Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Mikroskopi assays for high-throughput screening af Host faktorer involveret i Published: August 5, 2016 doi: 10.3791/54263
Automatic Translation
*1, *1, *1,4, *1,3, 2, 2, 1
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH
* These authors contributed equally

Abstract

Brucella arter er fakultative intracellulære patogener, der inficerer dyr som deres naturlige værter. Transmission til mennesker er mest almindeligt forårsaget af direkte kontakt med smittede dyr eller ved indtagelse af forurenet mad og kan føre til alvorlige kroniske infektioner.

Brucella kan invadere professionelle og ikke-professionelle fagocytceller og replikerer inden endoplasmatisk reticulum (ER)-afledte vakuoler. Værten faktorer, der kræves for Brucella træde i værtsceller, undgåelse af lysosomal nedbrydning, og replikation i ER-lignende rum forbliver stort set ukendt. Her beskriver vi to assays til at identificere værten faktorer involveret i Brucella post og replikation i HeLa-celler. Protokollerne beskriver anvendelsen af ​​RNA-interferens, mens alternative screeningsmetoder kunne anvendes. De assays er baseret på påvisning af fluorescensmærkede bakterier i fluorescensmærkede værtsceller ved anvendelse af automatiseredewide-field mikroskopi. De fluorescerende billeder analyseres ved anvendelse af en standardiseret billedanalyse rørledningen i CellProfiler som tillader enkelt cellebaseret infektion scoring.

I endpoint assay intracellulær replikation målt to dage efter infektion. Dette giver bakterier til trafik til deres replikative niche, hvor spredningen påbegyndes omkring 12 timer efter bakteriel post. Brucella som med succes har etableret en intracellulær niche vil således kraftigt har spredt inde værtsceller. Da intracellulære bakterier i høj grad vil overtal individuelle ekstracellulære eller intracellulære ikke-replikative bakterier, kan bruges en stamme konstitutivt udtrykker GFP. Den stærke GFP signal er derefter anvendt til at identificere inficerede celler.

I modsætning hertil for posten assayet er det vigtigt at skelne mellem intracellulære og ekstracellulære bakterier. Her er en stamme, der koder for en tetracyklin-inducerbare GFP anvendes. Induktionaf GFP med samtidig inaktivering af ekstracellulære bakterier ved gentamicin muliggør differentiering mellem intracellulære og ekstracellulære bakterier baseret på GFP signal, med kun intracellulære bakterier er i stand til at udtrykke GFP. Dette tillader den robuste detektion af enkelte intracellulære bakterier før intracellulær spredning påbegyndes.

Introduction

Brucella arter er gramnegative, fakultative intracellulære patogener, der tilhører klassen af α-Proteobacteria. De forårsager aborter og infertilitet i deres naturlige værter, såsom kvæg, geder, får eller resulterer i alvorlige økonomiske tab i endemiske områder. Brucellose er en af de vigtigste zoonotiske sygdomme på verdensplan forårsager over en halv million nye humane infektioner årligt 1. Transmission til menneske er mest almindeligt forårsaget af direkte kontakt med smittede dyr eller ved indtagelse af forurenede fødevarer, såsom upasteuriseret mælk. Symptomer på febril sygdom er uspecifikke, hvilket skaber vanskeligheder ved diagnosticering af brucellose. Hvis ubehandlet, kan patienterne udvikle en kronisk infektion med mere alvorlige symptomer som gigt, endocarditis, og neuropati 2.

På det cellulære niveau Brucella er i stand til at invadere fagocytiske og ikke-fagocytiske celler og replikerer inden en intracellulærrum kendt som Brucella holdige vacuolen (BCV). Internalisering af bakterier kræver aktincytoskelettet omlejringer ved Rac, Rho, og direkte aktivering af Cdc42 3. Inde i eukaryot værtscelle, den BCV trafikker langs endocytiske proces og trods interaktionen med lysosomer, bakterier formår at undgå nedbrydning 4. Syrning af BCV af vesikulær ATPase er påkrævet for at inducere ekspressionen af det bakterielle type IV secerneringssystem (T4SS) 5. Det menes, at bakterielle effektorer udskilles af T4SS er afgørende for Brucella at etablere sin replikative niche, da sletning af T4SS 6 eller hæmning af vesikulær ATPase føre til fejl i etableringen af den intracellulære niche 7. Bakterier ikke replikere i den fase af menneskehandel, indtil de nå en ER-afledt vakuolær rum 8. Når intracellulær spredning forekommer, bliver BCV findes i close association med ER markører, såsom calnexin og glucose-6-phosphatase 6.

De molekylære mekanismer, ved hvilke Brucella trænger ind i celler, undgår lysosomal nedbrydning, og endelig replikerer i en ER-lignende rum forbliver stort set ukendt. Host faktorer involveret i forskellige trin på infektion er primært blevet identificeret af målrettede tilgange eller en lille målestok lille interfererende RNA (siRNA) skærm udført i Drosophila celler 9. Disse har kastet lys over det bidrag, de enkelte vært faktorer under Brucella infektion, men vi er stadig langt fra en omfattende forståelse af hele processen.

