Summary
Humana tumörxenotransplantat är vaskulariserad och infiltreras av celler av musursprung under tillväxtfasen in vivo. För att kringgå bias orsakad av dessa kontaminerande celler under nedströms analys har vi utvecklat en metod som möjliggör omfattande utarmning av alla musceller genom magnetisk cellsortering.
Abstract
Användning av in vitro-cellinjen modeller för cancerforskningen har varit ett användbart verktyg. Emellertid har det visat sig att dessa modeller misslyckas med att på ett tillförlitligt sätt härma patientens tumörer hos olika analyser 1. Humana tumörxenotransplantat representerar guldmyntfoten med avseende på tumörbiologi, läkemedelsutveckling, och metastaser forskning 2-4. Tumörxenografter kan härröra från olika typer av material såsom tumörcellinjer, tumörvävnad från primära patientens tumörer 4 eller seriellt transplanterade tumörer. När propageras in vivo, är xenotransplanterat vävnad infiltrerad och vaskulariserad av celler av musursprung. Flera faktorer såsom tumör enhet ursprung xenotransplanterat material, tillväxt och regionen transplantation påverka sammansättningen och mängden av musceller som förekommer i tumörxenotransplantat. Men även när dessa faktorer hålls konstanta, är graden av förorening muscell mycket varierande.
contaminating musceller försämrar väsentligt nedströms analyser av humana tumörxenotransplantat. Som musfibroblaster visar hög plätering effekter och spridnings priser, tenderar de att växa över kulturer av humana tumörceller, särskilt långsamt prolifererande subpopulationer. Mus cell härledd DNA, mRNA och proteinkomponenter kan förspänna nedströms genuttryck analys, nästa generations sekvensering, såväl som proteomanalys 5. För att övervinna dessa begränsningar, har vi utvecklat en snabb och enkel metod för att isolera orörda humana tumörceller från xenotransplanterat tumörvävnad. Detta förfarande grundar sig på omfattande utarmning av celler av musursprung genom att kombinera automatiserad vävnadsdissociering med bänk vävnads dissociator och magnetisk cellsortering. Här visar vi att humana målceller kan vara kan erhållas med renhet högre än 96% inom mindre än 20 minuter oberoende av tumörtyp.
Introduction
Fasta humana tumörer består av flera fysiologiska samt neoplastiska celltyper. De bildar heterogena vävnader med komplexa biologiska strukturer. Biologiska processer som tumörbildning, progression och svar mot behandlingar är ännu inte helt klarlagda. Cellodling in vitro modeller utgör ett användbart verktyg för att studera och förstå tumörbiologi. Men de kan endast delvis spegelkonstruktioner och processer som finns i tumörvävnader. Pålitliga och stabila prekliniska humana tumörmodeller är en förutsättning för utvecklingen av anti-tumörläkemedel och behandlingar 4,6 samt för att förstå tumörbiologi och interaktionen mellan tumörceller och deras omgivning.
Humana tumör xenograft-modeller tagits fram ur primär patientens tumörer visar höga relationer till vävnaden ursprungs om histologiska arkitektur, interaktioner med mikromiljöstrukturer, metastatisk potential och svar på narkotika 7 in vitro-cellodlingsmodeller. Dessa egenskaper gör dem den gyllene standarden för prekliniska modeller 4. Förutom dess tillämpning i cancerforskningen är xenotransplantation av mänskliga celler i möss också ofta används inom stamcellsforskning för att bestämma stemness och differentiering potentialen hos en målgrupp 8.
Det har visat sig att den mänskliga mikrocirkulation och mänskliga immunceller ersätts på in vivo förökning av humana tumörer 2,9. Faktorer som tumör subtyp, tillväxttakt, och regionen transplantation få stora effekter på global nivå av infiltration samt sammansättningen av de typer mus cell hittades. Men även när dessa faktorer hålls konstanta, mängden och sammansättningen av musceller är mycket varierande.
