Abstract
أنواع البروسيلا هي مسببات الأمراض داخل الخلايا الاختيارية التي تصيب الحيوانات مثل مضيفيهم الطبيعي. انتقال إلى البشر هو سبب الأكثر شيوعا عن طريق الاتصال المباشر مع الحيوانات المصابة أو عن طريق تناول الطعام الملوث، ويمكن أن تؤدي إلى التهابات مزمنة خطيرة.
البروسيلا يمكن أن تغزو الخلايا البلعمية المهنية وغير المهنية ونسخ متماثلة داخل الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) فجوات -derived. لا تزال العوامل المضيفة اللازمة لدخول البروسيلا في الخلايا المضيفة، وتجنب تدهور الليزوزومية، وتكرارها في حجرة مثل ER مجهولة إلى حد كبير. نحن هنا وصف تحليلين لتحديد العوامل المضيفة المعنية في دخول البروسيلا وتكرارها في خلايا هيلا. تصف البروتوكولات استخدام تدخل الحمض النووي الريبي، بينما يمكن تطبيق أساليب فحص بديلة. وتستند فحوصات للكشف عن البكتيريا fluorescently المسمى في الخلايا المضيفة fluorescently المسمى باستخدام الآليالمجهر واسعة المجال. ويتم تحليل الصور الفلورسنت باستخدام خط أنابيب تحليل صورة موحدة في CellProfiler الذي يسمح واحد خلية القاعدة عدوى التهديف.
في فحص نقطة النهاية، يتم قياس تكرار داخل الخلايا بعد يومين من الإصابة. وهذا يسمح للبكتيريا حركة المرور إلى مكانة تنسخي من حيث بدأ انتشار حوالي 12 ساعة بعد دخول البكتيريا. البروسيلا التي أنشأت بنجاح المتخصصة داخل الخلايا وبالتالي انتشرت بقوة داخل الخلايا المضيفة. منذ البكتيريا داخل الخلايا سوف يفوق عدد كبير الفردية البكتيريا غير تنسخي خارج الخلية أو الخلايا، مما يشكل ضغطا التعبير جوهري GFP يمكن استخدامها. ثم يتم استخدام إشارة GFP قوية لتحديد الخلايا المصابة.
في المقابل، لفحص دخول لا بد من التفريق بين داخل وخارج الخلية البكتيريا. هنا، يتم استخدام ترميز سلالة لGFP التتراسيكلين محرض. الحثمن GFP مع تعطيل وقت واحد من البكتيريا خارج الخلية التي كتبها جنتاميسين يمكن التفريق بين داخل وخارج الخلية البكتيريا بناء على إشارة GFP، مع البكتيريا داخل الخلايا الوحيدة أن تكون قادرة على التعبير عن GFP. وهذا يسمح للكشف قوية من البكتيريا داخل الخلايا واحدة قبل بدأ انتشار الخلايا.
Introduction
أنواع البروسيلا هي سلبية الغرام، مسببات الأمراض داخل الخلايا الاختيارية التي تنتمي إلى فئة α-متقلبات. أنها تسبب الإجهاض والعقم في مضيفيهم الطبيعية مثل الأبقار والماعز والأغنام أو مما أدى إلى خسائر اقتصادية حادة في المناطق الموبوءة. الحمى المالطية هي واحدة من الأمراض الحيوانية المنشأ أهم مما تسبب في أكثر من نصف مليون إصابة بشرية جديدة سنويا 1 في جميع أنحاء العالم. سبب انتقال العدوى إلى الإنسان الأكثر شيوعا عن طريق الاتصال المباشر مع الحيوانات المصابة أو عن طريق تناول طعام ملوث مثل الحليب غير المبستر. أعراض المرض الحمى غير محددة، مما يسبب صعوبات في تشخيص الحمى المالطية. وإذا لم يعالج، يمكن للمرضى تطوير عدوى مزمنة يعانون من أعراض أكثر شدة مثل التهاب المفاصل، التهاب الشغاف، والاعتلال العصبي 2.
على المستوى الخلوي البروسيلا غير قادرة على غزو أكلة وغير أكلة الخلايا ويعيد داخل داخل الخلايامقصورة المعروفة باسم البروسيلا المحتوية فجوة (BCV). استيعاب البكتيريا يتطلب إعادة ترتيب الأكتين الهيكل الخلوي من قبل راك، رو، وتفعيل مباشر من Cdc42 3. داخل الخلية المضيفة حقيقية النواة، وBCV بالاتجار على طول الطريق التقامي وعلى الرغم من التفاعل مع الجسيمات الحالة والبكتيريا إدارة لتجنب تدهور 4. مطلوب تحمض BCV من قبل حويصلي أتباز للحث على التعبير عن نوع البكتيريا نظام الرابع إفراز (T4SS) 5. ويعتقد أن المستجيبات البكتيرية التي يفرزها T4SS ضرورية لالبروسيلا لتأسيس مكانته تنسخي، منذ حذف T4SS 6 أو تثبيط من الرصاص أتباز حويصلي إلى عيوب في تأسيس مكانة داخل الخلايا 7. البكتيريا لا تكرار خلال المرحلة الاتجار حتى التوصل إلى مقصورة فجوي المستمدة ER 8. بمجرد أن يحدث الانتشار داخل الخلايا، تم العثور على BCV في البنودجمعية بيئة نظام التشغيل مع علامات ER مثل calnexin والجلوكوز-6-الفوسفاتيز 6.
