКП голоэнзима и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин , чтобы сформировать открытый комплекс.
- Приготовить смесь из компонентов реакции в другую 1,5 мл пробирку с использованием 5 мкл 10х транскрипции буфера (Материалы Список: 400 мМ Трис-HCl, 1,6 М KCl, 100 мМ MgCl 2, 10 мМ ДТТ, 50% глицерин, рН 7,9 в DEPC обработанной воды), 2 мкл 250 мкМ каждого GTP и UTP, 1 мкл 1 мМ АТФ и 1 мкл альфа- 32 Р UTP (3000 Ки / ммоль). Добавить DEPC очищенную воду до 41 мкл.
НетТЕ: ингибитор РНКазы (Список материалы) могут быть использованы для минимизации загрязнения РНКазы. - Переносят раствор смеси в пробирку, содержащую комплекс с открытым и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин, чтобы сформировать транскрипция удлинение комплекс остановлен при + 26 нт.
- Перемещение реакционную смесь до комнатной температуры (~ 21 ° C) и добавить 1 мкл 2,5 мг / мл рифампицина до конечной концентрации 50 мкг / мл.
- Добавляют 1 мкл 0,1 мМ очищенного Nusa к реакционной смеси и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавляют 2 мкл 250 мкМ CTP в реакционную смесь, чтобы сделать окончательный объем 50 мкл и измеряют время реакции с помощью таймера.
- Передача 5 мкл реакционного раствора в 2 мкл РНК гель загрузочного буфера (95% формамида, 0,05% бромфенол синий и 0,05% cyanol ксилола) в 30, 60, 120, 240, 480 и 1200 сек, чтобы погасить реакцию.
- Утилизировать советы 32 P UTP и трубы в продолжение радиоактивных отходовainer.
- Формирование элонгации транскрипции комплекса
- Анализ инициации транскрипции
- Формирование открытого комплекса
- Развести очищенную σ 70 до 0,5 мкм.
- Повторите шаги 3.1.1.1 к 3.1.1.3 , используя 0,5 мкм (вместо 3 мкМ) очищенное σ 70 и ДНК - матрицы (Р XYL промоторную область от продукта pSG1154 ПЦР).
- Ингибирование инициации транскрипции анализа
- Добавьте ингибитор , предназначенный для предотвращения образования РНКП Голоэнзим к основным ферментом РНКП перед добавлением сг 70 (после стадии 3.1.1.1), а затем шаги 3.1.1.2 и 3.1.1.3 изучить , способен ли нарушить Голоэнзим образование ингибитора.
- В качестве альтернативы, после этапа 3.1.1.2, добавьте ингибитор рассмотреть , является ли он в состоянии конкурентно ингибируют σ 70 связывания РНК - полимеразы.
- Используйте такое же количество ДМСО, растворитель ингибитора, вместо ингибитора STock в контрольных реакций.
- По завершении реакции
- Растворите гепарин в воде до концентрации акций 1 мг / мл и при наличии -20 ° C.
Примечание: Гепарин является конкурентом ДНК, которая может изолируют РНКП, который не образуется открытый комплекс. После того, как открыт комплекс образуется, гепарин не может войти на сайт связывания ДНК РНК-полимеразы и ингибируют транскрипцию из предварительно сформированного открытого комплекса. Поэтому, гепарин требуется только для однообходных анализов; это не требуется для нескольких круглых анализов. - Готовят реакционную смесь , используя 5 мкл 10х буфера транскрипции (материалы список), 1 мкл 1 мг / мл гепарина раствор, 1 мкл 10 мМ каждого АТФ, ГТФ, и CTP, 2,5 мМ UTP, и 1 мкл 32 альфа- Р УТФ (3000 Ки / ммоль). Добавить DEPC очищенную воду до 45 мкл.
- Смешайте реакционную смесь с транскрипцией открытой сложной, импульсная спина и инкубировать при 37 ° С в течение 20 мин.
- Перенесите 10 мкл реакционной смеси, таклюция в 5 мкл РНК гель загрузочного буфера (95% формамида, 0,05% бромфенол синий и 0,05% cyanol ксилол) для гашения реакции.
- Растворите гепарин в воде до концентрации акций 1 мг / мл и при наличии -20 ° C.
- Формирование открытого комплекса
4. РНК гель Запуск и развитие
- Запуск денатурирующих полиакриламидном геле
- Прогоните гель при 50 ° С и 50 Вт в буфере 1x КЭ в течение примерно 1,5 ч, пока температура геля и буфер стабилен при 50 ° С.
- Образцы тепла при 90 ° С в течение 30 сек и перемещать их на льду до загрузки на гель.