Nedströms analyser av xenotransplanterat vävnader ofta utmanas av celler av murint ursprung. Primära kulturer av humana tumörceller från xenotransplantat ofta övervuxen av fibroblaster. Förutom att hindra alstringen av tumörcellinjer in vitro, är nedströms analyser såsom drog cytotoxicitet testning eller farmakokinetik förspänd sedan in silico korrigering för effekter som härrör från kontaminerande musceller är omöjligt i de flesta fall. Utöver detta, den enda delvis klar överhörning mellan musfibroblaster och humana tumörceller har en direkt inverkan på experimentella resultat av studier 10. Dessutom mest oförutsägbara variationer av infiltrerande musceller förvärrar molekylära nedströms analyser korrekta. I NGS eller proteom analyserar varje mus härrörande signal som mäts i stället för en human tumör signal direkt minskar sekvense känslighet. Även microarray baserad uttrycksanalyser utmanas av murin nucAnolsyra syror eventuellt tvär hybridiserande mänskliga prober.
För att kringgå hindren för kontamine musceller i nedströms analyser av humana tumörceller från xenograft modeller olika metoder har föreslagits. I många studier önskade målceller för nedströms analys isoleras genom att använda markörer eller kombinationer av markörer enbart uttrycks på humana tumörceller. Men bristen på tillförlitliga markörer för positiv identifiering av humana tumörceller utgör ofta ett stort hinder. Även i stort sett uttryckt markörer, såsom EpCAM på humana karcinom, visar ofta tumör inneboende uttrycksskillnader 11. Detta ökar risken att låg som uttrycker underpopulationer, t.ex., tumörceller genomgått epitelial-till-mesenkymala övergången, går förlorade under isolering. Dessutom kan den direkta bindningen av ett selektionsmedel till målcellen påverka efterföljande analysresultat. Försök nedbrytande musceller genommed användning av en kombination av antikroppar specifika för murin CD45 och MHC klass I-epitoper har också gjorts 12. Dock denna markör kombinationen detekterar endast en delmängd av musceller. Ett annat tillvägagångssätt är att förbättra analysprocesser genom programvara. Trots detta har alla dessa metoder är antingen inte lämpar sig för alla typer av experimentuppställning eller för någon tumör enhet och transplantationsmetod.
I denna studie presenterar vi en ny och snabb metod för omfattande nedbrytande musceller från xenotransplanterat vävnader oberoende av musstam och ursprungsvävnad. I visningar på flera målorgan och vävnader för transplantation av xenotransplantat (inklusive hud, lunga, hjärna, njure och skelettmuskel) kunde vi identifiera en kombination av antikroppar som möjliggör omfattande detektering av musceller. Dessa antikroppar kopplades till superparamagnetiska partiklar, titreras och optimerad för utarmning genom magnetisk cellsortering. Eftersom endast musspecifiktantikroppar används, humana målceller bo "orörd" och metoden är inte begränsad till xenotransplanted tumörvävnad. Vi visar att omfattande avlägsnande musceller från xenotransplanterat tumörprover standardiserar och underlättar kulturer av humana tumörceller. Vidare visar vi att analys av humana tumörxenotransplantat av nästa generations sekvensering är betydligt bättre. Eftersom denna effekt observerades även en human sekvens specifikt val har genomförts under exome anrikning, är påverkan på hela genomet och hela transkriptom sekvense förväntas bli ännu mer framträdande. Tagna tillsammans, avlägsnande av musceller med hjälp av denna nya metod underlättar odling av humana tumörceller och signifikant förbättrar de nedströms analyser av humana tumörxenotransplantat.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med lokala etiska och juridiska riktlinjer för Regierungspräsidium Freiburg Referat 35.
1. Beredning av reagens
OBS: Innan du startar experimentet, förbereda följande reagenser från dissociation kit:
- För att framställa enzymet H lösa varje ampull av frystorkat pulver i 3 ml RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) eller Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM). För att undvika upprepad frysning och upptining förbereda lämpliga portioner (t.ex. 200 mikroliter) och förvara dem vid - 20 ° C i upp till 6 månader.
- För att framställa enzym R upplösa flaskan med den frystorkade pulver i 2,7 ml RPMI eller DMEM-medium. För att undvika upprepad frysning och upptining förbereda lämpliga portioner (t.ex. 100 mikroliter) och förvara dem vid - 20 ° C i upp till 6 månader.