الآليات الجزيئية التي البروسيلا يدخل خلايا، ويتجنب تدهور الليزوزومية، وأخيرا يكرر في حجرة مثل ER لا تزال مجهولة إلى حد كبير. وأساسا تم تحديد العوامل المضيفة المعنية في مختلف مراحل العدوى عن طريق نهج المستهدفة أو صغيرة بالتدخل RNA (سيرنا) شاشة صغيرة الحجم التي أجريت في خلايا ذبابة الفاكهة 9. وتسلط هذه الضوء على مساهمة العوامل المضيفة الفردية خلال العدوى البروسيلا لكننا لا نزال بعيدين عن فهم شامل للعملية برمتها.
هنا، يتم عرض البروتوكولات التي تسمح بتحديد العوامل المضيفة الإنسان باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (رني) فحص واسعة النطاق في تركيبة مع الآلية المجهر مضان واسعة المجال وتحليل الصور الآلي. يتم تنفيذ عكسي ترنسفكأيشن سيرنا من خلايا هيلا كما describإد في وقت سابق 10،11 مع تعديلات طفيفة. ويشمل فحص نقطة النهاية جزءا كبيرا من دورة حياة الخلايا البروسيلا باستثناء الخروج وإصابة الخلايا المجاورة. لمزيد من تميز الضربات المحددة في فحص نقطة النهاية، يتم استخدام البروتوكول المعدل لتحديد العوامل التي تدخل في الخطوات الأولى من الإصابة.
ويستخدم المجهضة سلالة البروسيلا الذي يعبر بشكل جوهري GFP لفحص نقطة النهاية حيث يسمح للبكتيريا تصيب الخلايا لمدة يومين. خلال هذا الوقت، والبكتيريا تدخل الخلايا، حركة المرور إلى مكانة تنسخي المستمدة ER، وتكرار في مساحة شبه النووي. ويمكن بعد ذلك مستويات عالية من إشارة GFP أن تستخدم لكشف موثوق الخلايا الفردية التي تحتوي على البكتيريا تكرار.
لدراسة دخول البروسيلا في مقايسة الإنتاجية العالية، فمن المهم أن تكون قادرا على التمييز بين البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية. طريقة عرض هنا circumvالوالدان التفاضلية تلوين الأجسام المضادة للبكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية. لأنه يقوم على سلالة البروسيلا تعبر عن GFP التتراسيكلين محرض بالاشتراك مع التعبير التأسيسي عن dsRed. وجود علامة عن dsRed التأسيسية يسمح بتحديد جميع البكتيريا الموجودة في العينة. هو فعل التعبير GFP بإضافة غير سامة anhydrotetracycline التتراسيكلين التناظرية (ATC) في وقت واحد مع تثبيط البكتيريا خارج الخلية التي كتبها جنتاميسين (جم). في حين أن المضادات الحيوية جم خلايا كتيمة يقتل البكتيريا خارج الخلية، يمكن ATC دخول الخلية المضيفة وحمل التعبير GFP انتقائي في البكتيريا داخل الخلايا. يسمح هذا المراسل المزدوج فصل قوي من البكتيريا داخل الخلايا واحدة (GFP وإشارة عن dsRed) من البكتيريا خارج الخلية (إلا إشارة عن dsRed) باستخدام المجهر واسعة المجال. من أجل الوصول إلى التعبير GFP كشفها بواسطة الخلايا البروسيلا وجدنا أن 4 ساعات من تحريض من قبل ATC النتائج في RELIإشارة قادرة. وقد استخدمت مخططات تحريض مماثلة للتعبير بشكل انتقائي GFP في البكتيريا داخل الخلايا سابقا لدراسة الشغيلة داخل الخلايا 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب أن يؤديها كل عمل مع الحية سلالات المجهضة البروسيلا داخل مختبر مستوى السلامة الحيوية 3 (BSL3) النظر في جميع اللوائح اللازمة واحتياطات السلامة.
1. إعداد لوحات الفحص والتثقيف من البكتيريا والخلايا
- التحضير للثقافات كاتب البروسيلا المجهضة
- خط البروسيلا المجهضة 2308 (B. المجهضة) من -80 ° C الأسهم الحليب على لوحة زيتية الصويا آجار (TSA) يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (TSA / كم). احتضان لوحة لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية. استخدام سلالة البروسيلا المجهضة 2308 pJC43 (apHT :: GFP) (13) لفحص نقطة النهاية وسلالة البروسيلا المجهضة pAC042.08 (apht :: عن dsRed، تيتو :: tetR-GFP) لفحص دخول.
ملاحظة: lipopolysaccharide في سلسة (LPS) من البروسيلا المجهضة هو من العوامل الفوعة مهم ولكن يمكن أن تحدث طفرات الخام على ترددات عالية نسبيا (14). Wهكذا ه يوصي اختبار حالة إجهاد ثقافة قبل أن تبدأ مع هذه التجربة. - البكتيريا Restreak على أربع لوحات TSA / كم تغطي لوحة كاملة واحتضان لمدة 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية.
- باستخدام حلقة من البلاستيك القابل للتصرف، ونقل والبكتيريا و resuspend من لوحات TSA / كم في 10 مل 10٪ الحليب الخالي من الدسم تعقيمها. تأكد من أن البكتيريا ومعلق بشكل جيد لضمان تركيز البكتيرية متسقة في جميع الثقافات بداية.
- قسامة 250 ميكرولتر من تعليق البكتيرية إلى 2 مل المسمار الأنابيب الغطاء وتجميد في -80 درجة مئوية.
- ذوبان الجليد قسامة من ثقافة المبتدئين ونقل 25 ميكرولتر، 50 ميكرولتر، و 100 ميكرولتر من ثقافة بداية البكتيرية لفصل 250 مل المسمار زجاجات سقف مع 50 مل زيتية الصويا مرق (TSB) التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (TSB / كم) . ختم الزجاجات مع بارافيلم.
