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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano Published: August 5, 2016 doi: 10.3791/54263
Automatic Translation
*1, *1, *1,4, *1,3, 2, 2, 1
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH
* These authors contributed equally

Abstract

Specie Brucella sono facoltativi patogeni intracellulari che infettano gli animali come i loro ospiti naturali. Trasmissione all'uomo è più comunemente causata dal contatto diretto con animali infetti o per ingestione di alimenti contaminati e può portare a infezioni croniche gravi.

Brucella può invadere fagociti professionali e non professionali e replica nel reticolo endoplasmatico (ER) vacuoli -derived. I fattori dell'ospite richiesti per Brucella entrata in cellule ospiti, evitare la degradazione lisosomiale, e la replica nel vano ER-come rimangono in gran parte sconosciuti. Qui si descrivono due metodi per identificare i fattori di accoglienza che partecipano ingresso Brucella e replicazione in cellule HeLa. I protocolli descrivono l'uso di RNA interferenza, mentre potrebbero essere applicati metodi di screening alternative. I saggi si basano sulla rilevazione di batteri fluorescente in cellule ospiti fluorescente con modalità automatizzatea livello di microscopia in campo. Le immagini fluorescenti vengono analizzati utilizzando un standardizzato di analisi di immagine pipeline in CellProfiler che permette singola infezione punteggio cell-based.

Nel saggio finale, replica intracellulare è misurato due giorni dopo l'infezione. Questo permette ai batteri di traffico al loro nicchia replicativa in cui viene avviata la proliferazione circa 12 ore dopo l'entrata batterica. Brucella, che hanno stabilito con successo una nicchia intracellulare avranno così fortemente proliferato all'interno delle cellule ospiti. Dal momento che i batteri intracellulari notevolmente più numerosi singoli batteri non replicativi extracellulari o intracellulari, un ceppo che esprime costitutivamente GFP può essere utilizzato. Il segnale GFP forte viene poi utilizzato per identificare le cellule infette.

Al contrario, per il saggio voce è essenziale distinguere tra intracellulare e batteri extracellulari. Qui, si usa una codifica ceppo per un GFP tetraciclina-inducibile. Induzionedi GFP con inattivazione simultanea di batteri extracellulari dalla gentamicina consente la differenziazione tra intracellulare e batteri extracellulari basati sul segnale GFP, con solo batteri intracellulari poter esprimere GFP. Questo consente il rilevamento affidabile di singoli batteri intracellulari prima dell'avvio proliferazione intracellulare.

Introduction

Specie Brucella sono gram-negativi, patogeni intracellulari facoltativi appartenenti alla classe di α-Proteobacteria. Sono causa di aborti e sterilità nei loro ospiti naturali come bovini, capre, pecore o causando gravi perdite economiche in aree endemiche. La brucellosi è una delle più importanti malattie zoonotiche in tutto il mondo causando oltre mezzo milione di nuovi casi di infezione umana ogni anno 1. Trasmissione a umano è più comunemente causata dal contatto diretto con animali infetti o per ingestione di alimenti contaminati come il latte non pastorizzato. I sintomi della malattia febbrile sono aspecifici, che provoca difficoltà nella diagnosi di brucellosi. Se non trattata, i pazienti possono sviluppare una infezione cronica con i sintomi più gravi come l'artrite, endocardite, e neuropatia 2.

Al livello cellulare Brucella è in grado di invadere le cellule fagocitiche e non fagocitiche e replica all'interno di un intracellulareVano conosciuta come la Brucella -aventi tenore vacuolo (BCV). L'internalizzazione dei batteri richiede riarrangiamenti actina citoscheletro da Rac, Rho, e l'attivazione diretta di Cdc42 3. All'interno della cellula ospite eucariotica, la BCV traffici lungo il percorso endocytic e nonostante l'interazione con i lisosomi, i batteri riescono a evitare il degrado 4. L'acidificazione della BCV dal vescicolare ATPasi è necessario per indurre l'espressione di tipo batterico sistema di secrezione IV (T4SS) 5. Si ritiene che effettori batterici secreti dal T4SS sono essenziali per Brucella stabilire la sua nicchia replicativa, poiché l'eliminazione del T4SS 6 o inibizione del piombo ATPasi vescicolare difetti della costituzione della nicchia intracellulare 7. I batteri non replicano durante la fase di traffico fino a quando non raggiungere un comparto vacuolare ER-derivato 8. Una volta che si verifica la proliferazione intracellulare, la BCV si trova in classociazione ose con marcatori ER quali calnexin e glucosio-6-fosfatasi 6.

I meccanismi molecolari con cui Brucella entra nelle cellule, evita la degradazione lisosomiale, e, infine, replica in un vano ER-come rimangono in gran parte sconosciuti. Fattori di accoglienza che partecipano diverse fasi di infezione sono stati principalmente identificata da approcci mirati o uno schermo di piccole dimensioni small interfering RNA (siRNA) eseguita in cellule di Drosophila 9. Questi hanno fatto luce sul contributo dei singoli fattori dell'ospite durante l'infezione da brucella, ma siamo ancora lontani da una comprensione globale di tutto il processo.