- För att framställa enzym A upplösa vIAL av frystorkat pulver i 1 ml buffert A som medföljer satsen utan virvelbildning. För att undvika upprepad frysning och upptining förbereda lämpliga portioner och lagra dem på (t.ex. 25 pl.) - 20 ° C i upp till 6 månader. Se till att blanda detta omedelbart före återkalla den erforderliga reaktionsvolym.
- Bered 250 ml buffert (1x PBS med 0,5% BSA) cellseparationsförfarande och antikroppar färgning för.
OBS: När odling av celler efter avlägsnande av musceller filtrera alla buffertar och enzymlösningar genom ett 0,22 pm filter.
2. Tumör Dissociation Protocol
OBS: I denna studie patientgenererade xenografter av icke-småcellig lungcancer (NSCLC), var njurcancer och urinblåsa används. Tumörerna genererades genom att implantera xenotransplantat av icke-småcellig lungcancer (NSCLC) njurcancer och blåsa i 4 - 6 veckor gammal kvinna NMRI nu / nu möss som beskrivits tidigare 13 OBS: Eftersom detta protokoll är helt oberoende av typen tumör, kan den användas för alla typer av patient eller cellinje-härledd tumör såväl som andra typer av human xenotransplanted vävnad utan modifiering av protokollet.
- Förbereda 5 ml digestion mix per vävnadsprov (upp till 1 g) nyligen genom att tillsätta 4,7 ml av RPMI 1640 eller DMEM, 200 pl av enzymet H, 100 pl av enzym R, och 25 | il enzym A till en cellulär dissociation rör ( C Tube). Se till att blanda enzym R suspensionen före återkalla önskad volym.
- Offra djuren genom cervikal dislokation under anestesi. Desinficera musen genom sprutning med liten mängd av 80% volym / volym etanol.
- Skörd subkutan tumör från musen flanken med hjälp av pincett och sax i en vävnadsodling huva. Skära in i huden öppna i stället för tumören med användning av sax och sedan separera tumören från intilliggande frisk vävnad med användning av pincett och sax.
OBS! Beroende av syftet medexperimentet utföra detta och följande steg under aseptiska förhållanden. I denna studie alla steg utfördes i en cellkultur huva under aseptiska förhållanden för att kunna odla cellerna. - Förbered tumörprov för klyvningar genom att ta bort fett (eftersom detta kommer att göra provet float) och nekrotiska områden (eftersom detta kommer att resultera i minskad lönsamhet) genom att skära bort med pincett och en skalpell. Mala vävnaden i stycken med 2 - 4 mm genom användning av skalpeller och pincett.
- Överför vävnaden bitar i C Tube innehåller matsmältningen mix.
- Stäng C Tube och se till att den är ordentligt stängd. Fästa den upp och ned på hylsan av bänk vävnads dissociator och se till att vävnaden bitar är placerade i området av rotorn / statorn.
- Välj läget "h_tumor_01" genom att trycka på "uppåt" eller "nedåt" tills läget visas på displayen och sedan trycka på "start" -knappen.
- Om dusjunga uppvärmningsfunktionen hos bänkvävnads dissociator, se till att också fästa värmaren. Då driftläge 37C_h_TDK_1 (för mjuka tumörer), 37C_h_TDK_2 (för medel tumörer) eller 37C_h_TDK_3 (för hårda tumörer) genom att klicka på mappsymbolen på pekskärmen tills mappen "Miltenyi" visas.
- För att välja läge genom att klicka på uppåt- eller nedåtpilen tills dissociation läget 37C_h_TDK_2 markeras. Ärmarna på benchtop vävnads dissociator är avbildade som positioner på displayen av anordningen. Välj positionerna proverna körs på genom att klicka på dem på pekskärmen. Tryck på "start" för att köra läget och fortsätta med steg 2,16.
OBS: Beroende på vilken typ tumör annan dissociation program kan vara lämpliga (se steg 2.7.1).
- Observera ett fönster som visar "Uppsägning av programmet" på skärmen. Efter avslutad programmet loss C Tube från bänk vävnads dissociator.
- Inkubera prov i 30 minuter vid 37° C under kontinuerlig rotation, t ex genom att använda ett rör rotator.