- احتضان الزجاجات بين عشية وضحاها على شاكر المداري في 100 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
- قياس الكثافة البصرية في 600 نم (OD 600) لتحديد حجم ثقافة المبتدئين اللازمة للتوصل الى OD 600 = 0،8-1،1 بعد الثقافة بين عشية وضحاها.
- خط البروسيلا المجهضة 2308 (B. المجهضة) من -80 ° C الأسهم الحليب على لوحة زيتية الصويا آجار (TSA) يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (TSA / كم). احتضان لوحة لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية. استخدام سلالة البروسيلا المجهضة 2308 pJC43 (apHT :: GFP) (13) لفحص نقطة النهاية وسلالة البروسيلا المجهضة pAC042.08 (apht :: عن dsRed، تيتو :: tetR-GFP) لفحص دخول.
- إعداد خلايا هيلا
- تنمو خلايا هيلا في Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) (DMEM / 10٪ FCS) في حاضنة الرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تنمو خلايا إلى 80٪ confluency.
- إعداد لوحات الفحص مع الرناوات siRNAs.
- تمييع الرناوات siRNAs في ريبونوكلياز خالية من المياه إلى تركيز النهائي من 0.32 ميكرومتر. نقل 5 ميكرولتر / جيد لسوداء واضحة جيدا القاع شقة 384 لوحات جيدا.
- استخدام الأعمدة 1، 2، 23، و 24 لعناصر التحكم القياسية. لضوابط السلبية، استخدم عدم استهداف سيرنا (مشفر) وهمية الآبار دون الرناوات siRNAs (كاشف ترنسفكأيشن فقط). لضوابط ترنسفكأيشن، استخدام سيرنا أن يدفع موت الخلايا (KIF11)، وكذلك الضوابط الإيجابية من العوامل المضيفة معروفة تشارك في عدوى البروسيلا (على سبيل المثال، ARPC3،وهو مكون من مجمع Arp2 / 3 المشاركة في بلمرة الأكتين). نقل المتاحة تجاريا المكتبات سيرنا أو الرناوات siRNAs مخصصة إلى الآبار المتبقية.
- لوحات الختم مع رقائق الألومنيوم peelable. متجر لوحات في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 6 أشهر وحتى سنوات اعتمادا على توصيات الشركة الصانعة.
- تمييع الرناوات siRNAs في ريبونوكلياز خالية من المياه إلى تركيز النهائي من 0.32 ميكرومتر. نقل 5 ميكرولتر / جيد لسوداء واضحة جيدا القاع شقة 384 لوحات جيدا.
2. عكسي سيرنا ترنسفكأيشن
- ذوبان الجليد أسود 384 لوحة جيدا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: ستكون هذه اسقاط كل السوائل التي قد تنضم إلى غطاء أو الجانب من الآبار. - إعداد المتوسطة ترنسفكأيشن عن طريق تمييع ترنسفكأيشن الكاشف 1: 200 في DMEM دون FCS في درجة حرارة الغرفة. إعداد المتوسطة ترنسفكأيشن أي أطول من 20 دقيقة قبل الاستخدام. بعناية مزيج الحل قبل الاستخدام.
- إضافة 25 ميكرولتر المتوسطة ترنسفكأيشن إلى كل بئر باستخدام موزع كاشفوخلط الحلول عن طريق تحريك لوحة ذهابا وإيابا.
- احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح سيرنا / ترنسفكأيشن تشكيل معقد كاشف.
- في غضون ذلك، وإعداد خلايا هيلا عن طريق غسل الخلايا شبه متموجة من دورق 75 سم 2 مرة واحدة مع 2.5 مل 0.05٪ التربسين-EDTA في برنامج تلفزيوني (التربسين).
- إضافة 1.5 مل التربسين الطازجة ونقل القارورة إلى 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق حتى تعتقل الخلايا يصل.
- resuspend الخلايا في 10 مل قبل تحسنت DMEM / 16٪ FCS.
- عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي وإعداد تعليق خلية من 10000 خلية / مل في DMEM / 16٪ FCS.
- إضافة تعليق خلية 50 ميكرولتر من كل بئر باستخدام موزع كاشف مما أسفر عن 500 خلية / جيد.
- نقل لوحة ذهابا وإيابا إلى تحقيق التوزيع المتساوي للخلايا. ترك لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة للسماح للخلايا ليستقر.
- ختم لوحة مع parafilm واحتضان لمدة 72 ساعة على الألومنيوم قبل تحسنتلوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية الرطبة مع 5٪ CO 2.
ملاحظة: لوحة الألومنيوم قبل تحسنت تسمح توزيع درجة الحرارة على قدم المساواة في جميع أنحاء كامل لوحة 384 جيدا.
3. العدوى والتثبيت
- قبل يوم واحد للإصابة، تطعيم المبلغ المحدد في 1.1.7 من B. المجهضة الثقافة بداية في 50 مل TSB / كم المتوسطة في 250 مل المسمار غطاء زجاجة. ختم زجاجة مع بارافيلم وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة على شاكر المداري إلى OD 600 = 0،8-1،1.
- قياس OD 600 من ثقافة البكتيرية وإعداد المتوسطة العدوى عن طريق تمييع ثقافة البكتيرية في DMEM / 10٪ FCS لتحقيق تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية).
ملاحظة: للحصول على معدل إصابة 5-10٪ في خلايا هيلا، ويستخدم وزارة الداخلية من 10،000. يجب أن يتم تنفيذ منحنى المعايرة وزارة الداخلية لكل نوع من الخلايا للحصول على معدلات الإصابة المثلى. - تبادل المتوسطة ترنسفكأيشن من 384 لوحة جيدامع 50 ميكرولتر من المتوسطة العدوى باستخدام لوحة الغسالة الآلية.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة 384 جيدا في 400 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: هذا يساعد على مزامنة عملية العدوى. - ختم لوحة مع parafilm واحتضان على لوحة الألومنيوم قبل تحسنت في حاضنة الرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعة.