Qui, i protocolli che permettono l'identificazione dei fattori dell'ospite umani utilizzano su larga scala RNA interference (RNAi) di screening, in combinazione con automatizzato grande campo microscopia a fluorescenza e l'analisi automatica delle immagini sono presentati. Reverse siRNA trasfezione di cellule HeLa viene eseguita come describEd in precedenza 10,11 con piccole modifiche. Il test endpoint copre gran parte del ciclo di vita intracellulare Brucella tranne l'uscita e l'infezione di cellule vicine. Per caratterizzare ulteriormente i risultati individuati nel test endpoint, un protocollo modificato per identificare fattori coinvolti nelle prime fasi di infezione viene utilizzato.

Un ceppo abortus Brucella che esprime costitutivamente GFP è usato per il saggio finale in cui i batteri possono infettare le cellule per due giorni. Durante questo tempo, i batteri entrano nelle cellule, il traffico alla nicchia replicativa ER-derivato, e replicare nello spazio peri-nucleare. Gli alti livelli di segnale GFP possono poi essere utilizzati per rilevare in modo affidabile singole celle che contengono i batteri replicare.

Per studiare voce Brucella in un saggio ad elevata prestazione, è importante essere in grado di distinguere tra batteri intracellulari ed extracellulari. Il metodo presentato qui circumvEnt anticorpi differenziale colorazione di batteri intracellulari ed extracellulari. Si basa su un ceppo Brucella esprime un GFP tetraciclina-inducibile in combinazione con espressione costitutiva DsRed. La presenza di un marcatore costitutiva DsRed consente l'identificazione di tutti i batteri che sono presenti nel campione. GFP è indotta dall'aggiunta del anhydrotetracycline atossico tetraciclina analogico (ATC) simultaneamente con inattivazione dei batteri extracellulari da gentamicina (Gm). Mentre la cellula-impermeabile antibiotico Gm uccide i batteri extracellulari, Atc può entrare nella cellula ospite e indurre l'espressione della GFP selettivamente nei batteri intracellulari. Questa doppia giornalista permette la separazione solido di batteri intracellulari singoli (GFP e di segnale DsRed) da batteri extracellulari (solo segnale DsRed) usando la microscopia a grande campo. Al fine di raggiungere l'espressione della GFP rilevabile con intracellulare Brucella abbiamo trovato che 4 ore di induzione da ATC si traduce in un reliil segnale in grado. Sistemi di induzione simili per esprimere selettivamente GFP nei batteri intracellulari è stato utilizzato in precedenza per studiare intracellulare Shigella 12.

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Protocol

Nota: Tutti i lavori con Live Brucella abortus ceppi deve essere eseguita all'interno di un laboratorio di biosicurezza di livello 3 (BSL3) considerando tutte le normative richieste e le precauzioni di sicurezza.

1. Preparazione delle lastre di screening e la coltura di batteri e cellule

  1. Preparazione di Brucella abortus colture starter
    1. Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) da -80 ° C latte magazzino su un piatto Tryptic Soy Agar (TSA) contenente 50 mg / ml kanamicina (TSA / Km). Incubare la piastra per 3-4 giorni a 37 ° C. Utilizzare ceppo Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 per il saggio finale e la tensione Brucella abortus pAC042.08 (apht :: DsRed, teto :: tetR-GFP) per il saggio di ingresso.
      Nota: Il lipopolisaccaride liscia (LPS) di Brucella abortus è un importante determinante di virulenza ma mutanti grezzi può verificarsi a frequenze relativamente alte 14. We raccomanda pertanto testare lo stato del ceppo coltura prima di iniziare con questo esperimento.
    2. batteri Restreak su quattro piastre TSA / Km che coprono il piatto pieno e incubare per 2-3 giorni a 37 ° C.
    3. Utilizzando un ciclo di plastica usa e getta, il trasferimento e batteri risospendere dalle piastre TSA / Km in 10 ml 10% di latte scremato in autoclave. Assicurarsi che i batteri sono ben risospese per garantire le concentrazioni batteriche coerenti in tutte le colture starter.
    4. Aliquota 250 microlitri della sospensione batterica in 2 ml a vite tubi tappo e congelare a -80 ° C.
    5. Scongelare una aliquota della coltura starter e trasferire 25 ml, 50 ml e 100 ml di coltura starter di batteri per separare 250 ml vite bottiglie tappo con 50 ml di Tryptic Soy Broth (TSB) contenente 50 mg / ml kanamicina (TSB / Km) . Sigillare le bottiglie con parafilm.
    6. Incubare le bottiglie durante la notte in un agitatore orbitale a 100 giri al minuto e 37 ° C.
    7. Misurare la densità ottica a 600 Nm (OD 600) per determinare il volume di coltura starter richiesto per raggiungere un diametro esterno 600 = 0,8-1,1 dopo cultura durante la notte.
  2. Preparazione di cellule HeLa
    1. Crescere le cellule HeLa in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS) (DMEM / 10% FCS) in un incubatore umido 37 ° C con 5% di CO 2. crescere le cellule al 80% di confluenza.
  3. Preparare i piatti screening con siRNA.
    1. Diluire siRNA in acqua RNase-free ad una concentrazione finale di 0,32 micron. Trasferire 5 ml / pozzetto di piastre da 384 pozzetti neri chiaro-ben a fondo piatto.
      1. Utilizzare colonne 1, 2, 23 e 24 per i controlli standard. Per i controlli negativi, utilizzare non-targeting siRNA (criptato) e finte pozzi senza siRNA (reagente di trasfezione solo). Per i controlli transfezione, utilizzare un siRNA che induce morte cellulare (KIF11), così come controlli positivi di fattori dell'ospite noti coinvolti nella infezione Brucella (ad esempio, ARPC3,un componente del complesso Arp2 / 3 coinvolti nella polimerizzazione). Trasferire disponibile in commercio librerie siRNA o siRNA personalizzati nei pozzetti rimanenti.
      2. piastre di tenuta con fogli di alluminio pelabili. piastre conservare a -20 ° C.
        Nota: Le piastre possono essere conservati a -20 ° C per almeno 6 mesi e fino a anni, a seconda raccomandazioni del produttore.