- Efter inkubation bifoga C Tube upp och ner på hylsan av stationärvävnads dissociator. Återigen se till att provmaterialet ligger i området av rotorn / statorn.
- Kör dissociation programmet h_tumor_02 (för mjuka och medel tumörer) eller h_tumor_01 (för hårda tumörer) som beskrivs i steg 2.7.1.
- Efter avslutad programmet loss C Tube från bänk vävnads dissociator.
- Inkubera provet under 30 min vid 37 ° C under kontinuerlig rotation.
- Bifoga C Tube upp och ner på hylsan av benchtop vävnads dissociator efter inkubation. Återigen se till att provmaterialet ligger i området av rotorn / statorn.
- Kör dissociation programmet h_tumor_03 (för mjuka tumörer), h_tumor_02 (för medel tumörer) eller h_tumor_01 (för hårda tumörer) som beskrivs i steg 2,7.
- Att samla in provmaterialet vid rörets botten utföra en short centrifugeringssteget (vid 100 xg under 10 sek).
- Resuspendera cellerna och tillämpas på en cell sil med 70 pm Nesh storlek placeras på en 50 ml tub. Tvätta cell sil med 20 ml RPMI 1640 eller DMEM.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 xg under 7 min. Aspirera supernatanten fullständigt.
- Resuspendera cellerna i 5 ml buffert för räkning. Fortsätt med musen cellbristen genom magnetisk cellseparation (avsnitt 3).
3. Mus cellstömning genom magnetisk cellseparation teknik
OBS: Volymerna för magnetisk märkning som anges nedan gäller för upp till 2 x 10 6 tumörceller eller 10 7 totala celler, inklusive röda blodkroppar. Beroende på tumörstorlek lägre eller högre cellantal kommer att erhållas. Vid färre celler använder samma volymer som anges. Vid användning av högre cellantal, skala upp alla reagensvolymer och totala volymerna därefter (t.ex. 4 x 10 6 tumörceller eller 2 x 10 4. Nedströms Analyser
OBS: Vid denna punkt cellsuspensionen består av en heterogen blandning av humana tumörceller såväl som mus-stromala och blodceller, inkluderande röda blodkroppar. Sammansättningen av celler beror starkt på tumörtypen och regionen för transplantation.
</ Li>
OBS: När du arbetar med högre cellantal upp till 2,5 ml av cellsuspensionen som framställdes enligt steg 3,5 kan appliceras på en kolonn.
OBS: Genomflödet innehåller renade humana tumörceller.
OBS! Innan utföra ytterligare analyser nedströms, en del av celler erhållna från mus-cell utarmningsförfarande kan analyseras (t.ex. utvärdera renhet och utbyte) i flödescytometri.
OBS: EpCAM är inte lämplig som tumörcellsmarkör någon tumörtyp. För tumörer som användes i denna studie EpCAM uttryck var känd.
OBS: Förutom flödescytometri, kan celler erhållna från separationsförfarandet odlas och användas för ytterligare analyser in vitro.
OBS: Beroende på tumörtyp beläggning, lämplig sådd densitet, och odlingsbetingelser kan variera.
OBS: Optimala odlingsbetingelser beror på den tumörtyp som används. Därför tillämpas odlingsbetingelser som är lämpliga för tumörtypen som används.
Obs: De antikroppar som används är inte lämpliga för någon tumörtyp som EpCAM inte kan uttryckas på tumörceller och / eller vimentin också uttrycks av tumörcellerna. Se till att antikroppar som används är lämpliga för xenograft model.
Representative Results
Olika tillvägagångssätt har föreslagits för att identifiera eller utarma musceller från xenotransplanterat humana tumörer, exempelvis en kombination av mus-specifika antikroppar mot CD45 och MHC klass I. Emellertid var endast subpopulationer av musceller detekteras med användning av dessa kombinationer, medan den föreslagna kombinationen detekterade CD45 och MHC klass i uttrycker musceller liksom resten av musceller som finns i målvävnader för transplantation (Figur 1). Med användning av denna nya kombination av antikroppar för magnetisk cellsortering, skulle humana tumörceller isoleras oberoende av tumörtyp (Figur 2).