- غسل الخلايا مع DMEM / 10٪ FCS تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جم لتعطيل البكتيريا خارج الخلية باستخدام لوحة غسالة الآلي (استخدام 200 ميكرولتر / غسل فيضي أيضا).
ملاحظة: أثناء غسل تجاوز، لوحة الغسالة الآلية يوزع في وقت واحد وaspirates المتوسطة. - لفحص دخول، وغسل الخلايا مرة ثانية مع DMEM / 10٪ FCS تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جم و 100 نانوغرام / مل ATC باستخدام لوحة غسالة الآلي (استخدام 200 ميكرولتر / غسل فيضي أيضا).
- ختم لوحة مع بارافيلم وإعادته إلى لوحة الألومنيوم قبل تحسنت في حاضنة الرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لآخر40 ساعة أو 4 ساعات، لفحص نقطة النهاية وفحص الدخول، على التوالي.
- لتثبيت، وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني باستخدام غسالة لوحة الآلي (استخدام 200 ميكرولتر / غسل فيضي أيضا).
- صرف برنامج تلفزيوني مع 50 ميكرولتر 3.7٪ امتصاص العرق في 0.2 M HEPES في درجة الحموضة 7.4 (PFA) باستخدام لوحة الغسالة الآلية.
ملاحظة: تنبيه: PFA سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد وإن بلع. - احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تبادل المتوسطة التثبيت مع 50 ميكرولتر PBS باستخدام لوحة الغسالة الآلية. ملاحظة: هذه العينات هي الآن مستعدة لاتخاذها للخروج من BSL3 إذا لزم الأمر.
تحذير: إزالة أي عينة من منشأة BSL3 تخضع لتقييم المخاطر والتحقق من صحة الإجراءات وتعتمد على اللوائح المعمول بها للسلامة الأحيائية.
4. تلطيخ
- غسل الخلايا مرتين مع 50 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
- Permeabilize الخلايا في 50 ميكرولتر 0.1٪ تريتون-X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- Wخلايا الرماد ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على دابي 1 ميكروغرام / مل (4، 6 diamidino-2-phenylindole)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وحماية تلطيخ من الضوء مع رقائق الألومنيوم.
5. التصوير
- إعداد الآلية المجهر واسعة المجال لاكتساب صورة.
ملاحظة: يتم وصف إعدادات المجهر ImageXpress جهاز الجزيئي باستخدام برنامج MetaXpress أدناه. بديلة 2D أجهزة المجهر واسعة المجال مع مواصفات الأجهزة المناسبة وبرامج التصوير يمكن استخدام (انظر جدول المواد / المعدات لمزيد من التفاصيل).- حدد الهدف 10X، كاميرا binning = 1، كسب = 1.
- حدد تنسيق لوحة المقابلة لوحة 384 بشكل جيد.
- الحصول على 9 مواقع لكل بئر.
- استخدام "تمكين تركيز الليزر على أساس" و "التركيز على لوحة وأسفل جيدا".
- تعيين "أولا بشكل جيد" كما البئر الأولي لالعثور على عينة و"جميع المواقع" لضبط تلقائي للصورة الموقع.
- استخدام قناة دابي لمجموعة لالتركيز إزاحة Z يدويا.
- اختر يدويا من دابي لجميع القنوات الأخرى إزاحة Z.
- يدويا تصحيح الوقت التعرض لجميع القنوات لضمان مجموعة واسعة ديناميكية مع التعرض المفرط منخفضة.
- الحصول على صورة من موقع تمثيلي باستخدام وظيفة لصناعة السيارات في التعرض. استخدام هذا الوقت التعرض لصورة 3-5 المواقع في جميع أنحاء لوحة وضبط وقت التعرض يدويا حتى تصل ألمع بكسل ~ 80٪ من سطوع القصوى على جميع المواقع.
- صورة لوحة كاملة باستخدام قنوات دابي وGFP لفحص نقطة النهاية. لفحص دخول حدد القناة طلب تقديم العروض بالإضافة.
6. الآلي تحليل الصور
ملاحظة: CellProfiler 2 15 كخادمة برمجيات تحليل الصور لقطاع الخلوي والكائنات البكتيرية وأداء الآلي قياس آثافةبيانات أدلى داخل الكائنات التي تم تحديدها. يوفر البرنامج خوارزميات تحليل الصور في الوحدات الفردية، والتي يمكن دمجها في خط الأنابيب الذي سيتم تنفيذ وحدات على التوالي في جميع الصور، لأداء تلقائيا مهمة تحليل صورة معينة. لمتابعة بروتوكول، تثبيت CellProfiler 2.1.1 أو إصدار أحدث. ثم، تحميل خط أنابيب المقدمة واتباع التعليمات التالية لضبط المعلمات المطلوبة في وحدات. وصف الوحدات الفردية لجميع خطوط الأنابيب يمكن العثور عليها في ملفات التكميلية.
ملاحظة: يتم استخدام اثنين من خطوط أنابيب منفصلة لكل فحص. اول خط انابيب بحساب نموذج التظليل، والذي يستخدم من قبل خط أنابيب ثان لتصحيح الصور قبل التحليل. يتم تطبيق تصحيح التظليل على صور للحد من الآثار المترتبة على مسار الضوء غير متجانس من المجهر. حساب نموذج التظليل في خط أنابيب الأول هو عملية طويلة، ولكن سوف تكون النتائج من أعلى قدر من الدقة.