2. Reverse siRNA Transfection

  1. Scongelare una piastra a 384 pozzetti nera per centrifugazione a 300 xg per 20 min a temperatura ambiente.
    Nota: Questo porterà giù tutto il liquido che potrebbero aderire al coperchio o la parete del pozzetto.
  2. Preparare il mezzo trasfezione diluendo la trasfezione reagente 1: 200 in DMEM senza FCS a temperatura ambiente. Preparare il mezzo trasfezione non più di 20 minuti prima dell'uso. Mescolare accuratamente la soluzione prima dell'uso.
  3. Aggiungere 25 ml di media transfezione per ogni pozzetto usando un dispensatore di reagentee mescolare le soluzioni spostando la piastra posteriore e indietro.
  4. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente per consentire siRNA / trasfezione reagente formazione del complesso.
  5. Nel frattempo, preparare cellule HeLa lavando le cellule sub-confluenti di un pallone di 75 centimetri 2 una volta con 2,5 ml di 0,05% tripsina-EDTA in PBS (tripsina).
  6. Aggiungere 1,5 ml di tripsina fresco e trasferire il matraccio a 37 ° C per 2-3 minuti finché le cellule completano.
  7. Risospendere le cellule in 10 ml di pre-riscaldato DMEM / 16% FCS.
  8. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato e preparare una sospensione cellulare di 10.000 cellule / ml in DMEM / 16% FCS.
  9. Aggiungere sospensione cellulare 50 microlitri di ciascun pozzetto usando un dispensatore di reagente conseguente 500 cellule / pozzetto.
  10. Spostare la piastra posteriore e indietro per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule. Lasciare la piastra a temperatura ambiente per 5-10 minuti per permettere alle cellule di stabilirsi.
  11. Sigillare la piastra con Parafilm e incubare per 72 ore su un alluminio pre-riscaldatopiatto in un 37 ° C incubatore umido con 5% di CO 2.
    Nota: La piastra in alluminio pre-riscaldato permette distribuzione uniforme della temperatura in tutta la piastra a 384 pozzetti.

3. L'infezione e la fissazione

  1. Un giorno prima infezione, inoculare l'importo determinato in 1.1.7 di B. abortus coltura starter in 50 ml TSB / km di media da 250 ml a vite bottiglia tappo. Sigillare la bottiglia con parafilm e crescere batteri notte a 37 ° C e 100 rpm su un agitatore orbitale a OD 600 = 0,8-1,1.
  2. Misurare OD 600 della coltura batterica e preparare il mezzo infezione diluendo la coltura batterica in DMEM / 10% FCS per ottenere la desiderata molteplicità di infezione (MOI).
    Nota: Per ottenere un tasso di infezione del 5-10% in cellule HeLa, un MOI di 10.000 viene utilizzato. Una curva di titolazione MOI deve essere eseguita per ogni tipo di cellula avere tassi di infezione ottimali.
  3. Sostituire il mezzo di trasfezione della piastra a 384 pozzetticon 50 ml di medium di infezione con un lavatore automatico.
  4. Centrifugare la piastra a 384 pozzetti a 400 xg e 4 ° C per 20 min.
    Nota: Questo aiuta a sincronizzare il processo di infezione.
  5. Sigillare la piastra con parafilm e incubare su un piatto di alluminio pre-riscaldato in un incubatore umido 37 ° C con 5% di CO 2 per 4 ore.
  6. Lavare le cellule con DMEM / 10% FCS contenente 100 mg / ml Gm per inattivare batteri extracellulari usando il lavatore automatico (utilizzare 200 ml / lavaggio ben overflow).
    Nota: Durante un lavaggio troppo pieno, il lavatore automatico eroga simultaneamente e aspira media.
  7. Per il saggio di ingresso, lavare le cellule una seconda volta con DMEM / 10% FCS contenente 100 mg / ml Gm e 100 ng / ml ATC utilizzando il lavatore automatico (utilizzare 200 ml / lavaggio ben overflow).
  8. Sigillare la piastra con parafilm e riportarlo ad una piastra di alluminio pre-riscaldato in incubatrice umido 37 ° C con 5% di CO 2 per un'altra40 hr o 4 ore, per il saggio finale e nel test di ingresso, rispettivamente.
  9. Per il fissaggio, lavare i pozzetti con PBS usando il lavatore automatico (utilizzare 200 ml / lavaggio ben overflow).
  10. Scambio PBS con 50 microlitri 3,7% paraformaldeide in 0,2 M HEPES a pH 7,4 (PFA) usando il lavatore automatico.
    Nota: Attenzione: PFA è tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione.
  11. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  12. Sostituire il mezzo di fissazione con 50 microlitri di PBS utilizzando il lavatore automatico. Nota: I campioni sono ora pronti per essere portati fuori dal BSL3, se necessario.
    Attenzione: La rimozione di qualsiasi campione da una struttura BSL3 è soggetta a valutazione del rischio e la validazione della procedura e dipende dalle normative vigenti per la biosicurezza.