Celler erhållna från magnetisk cellseparation förfarande baserade muscell avlägsnande kunde odlas, vilket leder till rena kulturer av humana tumörceller (Figur 4). Dessutom kunde viabla musceller erhållas och odlas frånsamma prov. Förutom avlägsnande av musceller, även skräp avlägsnas vid mus cell utarmning (MCD) (Figur 3).
Den omfattande utarmning av musceller samt avlägsnande av skräp leder till molekylära nedströms analyser förbättras. Detta visades genom att jämföra resultat som erhållits från hela exome sekvensering (WES) som utförs på bulk tumörstycken och muscell utarmat prover från tre olika patienthärledda xenografttumörmodeller (figurerna 5 - 9). Våra data visar att avlägsnandet av musceller innan du utför WES på xenograft tumörprover ökar inte bara avsevärt den totala mängden läser (Figur 5) utan också minskar avsevärt antalet värden härrörande läser mappas till människans referens genomet (Figur 6B). Eftersom dessa felaktigt kartlagt mus läser ofta störa SNP samtal, observerade vi en kraftig minskning av falskt förutspåttSNPs efter MCD (figurerna 7-8). Slutligen visade det sig att avlägsnandet av mus härrörande in silico läser av bioinformatiska metoder kan inte helt ersätta den experimentella proceduren, som en otvetydig sekvensbaserad tilldelning till arten ursprungs var inte möjligt för alla läser. Dessutom in silico förfarande kunde inte korrekt för bättre kvalitet och åtföljande högre läsning täckning av in vitro utarmat prover (Figur 9).
Figur 1. Att etablera en antikropp Cocktail erkänner Alla musceller över flera organ 14. Visningar i flera organ, inklusive hud, lunga, hjärna, njure och skelettmuskel, har utförts. Dessa organ representerar stora målvävnader för xenotransplantation. Kombinationer som de känner igen mouse CD45 och MHC klass I-epitoper har redan använts för att tömma musceller efter xenotransplantation. Emellertid är dessa markörkombinationer redovisas endast en delmängd av musceller i alla analyserade vävnader. I tidigare screen har identifierats en kombination av fem antikroppar gör det möjligt att omfattande detektering av alla celler från mus. Denna panel innehåller röda blodkroppar och är oberoende av ursprungsvävnad (A, B, och data ej visade). Modifierad från 14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Pålitlig och snabba utarmningen av musceller 15. Konjugat av antikroppen kombination med superpara nanoparticles användes för att utveckla en optimerad protokoll för utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat genom magnetisk cellsortering (magnetisk cellseparation) (A). Denna nya protokoll tillåts för eliminering av> 99% av förorenande musceller i mindre än 20 minuter, oavsett tumörtyp. Cellfraktioner erhållna från magnetisk förfarande cellseparation märktes med den pan-musantikroppen cocktail och en human specifik antikropp mot CD326 (EpCAM) (B). Modifierad från 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Isolering av humana glioblastomceller. Mouse Cell Depletion Kit användes för att isolera humana glioblastomceller från vuxen mouse hjärnan. Under dissociation av nervvävnad stora mängder skräp vanligen genereras. MCDK utarmar effektivt döda celler och skräp som ses av diagram som visar cellstorleken kontra cell precision. Med detta konjugat cocktail, var det möjligt att eliminera> 99% av de kontaminerande musceller och> 60% av skräpet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Utarmning av musceller Underlättar Nedströms Kulturer av humana tumörceller 14. Musfibroblaster hämmar ofta odling av humana tumörceller efter dissociation av transplanterade vävnader eller leda till heterogena kulturer. Fibroblaster fästa och växa mer effektivt och därmed igenväxning mål c alnar. Detta stör i cellodlings vitro (t.ex. läkemedels cytotoxicitet provning), eftersom matematisk korrektion för effekter som uppstår från att förorena musceller är omöjlig i de flesta fall. Den negativa (B) och positiva fraktioner (C) efter muscell utarmning odlades i tre dagar, fixeras och färgas för en