Her er protokoller, der tillader identifikation af humane vært faktorer ved hjælp af store RNA-interferens (RNAi) screening i kombination med automatiserede wide-field fluorescens mikroskopi og automatiseret billedanalyse præsenteret. Reverse siRNA transfektion af HeLa-celler udføres som described tidligere 10,11 med mindre modifikationer. Slutpunktet assay dækker en stor del af Brucella intracellulære livscyklus undtagen egress og infektion af naboceller. For yderligere at karakterisere de hits identificeret i endpoint analysen, er en modificeret protokol til at identificere faktorer involveret i tidlige trin af infektionen anvendes.

En Brucella abortus-stamme, som konstitutivt udtrykker GFP anvendes til endpoint assay, hvor bakterier får lov til at inficere celler i to dage. I løbet af denne tid, bakterier ind celler, trafik til ER-afledte replikative niche, og replikere i den peri-nuklear rum. De høje niveauer af GFP signal kan derefter anvendes til pålideligt at detektere individuelle celler, der indeholder replikerende bakterier.

At studere Brucella indgang i en high-throughput assay, er det vigtigt at kunne skelne mellem intracellulære og ekstracellulære bakterier. Fremgangsmåden præsenteres her circumvents differential antistoffarvning af intracellulære og ekstracellulære bakterier. Den er baseret på en Brucella stamme, der udtrykker en tetracyklin-inducerbar GFP i kombination med konstitutiv ekspression af dsRed. Tilstedeværelsen af ​​en konstitutiv dsRed markør muliggør identifikation af alle bakterier, der er til stede i prøven. GFP-ekspression induceres ved tilsætning af den ikke-toksiske tetracyclinanalog anhydrotetracycline (ATC) samtidig med inaktivering af ekstracellulære bakterier ved gentamicin (Gm). Mens celleimpermeable antibiotikum Gm dræber ekstracellulære bakterier, kan ATC indtaste værtscellen og inducere GFP-ekspression selektivt i intracellulære bakterier. Denne dobbelte reporter tillader den robuste adskillelse af enkelte intracellulære bakterier (GFP og dsRed signal) fra ekstracellulære bakterier (kun dsRed signal) ved hjælp wide-field mikroskopi. For at nå detekterbar GFP-ekspression ved intracellulær Brucella har vi fundet, at 4 timer af induktion af ATC resulterer i et pålideligtstand signal. Lignende ordninger for indslusning til selektivt udtrykker GFP i intracellulære bakterier er tidligere blevet anvendt til at undersøge intracellulær Shigella 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Alt arbejde med levende Brucella abortus stammer skal udføres inde i en biosikkerhed niveau 3 (BSL3) laboratorium i betragtning af alle nødvendige regler og sikkerhedsforanstaltninger.

1. Fremstilling af Screening Plader og dyrkning af bakterier og celler

  1. Fremstilling af Brucella abortus starterkulturer
    1. Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) fra -80 ° C mælk lager på en tryptisk Agar (TSA) plade indeholdende 50 ug / ml kanamycin (TSA / Km). Inkuber pladen i 3-4 dage ved 37 ° C. Brug stammen Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 til endpoint analysen og stamme Brucella abortus pAC042.08 (apht :: dsRed, tetO :: tetR-GFP) for posten analysen.
      Bemærk: Den glatte lipopolysaccharid (LPS) af Brucella abortus er et vigtigt virulensdeterminant men ru mutanter kan forekomme ved relativt høje frekvenser 14. We således anbefale teste status af kulturen stammen inden start med dette eksperiment.
    2. Restreak bakterier på fire TSA / Km plader dækker hele pladen og inkuberes i 2-3 dage ved 37 ° C.
    3. Ved hjælp af en engangs plastik loop, overførsel og resuspender bakterier fra TSA / Km-plader i 10 ml 10% autoklaveret skummetmælk. Sørg for, at bakterierne er godt resuspenderes at sikre ensartede bakterielle koncentrationer i alle starterkulturer.
    4. Alikvote 250 pi af den bakterielle suspension i 2 ml skruelåg rør og fryse ved -80 ° C.
    5. Tø en portion af starterkulturen og overføre 25 pi, 50 pl, og 100 pi af den bakterielle starterkultur at separere 250 ml skruelåg flasker med 50 ml tryptisk Broth (TSB) indeholdende 50 ug / ml kanamycin (TSB / Km) . Forsegl flasker med Parafilm.
    6. Inkuber flaskerne natten over på en orbitalryster ved 100 rpm og 37 ° C.
    7. Mål den optiske densitet ved 600 nm (OD 600) for at bestemme mængden af starterkultur kræves for at nå en OD 600 = 0,8-1,1 efter dyrkning natten over.
  2. Fremstilling af Hela-celler
    1. Grow HeLa-celler i Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (DMEM / 10% FCS) i en 37 ° C fugtig inkubator med 5% CO 2. Dyrk cellerne til 80% konfluens.
  3. Forbered Screeningen Plader med siRNA'er.
    1. Fortynd siRNA'er i RNase-frit vand til en slutkoncentration på 0,32 uM. Overfør 5 pl / brønd til sorte klar-brønds fladbundede 384-brønds plader.
      1. Brug kolonne 1, 2, 23 og 24 for standard kontroller. For negative kontroller, bruge ikke-målretning siRNA (krypteret) og mock brønde uden siRNA'er (transfektion kun reagens). For transfektion kontroller anvendes en siRNA, der inducerer celledød (KIF11), samt positive kontroller af kendte vært faktorer involveret i Brucella-infektion (f.eks ARPC3,en komponent af ARP2 / 3-kompleks er involveret i actin-polymerisation). Overførsel til de resterende brønde kommercielt tilgængelige siRNA biblioteker eller brugerdefinerede siRNA'er.
      2. Seal plader med aftrækkelige aluminium folie. Opbevar plader ved -20 ° C.
        Bemærk: Plader kan lagres ved -20 ° C i mindst 6 måneder og op til år afhængig af producentens anbefalinger.