- <لى> نقطة النهاية الفحص
- حساب نموذج التظليل
- انتقل إلى القائمة "ملف"، اختر "استيراد" → "خط أنابيب من ملف ..."، وحدد قدمت خط أنابيب "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". وعندما سئل عما إذا كان لتحويل خط أنابيب إرث، والإجابة "لا تحويل".
- الذهاب إلى "إخراج" → "عرض إعدادات إخراج" وحدد مجلد الإدخال مع الصور ومجلد الإخراج لنماذج التظليل الناتجة عن ذلك.
- في وحدة نمطية (1) "LoadImages"، وضبط اسم "نص على أن هذه الصور لها من القواسم المشتركة" لمطابقة أسماء الصورة.
- تأكد من أن أيا من وحدات تظهر العرض الخاصة بها قبل تشغيل تحليل كامل عن طريق إلغاء كل حرف العين إلى جانب وحدات. ملاحظة: هذا بشكل ملحوظ يقلل الحاجة إلى موارد الحاسوبية أثناء معالجة خط الأنابيب.
- اضغط على "تحليل الصور" لبدء حساب نموذج التظليل.
- تشغيل تحليل الصور
- انتقل إلى القائمة "ملف"، اختر "استيراد" → "خط أنابيب من ملف ..."، وحدد قدمت خط أنابيب "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". وعندما سئل عما إذا كان لتحويل خط أنابيب إرث، والإجابة "لا تحويل".
- الذهاب إلى "إخراج" → "عرض إعدادات إخراج" وحدد مجلد الإدخال مع الصور ومجلد الإخراج لجدول البيانات الناتجة.
- في وحدة (1) "LoadImages"، وضبط اسم "نص على أن هذه الصور لها من القواسم المشتركة" لمطابقة أسماء الصورة.
- في وحدة (2) "LoadSingleImage"، تحميل نماذج التظليل المحسوب وفقا 6.1.1 عن طريق اختيار الموقع وأسماء من نماذج التظليل اثنين.
- في وحدات (4) - (5) "ImageMath"، وضبط المعلمة "اضرب الصورة الأولى" مطابقة عمق بت من الكاميرا المجهر. لمدة 8 و 16 بتصور تعيين المعلمة إلى "1.0"، ل12 بت الصور مجموعة المعلمة إلى "16.0".
- في وحدة (9) "ImageMath" ضبط المعلمة "مضاعفة الصورة الثانية" إلى قيمة (تبدأ مع 0.25) من شأنها أن قمع إشارة البروسيلا في تلطيخ دابي دون قمع النوى.
- انقر على زر "ابدأ اختبار الوضع"، ثم تفعيل رمز وقفة وظيفة عرض لنموذج (9) من خلال النقر على الرموز المقابلة من الوحدة.
ملاحظة: سيظهر رمز وقفة باللون الأصفر، في حين أن رمز العين سوف تظهر العين مفتوحة إذا تفعيلها. - انقر على زر "تشغيل" لتشغيل تحليل ما يصل إلى الوحدة (9) مع رمز وقفة النشط. لاختبار قيم وحدة، اضغط على "الخطوة".
- انقر بزر الماوس الأيمن على صورة افتتح حديثا وضبط "على النقيض من صورة" إلى "تسجيل تطبيع". مرارا وتكرارا التراجع إلى وحدة (9)، وضبط المعلمة "اضرب الصورة الثانية"، وخطوة على ركان الوحدة النمطية مرة أخرى، حتى يتم قمع إشارة البروسيلا بالكامل في حين يتم الحد في نفس المناطق السوداء الوقت التي تشير إلى الإفراط في الطرح في الصورة نتيجة.
- انقر على زر "ابدأ اختبار الوضع"، ثم تفعيل رمز وقفة وظيفة عرض لنموذج (9) من خلال النقر على الرموز المقابلة من الوحدة.
- في وحدة (10) "IdentifyPrimaryObjects"، تعيين المعلمة "السفلى ملزمة على عتبة" عالية بما فيه الكفاية (بداية مع صفر) بحيث تتم تجزئة النوى ويتم تجاهل الخلفية.
- لتحديد قيمة جيدة مقابل وحدة (10)، خطوة على حدة وعرض الصورة المدخلة كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2.
- بزر الماوس الأيمن فوق الصورة المدخلة وعرض الرسم البياني.
ملاحظة: ذروة الرسم البياني يشير عادة الخلفية. - بدءا من شدة خلفية زيادة المعلمة حتى يتم التوصل إلى تجزئة جيدة من نوى كما هو معروض في الصورة الانتاج.
ملاحظة: تحديد عتبة أعلى من كثافة الخلفية أهمية خاصة لمواقع فارغة.
- في وحدة (15)4؛ FilterObjects "، وضبط المعلمة" قيمة الحد الأدنى "بحيث يتم الاحتفاظ الخلايا مع البروسيلا واضحة للعيان في النواة، وجميع الآخرين تصفيتها بعيدا في هذه الخطوة، وتجاهل البروسيلا خارج النواة.
- لتحديد قيمة جيدة، خطوة على حدة وعرض الصورة الانتاج كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2. نبدأ من الصفر، والذي يعرف كل الخلايا كما المصابة، وزيادة القيمة من خلال خطوات صغيرة حتى الخلايا فقط مع البروسيلا واضحة للعيان في نواة يتم الاحتفاظ.
- في وحدة (16) "FilterObjects"، وضبط المعلمة "قيمة الحد الأدنى" بحيث يتم الاحتفاظ الخلايا مع البروسيلا واضحة للعيان في perinucleus، ويتم تصفية كل الخلايا الأخرى بعيدا. استخدام نهج مماثل كما هو الحال في وحدة السابقة.