mus-specifik fibroblast markör (Vimentin) och tumörmarkören humanspecifik CD326 (EpCAM). Som en kontroll, den ursprungliga fraktionen innehållande oseparerade cellerna (A) odlades och färgades också. Även efter tre dagars odling, var en nästan ren population av humana tumörceller observerades i den negativa fraktionen (B), medan den osorterade fraktion (A) var nästan övervuxen av fibroblaster. Endast en mindre del av målceller förlorades till den positiva fraktionen (C). Modifierad från 14.ge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Hela exome Sequencing (WES) av tumörprover Före och efter Mouse Cell Depletion (MCD) 15. Vi har utfört WES på tre olika xenograft-modeller som härrör från human njure, lunga och urinblåsecancer i syfte att bedöma effekterna av MCD på kvaliteten av nästa generations sekvenseringsdata. DNA från bulk tumören och från isolerade tumörceller efter mus cell utarmning användes för att generera exome-fångade sekvense bibliotek tillämpar en exome Capture Kit. För sekvensering på en stationär sequencer instrument, en stationär sequencer reagenskit 150 cykler, användes för att generera 75-bp parade slut läser. En signifikant ökning (p <0,05) i klusterdensitet (A) samt en aveilska ökade lästa räknar av 33% (B) observerades för proverna utarmats på musceller, vilket tyder på förbättrad prov kvalitet. På motsvarande sätt kan en kraftig minskning av skräp och döda celler på MCD också demonstreras genom flödescytometrianalys (se figur 3). Modifierad från 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Mus Cell Depletion (MCD) Minskar starkt Antal Felaktigt Mapped Mus Läser efter hela exome Sequencing (WES) 15. Som fånga oligonukleotider som används för riktad berikning av protein sekvenser utformades baserat på det mänskliga genomet, en inledande pre- anrikning av DNA-fragment av mänskligt ursprung frOm blandningen av mus och humana celler förväntades. För att bedöma antalet infångningsoligonukleotiderna som kan kors hybridiserar med mus iskt DNA genomförde vi BLAST sökningar i varje enskild snabb infångnings exome sond mot musgenomet. De resulterande inriktningsparametrar användes för att bestämma eventuell korshybridisering. (.. Anpassning längd, antal felpassningar, antal luckor) beroende på tröskelvärdena för val, förutspådde vi en korsreaktivitet av 5-10% av infångningssonder med mus-transkript (data ej visade). Efter adapter klippning (trimmomatic v0.32 16), mappas vi läser av alla prover mot mänskliga och mus genomen (BWA v0.7.12 17) och bestäms deras förmodade ursprung baserad på respektive inriktningsparametrar (Linux skal, kommandoraden Perl) (A). I genomsnitt 12% av läsningar härrör från bulktumörprover tillskrevs musceller. Denna mängd skulle kunna minskas till 0,3% genom tidigare utarmning av musceller (B Figur 6B exemplifierar detaljerad läsning uppdrag för bulk tumör och isolerade humana tumörceller härledda från cancer i urinblåsan xenograft. Modifierad från 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. MCD kraftigt reducerar den Antal Falskt Förutspådda SNP 15. För att bedöma effekten av musen läser mappas till det mänskliga genomet, bestämde vi antalet predicted SNP för xenograft proverna före och efter MCD. Eftersom ingen frisk vävnad var tillgängliga för jämförelse framställdes en SNP definieras som en skillnad mellan den sekvenserade provet och referensen genomet (hg19). Efter avlägsnande av duplikat läser, var SNP och INDEL samtal genomförs 18 och var begränsad till de regioner som omfattas av en exome Capture Kit. 63 ± 10% av alla SNP förutses för de bulktumörprover inte längre detekteras efter muscell utarmning, 18 ± 1% var specifika för de isolerade humana tumörceller (A). Medan den förstnämnda främst orsakas av felaktigt kartlagt mus läser senare tycktes detekteras på grund av högre lästa räknas och därmed högre täckning inom de isolerade humana tumörcellprover. Denna effekt var också synliga för förutsagda InDels (B). Modifierad från 15. Klicka här för att se en större version av dennafigur.