2. Reverse siRNA transfektion

  1. Tø en sort plade med 384 brønde ved centrifugering ved 300 xg i 20 minutter ved stuetemperatur.
    Bemærk: Dette vil bringe al væsken som kan klæbe til låget eller siden af ​​brøndene ned.
  2. Forbered transfektion medium ved fortynding af transfektionsreagens 1: 200 i DMEM uden FCS ved stuetemperatur. Forbered transfektion medium ikke længere end 20 min før anvendelse. bland omhyggeligt opløsningen før brug.
  3. Tilsættes 25 pi transfektion medium til hver brønd med en reagens dispenserog blandes opløsningerne ved at bevæge pladen frem og tilbage.
  4. Inkubér pladen i 1 time ved stuetemperatur for at tillade siRNA / transfektionsreagens kompleksdannelse.
  5. I mellemtiden forberede HeLa-celler ved vask af sub-konfluente celler af en 75 cm2 kolbe én gang med 2,5 ml 0,05% trypsin-EDTA i PBS (trypsin).
  6. Tilføj 1,5 ml frisk trypsin og overføre kolben til 37 ° C i 2-3 min, indtil cellerne runde op.
  7. Resuspender cellerne i 10 ml forvarmet DMEM / 16% FCS.
  8. Tæl celler under anvendelse af en automatiseret celletæller og forberede en cellesuspension på 10.000 celler / ml i DMEM / 16% FCS.
  9. Der tilsættes 50 pi cellesuspension til hver brønd med et reagens dispenser resulterer i 500 celler / brønd.
  10. Flytte pladen frem og tilbage for at opnå en jævn fordeling af cellerne. Efterlad pladen ved stuetemperatur i 5-10 min at tillade cellerne at slå sig ned.
  11. Forsegl pladen med Parafilm og inkuber det i 72 timer på en forvarmet aluminiumplade i en 37 ° C fugtig inkubator med 5% CO2.
    Bemærk: Den forvarmet aluminiumsplade tillader lige fordeling temperatur i hele 384-brønds plade.

3. Infektion og Fiksering

  1. En dag før infektion, pode fastsatte beløb i 1.1.7 i B. abortus starterkultur i 50 ml TSB / Km-medium i en 250 ml skruelåg flaske. Forsegle flasken med Parafilm og vokse bakterier natten over ved 37 ° C og 100 rpm på en orbitalryster til OD600 = 0,8-1,1.
  2. Måle OD600 på bakteriekulturen og forberede infektionen medium ved fortynding af bakteriekulturen i DMEM / 10% FCS at opnå den ønskede infektionsmultiplicitet (MOI).
    Bemærk: For at få en infektion på 5-10% i HeLa-celler, er en MOI på 10.000 anvendes. En MOI titreringskurve bør udføres for hver celletype at opnå optimale smittespredningen.
  3. Udveksle transfektion medium af 384-brønds plademed 50 pi af infektionen medium ved anvendelse af en automatiseret pladevasker.
  4. Centrifugeres 384-brønds plade ved 400 xg og 4 ° C i 20 min.
    Bemærk: Dette hjælper til at synkronisere infektionsprocessen.
  5. Forsegle skiltet med Parafilm og inkuber det på en forvarmet aluminiumplade i et 37 ° C fugtig inkubator med 5% CO2 i 4 timer.
  6. Vask cellerne med DMEM / 10% FCS indeholdende 100 ug / ml Gm at inaktivere ekstracellulære bakterier ved hjælp af automatisk pladevasker (brug 200 pl / brønd overløb vask).
    Bemærk: Under et overløb vask, automatiseret pladevasker samtidig dispenserer og aspirerer medium.
  7. For posten assay vaske celler en gang med DMEM / 10% FCS indeholdende 100 ug / ml GM og 100 ng / ml ATC hjælp af automatisk pladevasker (brug 200 pl / brønd overløb vask).
  8. Forsegl pladen med Parafilm og returnere det til en forvarmet aluminium plade i 37 ° C fugtig inkubator med 5% CO2 i en anden40 timer eller 4 timer, for den effektparameter assay og posten analysen hhv.
  9. Til fiksering vaskes brøndene med PBS ved hjælp af automatisk pladevasker (brug 200 pl / brønd overløb vask).
  10. Udveksling PBS med 50 pi 3,7% paraformaldehyd i 0,2 M HEPES ved pH 7,4 (PFA) ved anvendelse af automatiseret pladevasker.
    Bemærk: Advarsel: PFA er giftig ved indånding, ved hudkontakt og ved indtagelse.
  11. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur.
  12. Udskift fiksering medium med 50 pi PBS ved hjælp af den automatiserede pladevasker. Bemærk: Prøverne er nu klar til at blive taget ud fra BSL3 hvis nødvendigt.
    Advarsel: Fjernelse af enhver prøve fra en BSL3 facilitet er underlagt risikovurdering og validering af proceduren og afhænger af de gældende regler for biosikkerhed.