4. La colorazione

  1. Lavare le cellule due volte con 50 ml di PBS.
  2. Permeabilize cellule in 50 pl 0,1% Triton-X-100 in PBS per 10 min.
  3. Wcellule cenere tre volte con PBS. Aggiungere 20 ml di PBS contenente 1 mg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
  4. Lavare le cellule tre volte in PBS e proteggere la colorazione dalla luce con un foglio di alluminio.

5. Imaging

  1. Impostare il microscopio a grande campo automatizzato per l'acquisizione delle immagini.
    Nota: Le impostazioni per un Molecolare microscopio ImageXpress dispositivo utilizzando il software MetaXpress sono descritti di seguito. dispositivi di microscopia alternativi 2D a largo campo con adeguate specifiche hardware e software di imaging possono essere utilizzati (vedi Tabella di materiale / attrezzature per i dettagli).
    1. Selezionare obiettivo 10X, macchina fotografica binning = 1, guadagno = 1.
    2. Selezionare il formato piastra corrispondente alla piastra a 384 pozzetti.
    3. Acquisire 9 siti per bene.
    4. Utilizzare "Attiva fuoco del laser based" e "Focus sulla piastra e ben fondo".
    5. Impostare "primo pozzo", come il pozzo iniziale pertrovare il campione e "Tutti i siti" per il sito autofocus.
    6. Utilizzare il canale DAPI per impostare manualmente Z-Offset per messa a fuoco.
    7. selezionare manualmente la Z-Offset da DAPI per tutti gli altri canali.
    8. correggere manualmente il tempo di esposizione per tutti i canali al fine di garantire un'ampia gamma dinamica con bassa sovraesposizione.
      1. Acquisire l'immagine di un sito rappresentante utilizzando la funzione di auto-esposizione. Utilizzare questo tempo di esposizione di immagine 3-5 siti in tutta la piastra e regolare il tempo di esposizione manualmente finché i pixel più luminosi raggiungono ~ 80% della luminosità massima in tutti i siti.
    9. Immagine del piatto pieno utilizzando i canali DAPI e GFP per il saggio finale. Per il saggio voce selezionare il canale RFP in aggiunta.

6. Automated Image Analysis

Nota: CellProfiler 2 15 viene impiegato come software di analisi dell'immagine per segmentare cellulare e oggetti batteriche e esibirà measur automatizzatoements all'interno degli oggetti identificati. Il software fornisce algoritmi di analisi di immagine in singoli moduli, che possono essere combinati in una conduttura che eseguirà i moduli consecutivamente su tutte le immagini, per eseguire automaticamente un compito specifico di analisi delle immagini. Per seguire il protocollo, installare CellProfiler 2.1.1 o una versione più recente. Quindi, caricare la condotta fornita e seguire le istruzioni qui di seguito per regolare i parametri richiesti all'interno dei moduli. Una descrizione dei singoli moduli di tutte le tubazioni si possono trovare nel file supplementari.

Nota: Due condutture separati utilizzati per ciascun test. La prima conduttura calcola un modello shading, che viene utilizzato dal secondo condotto per correggere le immagini prima dell'analisi. correzione ombreggiatura viene applicata alle immagini per ridurre gli effetti di un percorso ottico disomogeneo dal microscopio. Calcolo del modello di ombreggiatura nella prima conduttura è un processo lungo, ma i risultati saranno di accuratezza maggiore.