- Загружают образцы в лунки на верхней части геля вместе с одной полосой, содержащей 2 мкл РНК лестницу (разведение 1: 100).
- Выполнить гель при 50 Вт и 50 ° С в буфере 1x КЭ до бромфенол синий краситель не достигнет ~ 2/3 вниз геля.
- Гель Лечение
- Открыть медленно и осторожно отделить верхнюю пластину из секвенирования клетки. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать нарушения геля.
- Вырезать chromatograpгип бумага (Список материалов), чтобы соответствовать размеру геля от верхней части к бромофенолового синего красителя. Используйте счетчик Гейгера, чтобы подтвердить примерное положение радиоактивно меченых РНК-транскриптов.
- Осторожно закрывают гель с фильтровальной бумагой, и нажмите твердо, пока гель прилипает к фильтровальной бумаге. Отрезанные и отбрасывать дна геля для радиоактивных отходов в качестве неинкорпорированного НПТБ работать в нижней части геля, который может быть очень жарко.
- Поместите одинакового размера кусок фильтровальной бумаги на сушильном слое с вакуумной сушильной машины, и аккуратно закладывают бумагу гель покрытием на нее с гелевой стороной вверх.
- Накройте гель с полиэтиленовой пленкой и высушивают при 60 ° С в течение 1,5 ч.
- Оберните другую сторону геля покрытием фильтровальной бумаги с полиэтиленовой пленкой и поместите на photostimulable люминофора пластины в случае формирования изображения, с соответствующим временем экспозиции, которая может варьироваться от 1 часа до ночи в зависимости от эффективности реакции.
- Изображение люминофор пластины с помощьюсканер Imager в соответствии с инструкциями изготовителя. Определить относительную интенсивность полосы с использованием программного обеспечения ImageJ в соответствии с инструкцией программного обеспечения.
- Используйте счетчик Гейгера, чтобы проверить радиоактивного загрязнения в рабочей зоне, протереть подозрительные предметы и область с тканью и чистящим средством и утилизировать ткани в контейнер для утилизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
эффективность транскрипции может быть определено путем измерения уровня излучения в полосах в различные моменты времени. Паузу для анализа , чтобы проверить функцию Нуса фактора позволило визуализировать паузы, прекращения и стекания продуктов (Рис . 1А) В присутствии N-концевого домена Нуса (Нуса НТД; аминокислотные остатки 1-137), появление РНК продуктов значительно задерживается по сравнению с контрольным экспериментом не хватает Нуса. Удаление аминокислотных остатков 104-137 (Helix 3) фрагмента Нуса или изменения к аланин ряда аминокислот (остатки K36, K37, R104, Q108, K111, Q112, Q116 и R119) привело к полной потеря активности паузы Нуса. Helix 3 остатков R104 и K111 было показано, что необходимо для приостановки деятельности Нуса НТД и с R104A и K111A конструкций , дающих подобное пауза полураспада значения контроля , где Нуса НТД отсутствовал (рис 1В). Этоhould отметить , что удаление Helix 3 или изменение этих двух аминокислотных остатков , не оказывает никакого влияния на Нуса связывание с РНКП 15. Результат позволяет предположить, что R104 и K111 были ключевые аминокислоты, необходимые для регуляции активности паузы Нуса.
Точно так же, как показано на рисунке 2А, кривая доза-реакция показала ингибирование в пробирке транскрипции (многораундовый) , используя различные концентрации недавно идентифицированный ингибитора бактериальной транскрипции C5 14. C5 был идентифицирован после проведения в силикомарганца экрана от проекта рационально предназначаться взаимодействие сг 70 с его основным местом связывания на РНКП называется хомута Helix области 18. С добавлением С5 в реакции транскрипции, это соединение может конкурировать с сг 70 для связывания с РНК - полимеразы, и , таким образом , ингибирует транскрипцию. Механически, добавление C5 к РНКП с последующим σ <SUP> 70 Коэффициент к реакционной смеси был значительно более эффективен для транскрипции ингибирования , чем эксперимент с использованием С5 после образования РНКП голоэнзима (Фигура 2В). Эти результаты показали , что σ 70 не может вытеснить C5 связан с РНКП, или что С5 не может эффективно вытеснять сг 70 , связанный с РНКП в однообходную анализе.