4. Farvning

  1. Vask cellerne to gange med 50 pi PBS.
  2. Permeabilisere celler i 50 pi 0,1% Triton-X-100 i PBS i 10 min.
  3. Waske celler tre gange med PBS. Tilsæt 20 pi PBS indeholdende 1 pg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
  4. Vask cellerne tre gange i PBS og beskytte farvning mod lys med aluminiumsfolie.

5. Imaging

  1. Opsæt automatiserede wide-field mikroskop for billedoptagelse.
    Bemærk: Indstillingerne for en Molecular Device ImageXpress mikroskopet med MetaXpress software er beskrevet nedenfor. Alternative 2D wide-field mikroskopi enheder med passende hardware specifikationer og imaging software kan bruges (se tabel af materiale / udstyr for detaljer).
    1. Vælg 10X objektiv, kamera binning = 1, gevinst = 1.
    2. Vælg pladeformat svarende til 384-brønds plade.
    3. Anskaf 9 steder pr brønd.
    4. Brug "Aktiver laserbaseret fokus" og "Fokus på plade og godt bund".
    5. Indstil "First godt" som den første godt forfinde prøven og "Alle steder" for webstedet autofokus.
    6. Brug DAPI kanal til manuelt at indstille Z-Offset for fokus.
    7. Vælg manuelt Z-Offset fra DAPI for alle andre kanaler.
    8. Manuelt korrigere eksponeringen tid for alle kanaler for at sikre et bredt dynamisk område med lav overeksponering.
      1. Anskaf et billede af en repræsentativ websted ved hjælp funktionen auto-eksponering. Brug denne eksponering tid til billedet 3-5 steder i hele pladen og justere eksponeringstiden manuelt, indtil de lyseste pixel nå ~ 80% af den maksimale lysstyrke i alle websteder.
    9. Billede fuld plade ved hjælp DAPI og GFP kanaler for endpoint assay. For posten analysen vælge RFP kanal ud.

6. Automatiseret Image Analysis

Bemærk: CellProfiler 2 15 er ansat som billedanalyse software til segment cellulære og bakterielle objekter og udføre automatiseret measurements inden de identificerede objekter. Softwaren giver billedanalyse algoritmer i enkelte moduler, der kan kombineres til en rørledning, der vil udføre modulerne fortløbende på alle billeder, til automatisk at udføre en bestemt billedanalyse opgave. For at følge protokollen, installere CellProfiler 2.1.1 eller en nyere version. Derefter indlæse forudsat pipeline og følge nedenstående instruktioner for at justere de nødvendige parametre inden modulerne. En beskrivelse af de enkelte moduler i alle rørledninger kan findes i Supplemental Files.

Bemærk: To separate rørledninger anvendes til hvert assay. Den første rørledning beregner en skygge model, som bruges af den anden rørledning til at korrigere billeder inden analyse. Shading korrektion påføres billederne for at reducere virkningerne af en inhomogen lysbane fra mikroskopet. Beregning af skygge model i den første rørledning er en langvarig proces, men resultaterne vil være af højere nøjagtighed.