    <li> Endpoint Assay
    1. Calcolare il modello di ombreggiatura
      1. Aprire il menu "File", selezionare "Importa" → "Pipeline da file ..." e selezionare la condotta fornita "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Quando è stato chiesto se convertire la pipeline eredità, rispose: "Non convertire".
      2. Vai a → "Impostazioni View uscita" "output" e selezionare una cartella di input con le immagini e una cartella di output per i modelli di ombreggiatura che ne derivano.
      3. Nel modulo (1) "LoadImages", regolare il nome del "Testo che queste immagini hanno in comune" per abbinare i nomi delle immagini.
      4. Assicurarsi che nessuno dei moduli mostrano la loro visualizzazione prima di eseguire l'analisi completa deselezionando tutti i simboli occhio accanto ai moduli. Nota: Questo significativamente diminuisce necessarie risorse di calcolo durante l'elaborazione della pipeline.
      5. Premere il tasto "analizzare le immagini" per avviare il calcolo del modello di ombreggiatura.
      6. Image Analysis Run
        1. Aprire il menu "File", selezionare "Importa" → "Pipeline da file ..." e selezionare la condotta fornita "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Quando è stato chiesto se convertire la pipeline eredità, rispose: "Non convertire".
        2. Vai a → "Impostazioni View uscita" "output" e selezionare una cartella di input con le immagini e una cartella di output per il foglio di calcolo risultante.
        3. Nel modulo (1) "LoadImages", regolare il nome del "Testo che queste immagini hanno in comune" per abbinare i nomi delle immagini.
        4. Nel modulo (2) "LoadSingleImage", caricare i modelli di ombreggiatura calcolati sotto 6.1.1 selezionando la posizione e nomi dei due modelli di ombreggiatura.
        5. Nei moduli (4) - (5) "ImageMath", regolare il parametro "Moltiplicare la prima immagine da" corrispondente alla profondità di bit della telecamera microscopio. Per 8 e 16 bitimmagini impostato il parametro di "1.0", per 12 immagini bit impostare il parametro su "16,0".
        6. Nel modulo (9) "ImageMath" regolare il parametro "moltiplicare la seconda immagine da" ad un valore (iniziare con 0,25) che sopprimerà il segnale Brucella nella colorazione DAPI senza sopprimere la Nuclei.
          1. Fai clic su "Test Mode Start", quindi attivare il simbolo di pausa e la funzione di visualizzazione per il modulo (9) facendo clic sulle icone corrispondenti del modulo.
            Nota: Viene visualizzato il simbolo di pausa in giallo, mentre il simbolo dell'occhio mostrerà un occhio aperto se attivato.
          2. Fai clic su "Esegui" per eseguire l'analisi fino al modulo (9) con il simbolo di pausa attiva. Per testare i valori per il modulo, premere "Step".
          3. Fai clic destro sull'immagine di recente apertura e impostare "contrasto immagine" a "Log normalizzato". Ripetutamente un passo indietro al modulo (9), regolare il parametro "Moltiplicare la seconda immagine da", e passo su tegli modulo nuovo, finché il segnale Brucella è completamente soppressa mentre allo stesso tempo aree nere che indicano over-sottrazione sono minimizzati nell'immagine risultato.
        7. Nel modulo (10) "IdentifyPrimaryObjects", impostare il parametro "Limite inferiore sulla soglia" abbastanza alto (iniziare con zero) in modo che i nuclei sono segmentati e lo sfondo viene ignorato.
          1. Per identificare un buon valore per il modulo (10), passo sopra il modulo e visualizzare l'immagine in ingresso come spiegato ai punti 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2.
          2. Pulsante destro del mouse l'immagine in ingresso e visualizzare l'istogramma.
            Nota: Il picco della istogramma indica in genere sfondo.
          3. A partire da intensità sfondo aumentare il parametro fino ad ottenere una buona segmentazione dei nuclei come mostrato nell'immagine di uscita.
            Nota: L'impostazione della soglia di intensità superiore a quella di fondo è particolarmente importante per i siti vuoti.
        8. Nel modulo (15)4; FilterObjects ", regolare il parametro" Valore minimo ", in modo che le cellule con ben visibile Brucella nel nucleo sono tenuti, e tutti gli altri sono filtrati via In questo passaggio, ignorare Brucella fuori dal nucleo..
          1. Per identificare un buon valore, passo sopra il modulo e visualizzare l'immagine in uscita come spiegato ai punti 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2. Iniziare da zero, che identifica tutte le cellule infetto, e aumentare il valore per piccoli passi fino a quando solo le cellule con ben visibile Brucella presso il nucleo sono conservati.
        9. Nel modulo (16) "FilterObjects", regolare il parametro "Valore minimo", in modo che le cellule con ben visibile Brucella ai perinucleus sono tenuti, e tutte le altre cellule sono filtrati via. Utilizzare un approccio simile a modulo precedente.
        10. Nel modulo (17) "FilterObjects", regolare il parametro "Valore minimo", in modo che le cellule con ben visibile Brucella al Vorcorpo cellulare onoi sono conservati, e tutte le altre cellule vengono filtrati via. Utilizzare un approccio simile a modulo precedente.
          Nota: Il corpo di celle Voronoi è una estensione radiale del nucleo di 25 pixel senza sovrapposizioni con la vicina corpi cellulari Voronoi.
        11. Uscire dalla modalità di test e fare in modo che nessuno dei moduli mostrano la loro visualizzazione prima di eseguire l'analisi completa deselezionando tutti i simboli occhio accanto ai moduli.
          Nota: Questo significativamente diminuisce necessarie risorse di calcolo durante l'elaborazione della pipeline.
        12. Premere il tasto "analizzare le immagini" per avviare l'analisi.
        13. Quando l'analisi è terminata, ispezionare le immagini risultanti PNG nonché il foglio CSV per assicurare che l'analisi funzionato attendibilmente tutta la piastra.
    2. Entrata Assay
      1. Calcolare il modello di ombreggiatura
        1. Aprire il menu "File", selezionare "Importa" → "Pipeline da file ..." e selezionare il fornired gasdotto "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Quando è stato chiesto se convertire la pipeline eredità, rispose: "Non convertire".
        2. Vai a → "Impostazioni View uscita" "output" e selezionare una cartella di input con le immagini e una cartella di output per i modelli di ombreggiatura che ne derivano.
        3. Nel modulo (1) "LoadImages", regolare il nome del "Testo che queste immagini hanno in comune" per abbinare i nomi delle immagini.
        4. Assicurarsi che nessuno dei moduli mostrano la loro visualizzazione prima di eseguire l'analisi completa deselezionando tutti i simboli occhio accanto ai moduli.
          Nota: Questo significativamente diminuisce necessarie risorse di calcolo durante l'elaborazione della pipeline.
        5. Premere il tasto "analizzare le immagini" per avviare il calcolo del modello di ombreggiatura.
      2. Image Analysis Run
        1. Aprire il menu "File", selezionare "Importa" → "Pipeline da file ..." e selezionare il providEd gasdotto "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Quando è stato chiesto se convertire la pipeline eredità, rispose: "Non convertire".
        2. Vai a → "Impostazioni View uscita" "output" e selezionare una cartella di input con le immagini e una cartella di output per il foglio di calcolo risultante.
        3. Nel modulo (1) "LoadImages", regolare il nome del "Testo che queste immagini hanno in comune" per abbinare i nomi delle immagini.
        4. Nel modulo (2) "LoadSingleImage", caricare i modelli di ombreggiatura calcolati sotto 6.2.1 selezionando la posizione e nomi dei due modelli di ombreggiatura.
        5. Nei moduli (4) - (5) "ImageMath", regolare il parametro "Moltiplicare la prima immagine da" corrispondente alla profondità di bit della telecamera microscopio. Per 8 e immagini a 16 bit impostare il parametro di "1.0", per 12 immagini bit impostare il parametro a "16,0".
        6. Nel modulo (6) "IdentifyPrimaryObjects", impostare il parametro "Lower legato sulla soglia "abbastanza alto che solo i nuclei sono segmentati e lo sfondo viene ignorato.
          1. Per identificare un buon valore per il modulo (6), passo sopra il modulo e visualizzare l'immagine in ingresso come spiegato ai punti 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2.
          2. Pulsante destro del mouse l'immagine in ingresso e visualizzare l'istogramma.
            Nota: Il picco della istogramma indica in genere sfondo.
          3. A partire da intensità sfondo aumentare il parametro fino ad ottenere una buona segmentazione dei nuclei come mostrato nell'immagine di uscita.
            Nota: L'impostazione della soglia sopra sfondo è importante per i siti vuoti.
        7. Nel modulo (8) "IdentifyPrimaryObjects", impostare il parametro "Limite inferiore sulla soglia" abbastanza alto che solo Brucella sono segmentati e lo sfondo viene ignorato.
          1. Per identificare un buon valore per il modulo (8), passo sopra il modulo e visualizzare l'immagine in ingresso come spiegato ai punti 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2.
          2. Pulsante destro del mouse l'immagine in ingresso e visualizzare l'istogramma.
            Nota: Il picco della istogramma indica in genere sfondo.
          3. A partire da intensità sfondo aumentare il parametro fino ad ottenere una buona segmentazione della Brucella come visualizzato nell'immagine di uscita.
            Nota: L'impostazione della soglia sopra sfondo è importante per i siti vuoti.
        8. Nel modulo (11) "FilterObjects", regolare il parametro "Valore minimo" in modo che sfondo e manufatti vengono filtrati via, e solo le colonie Brucella sono conservati.
          1. Per identificare un buon valore, passo sopra il modulo e visualizzare l'immagine in uscita come spiegato ai punti 6.1.2.6.1 e 6.1.2.6.2. Inizia con il valore selezionato in 6.2.2.7 e gradualmente aumentare fino a quando solo gli oggetti Brucella sono conservati.
        9. Uscire dalla modalità di test e assicurarsi che nessuno dei moduli mostrano la loro visualizzazione prima di eseguire l'analisi completa per unchecking tutti i simboli occhio accanto ai moduli.
          Nota: Questo significativamente diminuisce necessarie risorse di calcolo durante l'elaborazione della pipeline.
        10. Premere il tasto "analizzare le immagini" per avviare l'analisi.
        11. Quando l'analisi è terminata, ispezionare le immagini risultanti PNG nonché il foglio CSV per assicurare che l'analisi funzionava bene tutta la piastra.