Рисунок 1:. Эффекты мутантных Нуса НТД в транскрипции (A) Транскрипция пауза анализы без Нуса, используя Нуса НТД (+ Нуса), Нуса НТД с спиралью 3 удалены (A Helix), и Нуса НТД с аланин замен в остатках K36, K37 , R104, Q108, K111, Q112, Q116 и R119 (Все Ала). P, сайт паузы; T, прекращение сайта; RO, стоком. Клинья выше геля показывают моменты времени выборка (0,5, 1, 1,5, 2, 5 и 10 мин) 15; (B) Пауза активность полураспада мутантного Нуса NTD относительно дикого типа белка. Среднее из 3-х экспериментов с СД. Эта цифра была изменена с Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Транскрипция ингибирование соединением C5 (А) Ингибирование кривой Е. палочки РНКП транскрипции путем соединения C5 в многораундовый анализе 14 в. Процент ингибирования транскрипции определяли с помощью РНК-продукта по сравнению с контролем (нет С5 настоящего) против концентрации C5, используемого в реакции. (B) Процент ингибирующая активность соединения C5 в однообходной трanscription пробы с добавлением C5 до (комплекса + σ 70; серый) и после (Голоэнзим + C5; черный) холофермента образования. Эта цифра была изменена с ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016 г.). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во всех организмах, транскрипция является жестко регулируется процесс. В пробирке транскрипции анализы были разработаны , чтобы обеспечить платформу для тестирования эффектов транскрипционных факторов, малых молекул и ингибиторов транскрипции. В этом методе бумаги, анализ методом для общей бактериальной транскрипции была описана. Транскрипция анализы в сочетании с гель-электрофореза для секвенирования транскриптов очень важны для механистических исследований, поскольку они позволяют визуализацию всех транскрипции продуктов вдоль временной шкалы. В результате, этот метод позволяет идентифицировать влияние незначительных изменений в условиях реакции и выявления вероятный механизм действия. Кроме того, становится возможным разработать конкретные транскрипционные анализы в отношении функции факторов транскрипции с неизвестными механизмами действия.
В данной работе мы также описали метод, чтобы подтвердить механизм действия ингибитора РНКП holoenZyme образование. Описанный здесь метод может отображать изменение каждой РНК-транскрипта с течением времени, а также при соответствующей модификации могут позволить тестирование антибактериальных агентов против каждой стадии транскрипции в зависимости от обстоятельств. многораундовый анализ может быть использован в качестве относительного простого метода скрининга для идентификации новых ингибиторов транскрипции ориентации, в то время как один раунд анализ может быть использован для изучения механизма ингибиторов, таких как конкурентные / неконкурентных свойствами. Следует отметить, что малой молекулярной агрегации могут вызывать ложные положительные хиты как неконкурентных ингибиторов в процессе обнаружения наркотиков и одного раунда механистического исследования могут обеспечить комплексный подход к оценке хит-к-свинца. В результате, этот контролируемый процесс транскрипции способен точно показывая , как ингибитор влияет на транскрипцию, который может помочь с рационализированному де Novo дизайна лекарств. Вместе с высокой разрешающей способностью информации о ингибитора сайтов связывания с помощью рентгеновской кристаллографии СТЮумирает, структура на основе рациональной разработке лекарственных препаратов будет наиболее подходящей для применения в лекарственных препаратах таргетирования транскрипции.
Хотя результаты с высокой пропускной способностью, не могут быть получены с помощью анализов в пробирке транскрипции, они чрезвычайно полезны в рассекает точные механизмы , связанные с контролем транскрипции. Компоненты и условия анализа могут быть легко модифицированы для индивидуальных потребностей. Различные факторы (например, NUSA) 4, 15, малые молекулы (например, ppGpp) 19 и / или транскрипции ингибиторы (например, рифампицин) 20 интереса могут быть добавлены , чтобы проверить свои функции в регуляции транскрипции. Шаблон ДНК должен быть разработан индивидуально, при тщательном выборе сильных промоторов, последовательности паузы и терминаторы. Для достижения высокой воспроизводимости анализа, белки должны быть высокоочищенный и свободный от остаточной РНКазы активности, и транскрипция буфер, ДНК-матрицу, иИсходный раствор NTP подложек должны быть сделаны в DEPC очищенной воды. Использование радиоактивных НПТ было описано в данной работе, однако флуоресцентные нуклеотиды могут быть также использованы 21. Качество ДНК-матрицы имеет решающее значение для успеха транскрипции анализа. Достаточное расстояние между промоторной / пауза / терминатор должен быть включен, позволяя различные транскрипционные продукты должны быть надлежащим образом разделены и исследованы. Гель последовательности должны быть надлежащим образом вылили и относительно свежий буфер КЭ должен быть использован для электрофореза для достижения максимально возможное разрешение РНК-транскриптов. Если разложение продукта транскрипции Замечено, ингибитор РНКазы высокого качества должны быть включены в реакционную смесь транскрипции. Трубы и наконечники пипеток должны быть двойной автоклавируют и перчатки должны быть носить в любое время при выполнении анализа, с тем чтобы свести к минимуму введение рибонуклеазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