Figur 8. MCD Förbättrar Prediction av hög effekt SNP 15. (A) Effekterna av MCD på SNP förutsägelse inom en proteinkodande exon av POLA1 genen 19 exemplifieras. Medan felaktigt kartlagt mus läser orsakade ett antal falskt förutspådda SNP i bulk njurcancer xenograft var dessa SNP saknas efter MCD. Dessutom MCD förbättrades också förutsägelsen av slagtålig SNP. Till exempel, läser mus mappas till det humana referens genomet i bulktumörprov resulterade i felaktigt predikterade förstörelsen av startkodonet hos GRIA3 genen (B). Modifierad från 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
s = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figur 9. in silico Utarmning av mus-derived Läser kan inte helt ersätta I n Vitro MCD 15. Avläser förutsägs vara av musursprung var beräknings bort från sekvenseringsdata, och SNP ringer upprepades. Genom detta tillvägagångssätt, antalet SNP förutses för de bulktumörprover reducerades avsevärt från 63% till 8,5% av det totala antalet SNP (jämför med figur 8). Men detta in silico tillvägagångssätt inte kunde helt ersätta in vitro MCD, särskilt om förbättrade prov kvalitet och den åtföljande ökningen av avläsningsvärden och täckning beaktas. Modifierad från 15."_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi har utvecklat en snabb och enkel metod för att isolera orörda humana tumörceller från xenotransplanterat tumörvävnad. Detta förfarande grundar sig på omfattande utarmning av celler av musursprung genom att kombinera automatiserad vävnadsdissociering och magnetisk cellsortering. Förutom utarmning av alla musceller också mängden döda celler och skräp minskar avsevärt i målet cellfraktionen. Tagna tillsammans, denna metod förbättrar signifikant molekyl nedströms analyser och odling av humana tumörceller.
I motsats till alternativa metoder, finns det inget behov av kunskap om tumörcellspecifika markörer, anpassning till varierande kompositioner av musceller eller grundande av algoritmer. Denna metod är oberoende av den musstam och tumörtyp. Därför en bias genom isolering av humana tumör subpopulationer på grundval av enskilda mänskliga specifika markörer som kan variera i uttryck, som visas för EpCAM 11, är att undvikaed. Dessutom är det inte begränsat till tumörmaterial, men kan användas för alla typer av xenotransplanted vävnad musceller är riktade i stället för specifika humana tumör subpopulationer (data visas ej).
Omfattande avlägsnande av musceller underlättas genom att rikta ytan epitoper uteslutande uttrycks på celler av musursprung. Bortsett från väletablerad metod för tumör dissociation som presenteras i denna studie, det finns många förfaranden som använder olika typer av enzymer. Bevarande av cellyte-epitoper är en förutsättning för denna nya metod, men också för noggranna analyser av humana tumörcellpopulationer. Därför är det av avgörande betydelse att mjuka enzymer används för nedbrytning av tumörvävnad. Således kan mus cell utarmning endast användas i kombination med enzymatisk nedbrytning förfaranden som uppenbarligen inte påverkar epitoper riktade under mus cell utarmning förfarande. I tveksamma fall detta kan verifieras endast av respektive tillverkare.
Avlägsnande av musceller signifikant förbättrar odling av humana tumörceller genom att undvika kulturen växa över av musfibroblaster. Dessutom är analysen av humana tumörxenotransplantat av nästa generations sekvensering förbättrats avsevärt och standardiseras. Eftersom denna effekt observerades även en riktad human sekvensspecifik val har genomförts under exome anrikning, är påverkan på hela genomet och hela transkriptom sekvense förväntas bli ännu mer framträdande.
Dessutom underlättar Accura den presenterade metodente molekylära studier av tumör subpopulationer inom xenotransplanted humana tumörer. Avlägsnande av musceller från respektive prov i det första steget och därefter sortering humana tumörceller i två olika subpopulationer möjliggör direkt molekylär jämförelse av tumören subpopulationen av intresse för humana bulktumörceller 20. Differentiell genuttryck mellan tumörcelltyper kan mer tillförlitligt sätt eftersom den inte påverkas av korshybridisering av mus-härledda molekyler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Petri dish 100 mm | Various | ||
| Scalpel | Various | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
| anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
| goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
| Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
| FBS | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
References
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494 (2013).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
- Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
- Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
- Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
- Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
- Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , AACR. (2014).
- Agorku, D., et al. Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , AACR. (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146 (2015).