    7. Infezione punteggio

    Nota: siRNA che hanno un impatto significativo sulla vitalità cellulare devono essere considerati con cautela, dal momento che questo può favorire scoperte falsi positivi. Un numero di cellulare alterato colpisce l'attuale MOI e il targeting dei geni essenziali può avere effetti pleiotropici sull'infezione da patogeno. Mentre l'esaurimento incompleta da siRNA permette per lo studio dei geni essenziali, tali obiettivi devono essere convalidati da metodi alternativi (ad esempio, l'interferenza farmaceutica) per corroborare il loro ruolo di fattori dell'ospitedurante l'infezione.

    1. Endpoint Assay
      1. Aprire il foglio CSV generato nel passaggio 6.1.2.12 e calcolare un tasso di infezione per bene dividendo il numero di cellule infette (CellProfiler lettura: "Count_InfectedCells") per il numero totale di cellule (CellProfiler lettura: "CountNuclei"). Se più siti per pozzetto sono stati ripreso, prima di riassumere tutti i siti per ogni bene, per costruire un numero per-bene delle cellule infette e un numero totale per-bene di cellule.
      2. Eseguire Z normalizzazione di punteggio per tener conto delle variazioni piastra-to-plate se le piastre contengono sufficienti non colpire siRNA. Assumere un numero sufficiente di siRNA non ferita per ogni piatto se librerie piene vengono proiettati.
        Equazione 1
    2. Entrata Assay
      1. Aprire il foglio CSV generato nel passaggio 6.2.2.10 e calcolare un tasso di infezione per bene dividendo il numero di cellule infette (CellProfiler lettura: "Count_InfectedCeLLS ") per il numero totale di cellule (CellProfiler lettura:". CountNuclei ") Se più siti per pozzetto sono stati ripreso, prima riassumere tutti i siti per ogni bene, per costruire un numero per-bene delle cellule infette e di una per-bene numero totale di cellule.
      2. Per quantificare la carica batterica di cellule infettate, stimare la superficie media occupata da batteri intracellulari per cellula infettata. A tal fine, dividere l'area integrata di tutti i batteri intracellulari sovrapposti con cellule (CellProfiler lettura: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") per il numero di cellule infettate in questo sito. Per tenere conto di manufatti, utilizzare la mediana di tutti i siti di questa lettura, come il pozzo di lettura.
        Nota: Se questa prova viene utilizzato come un saggio seguito contenente un gran numero di geni coinvolti nella infezione Brucella, non applicano Z punteggio normalizzazione. Invece, eseguire la normalizzazione tramite pozzi finti come riferimento per tenere conto di piatto-to-plate variazione.