- في وحدة (17) "FilterObjects"، وضبط المعلمة "قيمة الحد الأدنى" بحيث الخلايا مع البروسيلا واضحة للعيان في VORيتم الاحتفاظ خلايا الجسم onoi، ويتم تصفية كل الخلايا الأخرى بعيدا. استخدام نهج مماثل كما هو الحال في وحدة السابقة.
ملاحظة: جسم الخلية Voronoi هو امتداد شعاعي للنواة بنسبة 25 بكسل مع أي تداخل مع أجسام الخلايا Voronoi المجاورة. - الخروج من وضع الاختبار والتأكد من أن أيا من وحدات تظهر العرض الخاصة بها قبل تشغيل تحليل كامل عن طريق إلغاء كل حرف العين إلى جانب وحدات.
ملاحظة: هذا بشكل ملحوظ يقلل الحاجة إلى موارد الحاسوبية أثناء معالجة خط الأنابيب. - اضغط على "تحليل الصور" لبدء تحليل.
- عند الانتهاء من تحليل وفحص ينتج عن ذلك من صور PNG، فضلا عن ورقة CSV للتأكد من أن تحليل عمل موثوق بها في جميع أنحاء لوحة.
- الفحص دخول
- حساب نموذج التظليل
- انتقل إلى القائمة "ملف"، اختر "استيراد" → "خط أنابيب من ملف ..."، وحدد توفيرد خط أنابيب "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". وعندما سئل عما إذا كان لتحويل خط أنابيب إرث، والإجابة "لا تحويل".
- الذهاب إلى "إخراج" → "عرض إعدادات إخراج" وحدد مجلد الإدخال مع الصور ومجلد الإخراج لنماذج التظليل الناتجة عن ذلك.
- في وحدة (1) "LoadImages"، وضبط اسم "نص على أن هذه الصور لها من القواسم المشتركة" لمطابقة أسماء الصورة.
- تأكد من أن أيا من وحدات تظهر العرض الخاصة بها قبل تشغيل تحليل كامل عن طريق إلغاء كل حرف العين إلى جانب وحدات.
ملاحظة: هذا بشكل ملحوظ يقلل الحاجة إلى موارد الحاسوبية أثناء معالجة خط الأنابيب. - اضغط على "تحليل الصور" لبدء حساب نموذج التظليل.
- تشغيل تحليل الصور
- انتقل إلى القائمة "ملف"، اختر "استيراد" → "خط أنابيب من ملف ..."، وحدد بتقديمإد خط أنابيب "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". وعندما سئل عما إذا كان لتحويل خط أنابيب إرث، والإجابة "لا تحويل".
- الذهاب إلى "إخراج" → "عرض إعدادات إخراج" وحدد مجلد الإدخال مع الصور ومجلد الإخراج لجدول البيانات الناتجة.
- في وحدة (1) "LoadImages"، وضبط اسم "نص على أن هذه الصور لها من القواسم المشتركة" لمطابقة أسماء الصورة.
- في وحدة (2) "LoadSingleImage"، تحميل نماذج التظليل المحسوب وفقا 6.2.1 عن طريق اختيار الموقع وأسماء من نماذج التظليل اثنين.
- في وحدات (4) - (5) "ImageMath"، وضبط المعلمة "اضرب الصورة الأولى" مطابقة عمق بت من الكاميرا المجهر. لمدة 8 و 16 بت الصور تعيين المعلمة إلى "1.0"، لمدة 12 بت الصور تعيين المعلمة إلى "16.0".
- في وحدة (6) "IdentifyPrimaryObjects"، تعيين المعلمة "لوور ملزمة على عتبة "مرتفعة بما يكفي أن نوى الوحيدة هي مجزأة ويتم تجاهل الخلفية.
- لتحديد قيمة جيدة مقابل وحدة (6)، خطوة على حدة وعرض الصورة المدخلة كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2.
- بزر الماوس الأيمن فوق الصورة المدخلة وعرض الرسم البياني.
ملاحظة: ذروة الرسم البياني يشير عادة الخلفية. - بدءا من شدة خلفية زيادة المعلمة حتى يتم التوصل إلى تجزئة جيدة من نوى كما هو معروض في الصورة الانتاج.
ملاحظة: تحديد عتبة فوق خلفية من المهم بالنسبة للمواقع فارغة.
- في وحدة (8) "IdentifyPrimaryObjects"، تعيين المعلمة "السفلى ملزمة على عتبة" عالية بما فيه الكفاية أن البروسيلا ومجزأة فقط ويتم تجاهل الخلفية.
- لتحديد قيمة جيدة مقابل وحدة (8)، خطوة على حدة وعرض الصورة المدخلة كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2.
- بزر الماوس الأيمن فوق الصورة المدخلة وعرض الرسم البياني.
ملاحظة: ذروة الرسم البياني يشير عادة الخلفية. - بدءا من شدة خلفية زيادة المعلمة حتى يتم تحقيق تجزئة جيدة من البروسيلا كما هو معروض في الصورة الانتاج.
ملاحظة: تحديد عتبة فوق خلفية من المهم بالنسبة للمواقع فارغة.
- في وحدة (11) "FilterObjects"، وضبط المعلمة "قيمة الحد الأدنى" حتى يتم تصفية هذه الخلفية والمصنوعات اليدوية بعيدا، ويتم الاحتفاظ فقط المستعمرات البروسيلا.
- لتحديد قيمة جيدة، خطوة على حدة وعرض الصورة الانتاج كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2. نبدأ مع القيمة المحددة في 6.2.2.7 ومتدرج زيادته حتى يتم الاحتفاظ الأشياء البروسيلا فقط.