    <li> Endpoint Assay
    1. Beregn skygge model
      1. Gå til menuen "Filer", vælg "Importer" → "Pipeline fra fil ...", og vælg den medfølgende pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Adspurgt, om at konvertere arven pipeline, svare "Må ikke konvertere".
      2. Gå til "Output" → "Vis output indstillinger" og vælg en indgang mappe med billeder og et output mappe til de resulterende skygge modeller.
      3. På modul (1) "LoadImages" justeres navnet "Tekst at disse billeder har til fælles" for at matche billednavne.
      4. Sørg for, at ingen af ​​modulerne vise deres skærm, inden du kører den fulde analyse ved at fjerne markeringen alle øjet symboler ved siden af ​​modulerne. Bemærk: Denne signifikant nedsætter nødvendige it-ressourcer under behandling rørledningen.
      5. Tryk på "Analyser Images" for at starte beregningen af ​​skygge model.
      6. Kør Billedanalyse
        1. Gå til menuen "Filer", vælg "Importer" → "Pipeline fra fil ...", og vælg den medfølgende pipeline "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Adspurgt, om at konvertere arven pipeline, svare "Må ikke konvertere".
        2. Gå til "Output" → "Vis output indstillinger" og vælg en indgang mappe med billeder og et output mappe til den resulterende regneark.
        3. I modul (1) "LoadImages" justeres navnet "Tekst at disse billeder har til fælles" for at matche billednavne.
        4. I modul (2) "LoadSingleImage", indlæse skygge modeller beregnet under 6.1.1 ved at vælge placering og filnavne for de to skygge modeller.
        5. I moduler (4) - (5) "ImageMath" justeres parameteren "Multiplicer det første billede af" tilsvarende bit dybde af mikroskopet kameraet. For 8 og 16 bitbilleder indstille parameteren til "1.0", 12 bit billeder indstille parameteren til "16,0".
        6. I modul (9) "ImageMath" justere parameteren "Multiplicer det andet billede ved" til en værdi (start med 0,25), der vil undertrykke Brucella signal i DAPI-farvning uden at undertrykke kernerne.
          1. Klik på "Start Test Mode", så aktivere pause symbol og display funktion for modul (9) ved at klikke på de tilsvarende ikoner af modulet.
            Bemærk: pausesymbolet vises i gult, mens øjet symbol vil vise en åben øje, hvis aktiveret.
          2. Klik på "Kør" for at køre analysen op til modul (9) med den aktive pause symbol. For at teste værdierne for modulet, skal du trykke på "Step".
          3. Højreklik på nyåbnede billede og sæt "Image kontrast" til "Log normaliseret". Gentagne gange gå tilbage til modul (9), justere parameteren "Multiplicer det andet billede af", og trin i løbet af than modul igen, indtil Brucella-signalet er fuldt undertrykt, mens samtidig sorte områder, som angiver over-subtraktion minimeres i resultatet billedet.
        7. I modul (10) "IdentifyPrimaryObjects", skal du indstille parameteren "Lavere bundet på tærsklen" høj nok (start med nul), så kerner segmenteres og baggrund ignoreres.
          1. For at identificere en god værdi for modul (10), trin over modulet og vise input billedet som forklaret i trin 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2.
          2. Højreklik på input billedet og vise histogrammet.
            Bemærk: Toppen af ​​histogrammet typisk indikerer baggrund.
          3. Begyndende fra baggrundsintensitet øge parameter indtil en god segmentering af kerner er opnået som vist i udgangsbilledet.
            Bemærk: Indstilling af tærsklen højere end baggrund intensitet er især vigtigt for tomme websteder.
        8. I modul (15)4; FilterObjects "justeres parameteren" Minimum value ", således at celler med klart synlige Brucella i kernen holdes, og alle andre er filtreret væk I dette trin ignorere Brucella uden for kernen..
          1. For at identificere en god værdi, trin over modulet og vise output billedet som forklaret i trin 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2. Start fra nul, som identificerer alle celler som inficerede, og øge værdien af små trin, indtil kun celler med klart synlige Brucella på kernen holdes.
        9. I modul (16) "FilterObjects", justere parameteren "Minimum værdi", så celler med klart synlige Brucella ved de perinucleus holdes, og alle andre celler er filtreret væk. Brug en lignende fremgangsmåde som i det foregående modul.
        10. I modul (17) "FilterObjects", justere parameteren "Minimum værdi", så celler med klart synlige Brucella ved Voronoi cellelegeme holdes, og alle andre celler er filtreret væk. Brug en lignende fremgangsmåde som i det foregående modul.
          Bemærk: Det voronoi celle krop er en radial udvidelse af kernen med 25 pixels uden overlapning med nabolandet Voronoï celle organer.
        11. Afslut testtilstand og sørg for, at ingen af ​​modulerne vise deres skærm, inden du kører den fulde analyse ved at fjerne markeringen alle øjet symboler ved siden af ​​modulerne.
          Bemærk: Denne signifikant nedsætter nødvendige it-ressourcer under behandling rørledningen.
        12. Tryk på "Analyser billeder" for at starte analysen.
        13. Når analysen er færdig, inspicere de resulterende PNG-billeder samt CSV ark til at sikre, at analysen arbejdede pålideligt gennem hele pladen.
    2. Indrejse Assay
      1. Beregn skygge model
        1. Gå til menuen "Filer", vælg "Importer" → "Pipeline fra fil ...", og vælg den giverd pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Adspurgt, om at konvertere arven pipeline, svare "Må ikke konvertere".
        2. Gå til "Output" → "Vis output indstillinger" og vælg en indgang mappe med billeder og et output mappe til de resulterende skygge modeller.
        3. I modul (1) "LoadImages" justeres navnet "Tekst at disse billeder har til fælles" for at matche billednavne.
        4. Sørg for, at ingen af ​​modulerne vise deres skærm, inden du kører den fulde analyse ved at fjerne markeringen alle øjet symboler ved siden af ​​modulerne.
          Bemærk: Denne signifikant nedsætter nødvendige it-ressourcer under behandling rørledningen.
        5. Tryk på "Analyser Images" for at starte beregningen af ​​skygge model.
      2. Kør Billedanalyse
        1. Gå til menuen "Filer", vælg "Importer" → "Pipeline fra fil ...", og vælg provided pipeline "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Adspurgt, om at konvertere arven pipeline, svare "Må ikke konvertere".
        2. Gå til "Output" → "Vis output indstillinger" og vælg en indgang mappe med billeder og et output mappe til den resulterende regneark.
        3. I modul (1) "LoadImages" justeres navnet "Tekst at disse billeder har til fælles" for at matche billednavne.
        4. I modul (2) "LoadSingleImage", indlæse skygge modeller beregnet under 6.2.1 ved at vælge placering og filnavne for de to skygge modeller.
        5. I moduler (4) - (5) "ImageMath" justeres parameteren "Multiplicer det første billede af" tilsvarende bit dybde af mikroskopet kameraet. For 8 og 16 bit billeder indstille parameteren til "1.0", 12 bit billeder indstille parameteren til "16,0".
        6. I modul (6) "IdentifyPrimaryObjects", skal du indstille parameteren "Lower bundet på tærsklen "høj nok, at kun kerner segmenteres og baggrund ignoreres.
          1. For at identificere en god værdi for modul (6), trin over modulet og vise input billedet som forklaret i trin 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2.
          2. Højreklik på input billedet og vise histogrammet.
            Bemærk: Toppen af ​​histogrammet typisk indikerer baggrund.
          3. Begyndende fra baggrundsintensitet øge parameter indtil en god segmentering af kerner er opnået som vist i udgangsbilledet.
            Bemærk: Indstilling af tærskel baggrunden er vigtig for tomme websteder.
        7. I modul (8) "IdentifyPrimaryObjects", skal du indstille parameteren "Lavere bundet på tærsklen" høj nok til, at kun Brucella segmenteres og baggrund ignoreres.
          1. For at identificere en god værdi for modul (8), trin over modulet og vise input billedet som forklaret i trin 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2.
          2. Højreklik på input billedet og vise histogrammet.
            Bemærk: Toppen af ​​histogrammet typisk indikerer baggrund.
          3. Begyndende fra baggrundsintensitet forøge parameter indtil god segmentering af Brucella som vist i udgangsbilledet er opnået.
            Bemærk: Indstilling af tærskel baggrunden er vigtig for tomme websteder.
        8. I modul (11) "FilterObjects", justere parameteren "Minimum værdi", så baggrund og artefakter filtreres bort, og kun Brucella kolonier holdes.
          1. For at identificere en god værdi, trin over modulet og vise output billedet som forklaret i trin 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2. Start med den valgte i 6.2.2.7 og trinvis værdi øge den indtil der kun Brucella objekter holdes.
        9. Afslut testtilstand og sørg for, at ingen af ​​modulerne vise deres skærm, inden du kører den fulde analyse af unchecking alle øjet symboler ud for modulerne.
          Bemærk: Denne signifikant nedsætter nødvendige it-ressourcer under behandling rørledningen.
        10. Tryk på "Analyser billeder" for at starte analysen.
        11. Når analysen er færdig, inspicere de resulterende PNG billeder samt CSV ark for at sikre, at analysen arbejdede godt hele pladen.