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Representative Results

La figura 1A mostra un esempio di analisi di immagini utilizzato per identificare automaticamente le cellule infettate nella prova endpoint. Nuclei di cellule HeLa colorati con DAPI sono stati identificati, sono stati calcolati un peri-nucleo di larghezza 8 pixel che circonda il nucleo, e un corpo di celle Voronoi per estensione del nucleo di 25 pixel. Poiché i batteri proliferano principalmente nello spazio peri-nucleare, l'intensità GFP in questa zona della cella è la misura più robusta di discriminare tra cellule infette e non infette. In alcuni casi, batteri si trovano a proliferare all'esterno del peri-nucleo o di sovrapposizione in larga misura con il nucleo. Pertanto, questi due oggetti supplementari sono stati considerati per l'identificazione di cellule infette. Segmentazione così come le misure di intensità GFP sono state effettuate con il software di analisi di immagine CellProfiler 2.

Brucella 3. Così, l'esaurimento dei componenti di rimodellamento di actina è un controllo positivo adatto per lo screening siRNA. Abbiamo scoperto che siRNA mediata esaurimento delle Arp2 / 3 componenti complessi, che sono coinvolti nella polimerizzazione actina, inibisce fortemente l'infezione da brucella di cellule HeLa (dati non pubblicati). Così, l'abbattimento di ARPC3 è stato utilizzato come controllo positivo. Come si vede nella figura 1B, esaurimento di ARPC3 ridotto il numero di cellule che mostrano proliferanti batteri due giorni dopo l'infezione. Applicando l'analisi delle immagini automatizzata conduttura di queste immagini ha permesso la quantificazione degli effetti osservati (Figura 1C). I dati che vengono visualizzati qui provengono da pozzetti di controllo di uno schermo siRNA genome-wide. Z punteggio è stato applicato per rappresentare le variazioni piastra-piastra.

Figura 2A illustra l'ianalisi mago utilizzato per identificare le cellule infette e misurare la carica batterica intracellulare nel saggio voce. In contrasto con la prova endpoint, il saggio voce utilizza la segmentazione batterica e un corpo cellulare Voronoi come oggetto cellulare. Solo il segnale GFP di Brucella intracellulare è stato utilizzato per segmentare il patogeno in questa immagine analisi pipeline. batteri intracellulari sono stati definiti da una dimensione minima di 2 pixel e una intensità GFP che supera l'intensità GFP dim sfondo di batteri extracellulari. Una cellula è stata considerata infetta se almeno uno intracellulare oggetto batterica sovrapposta con il suo corpo cellulare Voronoi. Inoltre, la carica batterica è stata stimata calcolando la superficie media di cellule infette che è coperto da batteri intracellulari.

Come per il test finale, deplezione di ARPC3 ha mostrato una riduzione di un'infezione Brucella nel saggio voce rispetto alle cellule trattate con un concontrollo siRNA (Figura 2B). Quantificazione del tasso di infezione confermato che il numero di cellule infettate (Figura 2C) e il numero di batteri intracellulari in cellule infettate (Figura 2D) è stato ridotto di esaurimento delle ARPC3.

Figura 1
Figura 1: Analisi di cellule HeLa infettate da B. abortus esprimono GFP nel saggio finale (A) saggio Endpoint:. immagine di fluorescenza che mostra un esempio del saggio finale (verde = B. abortus esprimono GFP, blu = nuclei colorati con DAPI, Barra di scala = 50 micron). GFP che esprimono B. abortus è stato permesso di entrare nelle cellule HeLa per 4 ore seguita da uccidere di batteri extracellulari da GM. Ulteriore incubazione per 40 hr permesso batteri di replicarsi all'interno delle cellule HeLa. analisi de immagine automatica s: Una pipeline CellProfiler è stato utilizzato per i nuclei segmento DAPI macchiato seguito dal calcolo del peri-nucleo (non sovrapposti anello di 8 pixel che circondano il nucleo) e il corpo di celle Voronoi (non sovrapposti estensione radiale del nucleo di 25 pixel), entrambi mostrati in rosso. Una cellula è stata considerata infetta se l'intensità GFP integrato in almeno un compartimento cellulare (nucleo, peri-nucleo, corpo cellulare Voronoi) ha superato la soglia corrispondente. (B) Immagini rappresentative della cellule HeLa infettate con B. abortus esprimono GFP 44 ore dopo l'infezione. Le cellule sono state trasfettate sia con un strapazzate (non-targeting) di controllo siRNA o un siRNA mira ARPC3. Barra di scala = 50 micron. (C) Quantificazione di infezione di cellule HeLa impoverito per ARPC3. I dati sono rappresentati come grafici a barre (bar = media; Z punteggio normalizzazione; barre di errore = errore standard della media; *** p <0.001; test di Mann-Whitney; n = 7).es / ftp_upload / 54263 / 54263fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Quantificazione di infezione di cellule HeLa di B. . abortus esprimendo TetR-GFP nel test d'ingresso (A) saggio Ingresso: immagine di fluorescenza che mostra un esempio di test d'ingresso (giallo = intracellulare B. abortus mostrando DsRed e il segnale GFP, rosso = extracellulare B. abortus mostrando segnale DsRed, blu = nuclei macchiato con DAPI, Scala bar = 50 micron). B. abortus esprimendo DsRed e TetR-GFP è stato permesso di entrare nelle cellule HeLa per 4 ore seguita da uccidere di batteri extracellulari e l'induzione contemporanea di GFP in batteri intracellulari con l'ATC per 4 ore di analisi automatizzata dell'immagine:. Una pipeline CellProfiler è stato utilizzato per rilevare DAPInuclei macchiati seguiti da calcolo di un corpo cellulare Voronoi per estensione radiale del nucleo di 25 pixel (mostrati in bianco). I batteri sono stati segmentati in base al segnale GFP. Una cellula è stata considerata infetta se corpo cellulare Voronoi sovrapposta con almeno un segmentato oggetto batterica di dimensioni sufficienti ed intensità GFP. La carica batterica in cellule infettate è illustrato dalla integrazione dell'area di tutti gli oggetti batteriche segmentate con il suo corpo cellulare Voronoi (Unità = pixel; NaN = nessun numero è calcolato in cellule non infette). Immagini (B) Esempio che illustra una diminuzione di intracellulare B. abortus (indicato dal numero di batteri giallo) in cellule trasfettate con siRNA di targeting ARPC3 rispetto alle cellule di controllo trattate con scrambled siRNA. Il numero di cellule infettate così come il numero medio di batteri intracellulari in cellule infettate è diminuito upon ARPC3 abbattere. (C) Quantificazione del tasso di infezione in cellule HeLa impoveritoper ARPC3. I dati sono rappresentati come grafici a barre (bar = media; normalizzazione per finta; barre di errore = errore standard della media; * p <0.05; test di Mann-Whitney; n = 4). (D) Quantificazione di carica batterica di cellule HeLa infettate impoverito per ARPC3. I dati sono rappresentati come grafici a barre (bar = media; normalizzazione per deridere; barre di errore = errore standard della media; test di Mann-Whitney;; * p <0.05 n = 4). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Supplementare File 1:. CP2 gasdotto - correzione ombreggiatura Clicca qui per scaricare il file.

Supplementare File 2: conduttura CP2- Endpoint dosaggio. Cliccate qui per scaricare questo file.

Supplementare File 3:. CP2 gasdotto - saggio Entry Clicca qui per scaricare il file.

Supplementare File. 4: Descrizione dei moduli Cliccate qui per scaricare questo file.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Agar (TSA) BD 236950
Tryptic Soy Broth (TSB) Fluka 22092
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Skim milk
250 ml screw cap bottle Corning 8396
DMEM Sigma-Aldrich D5796
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270 Heat-inactivated
Trypsin-EDTA (0.5%) Gibco 15400-054 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Cell Counter Merck Milipore PHCC20060 Alternative cell counting devices can be used
Greiner CELLSTAR 384-well plate Sigma-Aldrich M2062
Peelable aluminum foil Costar 6570
Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" Thermo Scientific 5840150 Alternative reagent dispenser can be used.
Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778-150
Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" BioTek ELX5016 This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil
PBS Gibco 20012
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI Roche 10236276001
Scrambled siRNA Dharmacon D-001810-10
Kif11 siRNA Dharmacon L-003317-00
ARPC3 siRNA Dharmacon L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP) Celli et al.12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.
Primer prAC090 Sigma-Aldrich TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092 Sigma-Aldrich TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2 ATCC CCL-2
ImageXpress Micro Molecular Devices  IXM IMAGING MSCOPE Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.
High-Speed Laser Auto-Focus Molecular Devices  1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objective Nikon  MRF00100 N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded
Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera Molecular Devices  1-2300-1060 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization
MetaXpress software Molecular Devices  9500-0100
LUI-Spectra-X-7 Lumencor SPECTRA X V-XXX-YZ Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)
Single Band Exciter for DAPI Semrock FF01-377/50-25
Single Band Emitter for DAPI Semrock FF02-447/60-25
Single Band Dichroic for DAPI Semrock FF409-Di03-25x36
Single Band Exciter for GFP Semrock FF02-472/30-25
Single Band Emitter for GFP Semrock FF01-520/35-25
Single Band Dichroic for GFP Semrock FF495-Di03-25x36
Single Band Exciter for RFP Semrock FF01-562/40-25
Single Band Emitter for RFP Semrock FF01-624/40-25
Single Band Dichroic for RFP Semrock FF593-Di03-25x36

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References

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L'infezione siRNA (small interfering RNA) RNAi (RNA interference) ad alta contenuto di test di screening / ad alto rendimento l'analisi automatizzata delle immagini microscopia a fluorescenza l'infezione biologia biologia cellulare, Agente patogeno intracellulare cellule HeLa l'invasione delle cellule
Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infezione di cellule HeLa
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Casanova, A., Low, S. H.,… More

Casanova, A., Low, S. H., Emmenlauer, M., Conde-Alvarez, R., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P., Dehio, C. Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells. J. Vis. Exp. (114), e54263, doi:10.3791/54263 (2016).

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