- الخروج من وضع الاختبار والتأكد من أن أيا من وحدات تظهر العرض الخاصة بها قبل تشغيل تحليل كامل عن طريق uncheCKING كل حرف العين إلى جانب وحدات.
ملاحظة: هذا بشكل ملحوظ يقلل الحاجة إلى موارد الحاسوبية أثناء معالجة خط الأنابيب. - اضغط على "تحليل الصور" لبدء تحليل.
- عند الانتهاء من تحليل وفحص ينتج عن ذلك من صور PNG، فضلا عن ورقة CSV للتأكد من أن تحليل عملت بشكل جيد في جميع أنحاء لوحة.
- حساب نموذج التظليل
- نقطة النهاية الفحص
- افتح صفحة CSV إنشاؤها في الخطوة 6.1.2.12 وحساب في معدل الإصابة بشكل جيد عن طريق قسمة عدد من الخلايا المصابة (CellProfiler قراءات: "Count_InfectedCells") على العدد الكلي للخلايا (CellProfiler قراءات: "CountNuclei"). إذا كان قد تم تصوير مواقع متعددة لكل بئر، وتلخيص لأول مرة جميع المواقع لكل بئر، لبناء عدد لكل بئر من الخلايا المصابة وعدد الإجمالي لكل جيدا من الخلايا.
- أداء Z التهديف تطبيع لمراعاة الاختلافات لوحة إلى لوحة إذا كان يحتوي على لوحات كافية غير ضرب الرناوات siRNAs. نفترض وجود عدد كاف من الرناوات siRNAs غير الكر في لوحة إذا تم فحص مكتبات كاملة.
- الفحص دخول
- افتح صفحة CSV إنشاؤها في الخطوة 6.2.2.10 وحساب في معدل الإصابة بشكل جيد عن طريق قسمة عدد من الخلايا المصابة (CellProfiler قراءات: "Count_InfectedCeLLS ") على العدد الكلي للخلايا (CellProfiler قراءات:" CountNuclei ") إذا كان قد تم تصوير مواقع متعددة لكل بئر، تلخص أولا جميع المواقع لكل بئر، لبناء عدد لكل بئر من الخلايا المصابة ولكل جيدا العدد الكلي للخلايا.
- لتحديد الحمولة الجرثومية من الخلايا المصابة، وتقدير متوسط مساحة من البكتيريا داخل الخلايا في الخلية المصابة المحتلة. تحقيقا لهذه الغاية، تقسيم منطقة متكاملة بجميع البكتيريا داخل الخلايا متداخلة مع الخلايا (CellProfiler قراءات: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") من قبل عدد من الخلايا المصابة في هذا الموقع. لحساب القطع الأثرية، استخدم المتوسط من جميع المواقع من هذا قراءات كما قراءات جيدا.
ملاحظة: إذا تم استخدام هذا الاختبار بمثابة متابعة فحص تحتوي على عدد كبير من الجينات المسؤولة عن الإصابة البروسيلا، لا تنطبق Z درجة التطبيع. بدلا من ذلك، نفذ التطبيع باستخدام الآبار وهمية كمرجع لحساب التباين لوحة إلى لوحة.
7. العدوى التهديف
ملاحظة: الرناوات siRNAs التي يكون لها تأثير كبير على بقاء الخلية يتعين النظر بحذر، لأن هذا يمكن أن تعزز الاكتشافات إيجابية كاذبة. يؤثر على عدد الخلايا غيرت وزارة الداخلية الفعلية ويمكن استهداف الجينات الأساسية لديها آثار عديد المظاهر على إصابة الممرض. في حين استنزاف غير مكتمل من قبل الرناوات siRNAs يسمح لدراسة الجينات الأساسية، ويمكن التحقق من صحة هذه الأهداف عن طريق وسائل بديلة (على سبيل المثال، تدخل الصيدلانية) لتأكيد دورها العوامل المضيفةخلال العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1A مثال على تحليل الصور المستخدمة لتحديد الخلايا المصابة تلقائيا في فحص نقطة النهاية. وقد تم تحديد نوى خلايا هيلا ملطخة دابي، حسبت على النواة المحيطة من عرض 8 بكسل المحيطة النواة، وخلايا الجسم Voronoi بالتبعية للنواة بنسبة 25 بكسل. منذ البكتيريا تتكاثر بشكل رئيسي في الفضاء شبه النووي، وشدة GFP في هذا المجال من الخلية هي قياس أقوى للتمييز بين الخلايا المصابة وغير المصابة. في بعض الحالات، تم العثور على البكتيريا على التكاثر خارج شبه نواة أو تراكب إلى حد كبير مع النواة. لذلك، تعتبر هذه كائنين إضافية أيضا للتعرف على الخلايا المصابة. أجريت تجزئة وكذلك قياسات كثافة GFP مع تحليل صورة البرنامج CellProfiler 2.
البروسيلا
ويوضح الشكل 2A طتحليل بركه تستخدم لتحديد الخلايا المصابة وقياس الحمولة الجرثومية داخل الخلايا في مقايسة دخول. وعلى النقيض من فحص نقطة النهاية، يستخدم فحص دخول تجزئة البكتيرية وخلايا الجسم Voronoi وجوه الخلوي. كان يستخدم فقط إشارة GFP من البروسيلا بين الخلايا لقطاع الممرض في هذا الخط تحليل الصور. وقد تم تحديد البكتيريا داخل الخلايا من حجم الحد الأدنى من 2 بكسل وكثافة GFP التي تتجاوز كثافة GFP خلفية قاتمة من البكتيريا خارج الخلية. واعتبر أن الخلية المصابة إذا تداخلت واحد على الأقل كائن بكتيري الخلايا مع خلايا الجسم Voronoi لها. وعلاوة على ذلك، تم تقدير الحمل البكتيري عن طريق حساب متوسط مساحة الخلايا المصابة التي يتم تغطيتها من قبل البكتيريا داخل الخلايا.