    7. Infektion Scoring

    Bemærk: siRNAs, som har en betydelig indvirkning på cellelevedygtighed skal overvejes med forsigtighed, da det kan fremme falske positive opdagelser. En ændret celletal påvirker selve MOI og målretning af essentielle gener kan have pleiotrope virkninger på patogen infektion. Mens den ufuldstændige udtømning af siRNA'er giver mulighed for undersøgelse af vigtige gener har sådanne mål, der skal valideres af alternative metoder (fx farmaceutiske interferens) at underbygge deres rolle som vært faktorerunder infektion.

    1. Slutpunktsprøve
      1. Åbn CSV ark genereret i trin 6.1.2.12 og beregne en per brønd infektion sats ved at dividere antallet af inficerede celler (CellProfiler udlæsning: "Count_InfectedCells") med det samlede antal celler (CellProfiler udlæsning: "CountNuclei"). Hvis flere steder pr brønd er blevet afbildet, først opsummere alle steder til hver brønd, for at opbygge en per-brønd antal inficerede celler og en per-brønd totale antal celler.
      2. Udfør Z scoring normalisering at tage højde for plade-til-plade-variationer, hvis pladerne indeholder tilstrækkelige ikke-hit siRNA'er. Antag et tilstrækkeligt antal ikke-hit siRNA'er per plade, hvis fulde biblioteker screenes.
        ligning 1
    2. Indrejse Assay
      1. Åbn CSV ark genereret i trin 6.2.2.10 og beregne en per brønd infektion sats ved at dividere antallet af inficerede celler (CellProfiler udlæsning: "Count_InfectedCeLLS ") med det samlede antal celler (CellProfiler udlæsning:". CountNuclei ") Hvis flere steder pr brønd er blevet afbildet, først opsummere alle steder til hver brønd, for at opbygge en per-brønd antal inficerede celler og en per-brønd totale antal celler.
      2. For at kvantificere den bakterielle belastning af inficerede celler, anslås det gennemsnitlige areal besat af intracellulære bakterier per inficeret celle. Til dette formål opdele integrerede areal af alle intracellulære bakterier overlappende med celler (CellProfiler udlæsning: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") med antallet af inficerede celler i dette site. For at tage højde for artefakter, bruge medianen af ​​alle steder i denne udlæsning som brønden udlæsning.
        Bemærk: Hvis denne analyse som en opfølgning assay indeholder et stort antal gener involveret i Brucella infektion, gælder ikke Z-score normalisering. I stedet udføre normalisering under anvendelse mock brønde som reference at tage højde for plade-til-plade variation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A viser et eksempel på billedanalyse anvendes til automatisk at identificere inficerede celler i endpoint assay. Kerner af HeLa-celler farvet med DAPI blev identificeret, blev et peri-kerne af 8 pixels bredde omgiver kernen, og en voronoi cellelegeme ved udvidelse af kernen med 25 pixels beregnes. Da bakterier hovedsagelig prolifererer i peri-nuklear rum, GFP intensitet i dette område af cellen er den mest robuste måling til at skelne mellem inficerede og ikke-inficerede celler. I nogle tilfælde er bakterier fundet at proliferere uden for peri-kernen eller overlay i vid udstrækning med kernen. Derfor blev disse to yderligere objekter også i betragtning til identificering af inficerede celler. Segmentering samt målinger GFP intensitet blev udført med billedanalysesoftware CellProfiler 2.