أما بالنسبة للفحص نقطة النهاية، وأظهر استنزاف ARPC3 انخفاضا في الإصابة البروسيلا في فحص دخول بالمقارنة مع الخلايا تعامل مع يخدعالمحول المتعدد العادي سيرنا (الشكل 2B). وأكد الكمي من معدل الإصابة أن عدد الخلايا المصابة (الشكل 2C) وكذلك عدد من البكتيريا داخل الخلايا في الخلايا المصابة (الشكل 2D) انخفض بنسبة استنزاف ARPC3.
الشكل 1: تحليل خلايا هيلا المصابين ب المجهضة معربا عن GFP في فحص نقطة النهاية (A) نقطة النهاية مقايسة: صورة الإسفار تظهر مثال على فحص نقطة النهاية (أخضر = B. المجهضة معربا عن GFP والأزرق = نوى ملطخة دابي، شريط مقياس = 50 ميكرومتر). GFP معربا عن B. سمح المجهضة لدخول خلايا هيلا لمدة 4 ساعة تليها قتل البكتيريا خارج الخلية التي كتبها جم. مزيد من الحضانة لمدة 40 ساعة البكتيريا السماح لتكرار داخل خلايا هيلا. تحليل سياسي الآلي صورة الصورة: تم استخدام خط أنابيب CellProfiler إلى نوى قطاع دابي الملون تليها حساب شبه النواة (غير المتداخلة حلقة 8 بكسل المحيطة النواة) وخلايا الجسم Voronoi (غير المتداخلة تمديد شعاعي للنواة بنسبة 25 بكسل)، كل من هو مبين في الحمراء. واعتبر أن الخلية المصابة إذا تجاوزت كثافة GFP متكاملة في مقصورة الخلوية واحد على الأقل (نواة، شبه النواة، Voronoi خلايا الجسم) عتبة المقابلة. (ب) صور الممثل خلايا هيلا المصابين ب المجهضة معربا عن GFP 44 ساعة بعد الإصابة. إما transfected الخلايا مع تدافعت (عدم استهداف) تحكم سيرنا أو سيرنا استهداف ARPC3. شريط النطاق = 50 ميكرون. (C) الكمي لإصابة خلايا هيلا المنضب لARPC3. يتم تمثيل البيانات في شريط الرسوم البيانية (شريط = متوسط، Z يسجل التطبيع، أشرطة الخطأ = الخطأ المعياري للمتوسط. *** ع <0.001، مان ويتني اختبار، ن = 7).وفاق / ftp_upload / 54263 / 54263fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكمي لإصابة خلايا هيلا ب. . المجهضة معربا عن TetR-GFP في فحص دخول (أ) فحص الاشتراك: صورة الإسفار تبين مثال على دخول الاختبار (أصفر = الخلايا B. المجهضة تظهر عن dsRed وإشارة GFP، الأحمر = خارج الخلية ب المجهضة تظهر إشارة عن dsRed والأزرق = نوى ملطخة دابي، مقياس بار = 50 ميكرون). ب. سمح المجهضة معربا عن dsRed وTetR-GFP لدخول خلايا هيلا لمدة 4 ساعة تليها قتل البكتيريا خارج الخلية وتحريض في وقت واحد GFP في البكتيريا داخل الخلايا مع ATC لمدة 4 ساعة تحليل الصور الآلي: تم استخدام خط أنابيب CellProfiler للكشف عن دابينوى الملون تليها حساب من خلايا الجسم Voronoi بالتالي شعاعي للنواة بنسبة 25 بكسل (كما هو موضح باللون الأبيض). إن تقسيم البكتيريا بناء على إشارة GFP. واعتبر أن الخلية المصابة إذا تداخلت خلايا الجسم Voronoi مع كائن بكتيري مجزأة واحد على الأقل من حجم كاف وكثافة GFP. ويتضح الحمل البكتيري في الخلايا المصابة من خلال تكامل المنطقة من كافة الكائنات البكتيرية مجزأة مع جسم الخلية Voronoi لها (وحدة = بكسل، نان = يتم احتساب أي رقم في الخلايا غير المصابة). صور (ب) مثال توضح انخفاضا من بين الخلايا B. المجهضة (كما هو موضح من قبل عدد من البكتيريا الصفراء) في الخلايا transfected مع سيرنا استهداف ARPC3 مقارنة للسيطرة على الخلايا المعالجة مع سيرنا سارعت. يتم تقليل عدد الخلايا المصابة وكذلك متوسط عدد البكتيريا داخل الخلايا في الخلايا المصابة على ARPC3 نهدم. (C) الكمي من معدل الإصابة في خلايا هيلا المنضبلARPC3. يتم تمثيل البيانات في شريط الرسوم البيانية (شريط = متوسط، التطبيع وهمية، أشرطة الخطأ = الخطأ المعياري للمتوسط؛ * ف <0.05، مان ويتني اختبار، ن = 4). (D) الكمي الحمولة الجرثومية من خلايا هيلا المصابين المنضب لARPC3. يتم تمثيل البيانات والرسوم البيانية (شريط = متوسط، التطبيع وهمية، أشرطة الخطأ = الخطأ المعياري للمتوسط؛ * ف <0.05، مان ويتني اختبار، ن = 4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
التكميلي ملف 1: خط أنابيب CP2 - تصحيح التظليل الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: خط أنابيب CP2- نقطة النهاية الفحص. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: CP2 خط الأنابيب - بدء فحص الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 4: وصف وحدات الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10X objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25x36 |
References
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
- Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
- Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
- Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
- Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
- Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
- Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
- Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
- Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
- Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
- Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
- von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