Brucella 3. , Udtømning af actin remodeling komponenter er således en egnet positiv kontrol for siRNA screening. Vi har fundet, at siRNA-medieret depletion af ARP2 / 3 komplekse komponenter, der er involveret i actin-polymerisation, kraftigt inhiberer Brucella infektion af HeLa-celler (upublicerede data). Således blev knockdown af ARPC3 anvendt som en positiv kontrol. Som det ses i figur 1B, udtømning af ARPC3 reducerede antallet af celler, der viser prolifererende bakterier to dage efter infektion. Anvendelse af automatiserede billedanalyse rørledning til disse billeder lov kvantificering af den observerede effekt (figur 1C). De data, der er vist her stammer fra kontrolbrøndene af et genom-dækkende siRNA skærm. Z scoring blev anvendt til at redegøre for plade-til-plade variationer.

Figur 2A illustrerer image analyse anvendes til at identificere inficerede celler og måle den intracellulære bakterielle belastning i posten analysen. I modsætning til endpoint assay posten assayet anvender bakterielle segmentering og en voronoi cellelegeme som cellulær objekt. Kun GFP signal af intracellulær Brucella blev anvendt til segment patogenet i billedet analyse rørledning. Intracellulære bakterier blev defineret af en minimal størrelse på 2 pixels og en GFP intensitet, som overstiger den dim GFP baggrund intensitet af ekstracellulære bakterier. En celle blev betragtet inficeret, hvis mindst én intracellulær bakteriel objekt overlappede med sin voronoi cellelegemet. Endvidere blev den bakterielle belastning estimeres ved at beregne det gennemsnitlige areal af inficerede celler, der er omfattet af intracellulære bakterier.

Som for endpoint assay, udtømning af ARPC3 viste en reduktion i Brucella infektion i posten analysen sammenlignet med celler behandlet med en conTROL siRNA (figur 2B). Kvantificering af infektionsgraden bekræftede, at antallet af inficerede celler (Figur 2C) samt antallet af intracellulære bakterier i inficerede celler (Figur 2D) blev reduceret med udtømning af ARPC3.

figur 1
Figur 1: Analyse af HeLa-celler inficeret med B. abortus udtrykker GFP i endpoint assay (A) Endpoint analyse:. Fluorescens billede der viser et eksempel på endpoint assayet (grøn = B. abortus udtrykker GFP, blå = kerner farvet med DAPI, Scale bar = 50 um). GFP udtrykke B. abortus fik lov at komme ind HeLa-celler i 4 timer efterfulgt af aflivning af ekstracellulære bakterier ved Gm. Yderligere inkubering i 40 h lov bakterier til at replikere inde HeLa-celler. Automatiseret billede analysi s: En CellProfiler rørledning blev anvendt til at segmentere DAPI farvede kerner, efterfulgt af beregning af peri-kerne (ikke-overlappende ring af 8 pixels der omgiver kernen) og voronoi cellelegemet (ikke-overlappende radial udvidelse af kernen med 25 pixels), begge vist i rødt. En celle blev betragtet inficeret hvis det integrerede GFP intensitet i mindst et cellulært rum (nucleus, peri-kerne, voronoi cellelegemet) oversteg den tilsvarende tærskelværdi. (B) Repræsentative billeder af HeLa celler inficeret med B. abortus udtrykker GFP 44 timer efter infektion. Cellerne blev enten transficeret med en kodet (ikke-targeting) siRNA kontrol eller et siRNA målrettet ARPC3. Scale bar = 50 um. (C) Kvantificering af infektion af HeLa-celler depleteret for ARPC3. Dataene er repræsenteret som søjlediagrammer (bar = middel; Z score normalisering; fejlsøjler = standardafvigelse på middelværdien, *** p <0,001; Mann-Whitney-test, n = 7).es / ftp_upload / 54.263 / 54263fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Kvantificering af infektion af HeLa-celler ved B. . abortus udtrykker TetR-GFP i posten assay (A) Henførsel assay: Fluorescens billede der viser et eksempel på post-analysen (gul = intracellulær B. abortus vise dsRed og GFP-signal, rød = ekstracellulær B. abortus vise dsRed signal, blå = kerner farvet med DAPI, Scale bar = 50 um). B. abortus udtrykkende dsRed og TetR-GFP fik lov til at komme ind HeLa-celler i 4 timer efterfulgt af aflivning af ekstracellulære bakterier og samtidig induktion af GFP i intracellulære bakterier med ATC i 4 timer Automated billedanalyse: a. CellProfiler rørledning anvendtes til påvisning DAPIfarvede kerner, efterfulgt af beregning af en voronoi cellelegeme ved radial udvidelse af kernen med 25 pixels (vist i hvidt). Bakterier blev segmenteret baseret på GFP signal. En celle blev betragtet inficeret hvis dens voronoi cellelegeme overlappede med mindst en segmenteret bakteriel formål med tilstrækkelig størrelse og GFP intensitet. Den bakterielle belastning i inficerede celler er illustreret ved integration af arealet af alle segmenterede bakterielle objekter med sin voronoi cellelegemet (Unit = pixels; NaN = intet antal er beregnet i ikke-inficerede celler). (B) eksempel billeder, der illustrerer et fald af intracellulært B. abortus (vist med antallet af gule bakterier) i celler transfekteret med en siRNA targeting ARPC3 sammenlignet med kontrolceller behandlet med scrambled siRNA. Antallet af inficerede celler såvel som det gennemsnitlige antal intracellulære bakterier i inficerede celler reduceres ved ARPC3 vælte. (C) Kvantificering af infektion sats i HeLa-celler depleteretfor ARPC3. Dataene er repræsenteret som søjlediagrammer (bar = middelværdi, normalisering til mock; fejlsøjler = standardafvigelse af middelværdien; * p <0,05; Mann-Whitney test n = 4). (D) Kvantificering af bakteriel belastning af inficerede HeLa-celler depleteret for ARPC3. Dataene er repræsenteret som søjlediagrammer (bar = middelværdi, normalisering til mock, fejllinjer = standardafvigelse af middelværdien; * p <0,05; Mann-Whitney test n = 4). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende Fil 1:. CP2 pipeline - skygge korrektion Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Fil 2: CP2 rørledning- Endpoint assay. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Fil 3:. CP2 rørledning - Adgang assay Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Fil 4:. Beskrivelse af moduler Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Agar (TSA) BD 236950
Tryptic Soy Broth (TSB) Fluka 22092
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Skim milk
250 ml screw cap bottle Corning 8396
DMEM Sigma-Aldrich D5796
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270 Heat-inactivated
Trypsin-EDTA (0.5%) Gibco 15400-054 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Cell Counter Merck Milipore PHCC20060 Alternative cell counting devices can be used
Greiner CELLSTAR 384-well plate Sigma-Aldrich M2062
Peelable aluminum foil Costar 6570
Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" Thermo Scientific 5840150 Alternative reagent dispenser can be used.
Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778-150
Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" BioTek ELX5016 This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil
PBS Gibco 20012
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI Roche 10236276001
Scrambled siRNA Dharmacon D-001810-10
Kif11 siRNA Dharmacon L-003317-00
ARPC3 siRNA Dharmacon L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP) Celli et al.12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.
Primer prAC090 Sigma-Aldrich TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092 Sigma-Aldrich TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2 ATCC CCL-2
ImageXpress Micro Molecular Devices  IXM IMAGING MSCOPE Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.
High-Speed Laser Auto-Focus Molecular Devices  1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objective Nikon  MRF00100 N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded
Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera Molecular Devices  1-2300-1060 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization
MetaXpress software Molecular Devices  9500-0100
LUI-Spectra-X-7 Lumencor SPECTRA X V-XXX-YZ Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)
Single Band Exciter for DAPI Semrock FF01-377/50-25
Single Band Emitter for DAPI Semrock FF02-447/60-25
Single Band Dichroic for DAPI Semrock FF409-Di03-25x36
Single Band Exciter for GFP Semrock FF02-472/30-25
Single Band Emitter for GFP Semrock FF01-520/35-25
Single Band Dichroic for GFP Semrock FF495-Di03-25x36
Single Band Exciter for RFP Semrock FF01-562/40-25
Single Band Emitter for RFP Semrock FF01-624/40-25
Single Band Dichroic for RFP Semrock FF593-Di03-25x36

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
  2. Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
  3. Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
  4. Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
  5. Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
  6. Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
  7. Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
  8. Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
  9. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
  10. Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
  11. Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
  12. Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
  13. Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
  14. von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
  15. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).

Tags

Infektion siRNA (small interfererende RNA) RNAi (RNA-interferens) høj-indhold / high-throughput screening assay automatiseret billedanalyse fluorescensmikroskopi infektion biologi cellebiologi, Intracellulært patogen HeLa-celler celleinvasion
Mikroskopi assays for high-throughput screening af Host faktorer involveret i<em&gt; Brucella</em&gt; Infektion af HeLa-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casanova, A., Low, S. H.,… More

Casanova, A., Low, S. H., Emmenlauer, M., Conde-Alvarez, R., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P., Dehio, C. Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells. J. Vis. Exp. (114), e54263, doi:10.3791/54263 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter