Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Mikroskopi-baserte analyser for High-throughput screening av Host faktorer involvert i Published: August 5, 2016 doi: 10.3791/54263
Automatic Translation
*1, *1, *1,4, *1,3, 2, 2, 1
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH
* These authors contributed equally

Abstract

Brucella arter er fakultative intracellulære patogener som infiserer dyr som deres naturlige verter. Overføring til mennesker er oftest forårsaket av direkte kontakt med infiserte dyr eller ved inntak av forurenset mat og kan føre til alvorlige kroniske infeksjoner.

Brucella kan invadere profesjonelle og ikke-profesjonelle fagocyterende celler og replikerer i endoplasmatisk retikulum (ER) avledede vakuoler. Verts faktorer som kreves for Brucella oppføring i vertsceller, unngåelse av lysosomal degradering, og replikering i ER-lignende kupé fortsatt i stor grad ukjent. Her beskriver vi to analyser for å identifisere vertsfaktorer som er involvert i Brucella oppføring og replikering i HeLa celler. Protokollene beskriver bruken av RNA-interferens, mens alternative screeningsmetoder kan anvendes. Analysene er basert på påvisning av fluorescerende merkede bakterier i fluorescensmerkede vertsceller ved hjelp av automatisertbredt felt mikroskopi. De fluoriserende bildene ble analysert ved hjelp av en standardisert bildeanalyse rørledning i CellProfiler som lar enkeltcelle-baserte infeksjon scoring.

Ved endepunktet analysen, er intracellulær replikasjon målt to dager etter infisering. Dette gjør at bakterier til trafikk til deres replicative nisje hvor spredning er initiert rundt 12 timer etter bakterie innreise. Brucella som har opprettet en intracellulær nisje vil dermed ha sterkt proliferated inne vertsceller. Siden intracellulære bakterier vil i stor grad flere enn individuelle ekstracellulære eller intracellulære ikke-replikative bakterier, kan en belastning konstitutivt uttrykker GFP brukes. Den sterke GFP-signalet blir så brukt for å identifisere infiserte celler.

I motsetning til dette, etter oppføringen analysen er det viktig å skille mellom intracellulære og ekstracellulære bakterier. Her blir en påkjenning som koder for en tetracyklin-induserbar GFP anvendt. induksjonav GFP med samtidig inaktivering av ekstracellulære bakterier av gentamicin muliggjør differensiering mellom intracellulære og ekstracellulære bakterier basert på den GFP signal, med bare intracellulære bakterier å være i stand til å uttrykke GFP. Dette gjør den robuste påvisning av enkelt intracellulære bakterier før intracellulær spredning er igangsatt.

Introduction

Brucella-arter er gram-negative, fakultative intracellulære patogener som tilhører klassen av α-Proteobacteria. De forårsaker abort og infertilitet i deres naturlige verter som storfe, geiter, eller sauer som resulterer i alvorlige økonomiske tap i endemiske områder. Brucellose er en av de viktigste zoonotiske sykdommer på verdensbasis forårsaker over en halv million nye infeksjoner hos mennesker årlig 1. Overføring til menneske er som oftest forårsaket av direkte kontakt med infiserte dyr eller ved inntak av forurenset mat som upasteurisert melk. Symptomer på febril sykdom er uspesifikke, noe som fører til vanskeligheter i diagnostisering av brucellose. Ubehandlet kan pasienter utvikle en kronisk infeksjon med mer alvorlige symptomer som leddgikt, endokarditt, og nevropati 2.

På cellenivå Brucella er i stand til å invadere fagocyterende og ikke-fagocyttiske celler og replikerer i et intracellulærtrommet kjent som Brucella-holdige vakuolen (BCV). Internalisering av bakterier krever aktin cytoskjelett rearrangements av Rac, Rho, og direkte aktivering av Cdc42 tre. Inne i eukaryot vertscelle, den BCV traffics langs endocytoseveien og til tross for interaksjon med lysosomer, bakterier klarer å unngå degradering 4. Surgjøring av BCV av vesikulær ATPase er nødvendig for å indusere ekspresjon av IV sekresjon systemet (T4SS) 5-bakteriell type. Det antas at bakterie effektorer utskilles av den T4SS er avgjørende for Brucella å etablere sin replicative nisje, siden sletting av T4SS 6 eller hemming av vesikulær ATPase fører til defekter i etableringen av den intracellulære nisje 7. Bakterier ikke gjenskape i den fasen av menneskehandel til de nå en ER-avledet vacuolar rommet 8. Når intracellulær spredning oppstår, er det BCV funnet i close forbindelse med ER-markører som calnexin og glukose-6-fosfatase-6.

De molekylære mekanismer som Brucella kommer inn celler, unngår lysosomal degradering, og til slutt replikerer i en ER-lignende kupé fortsatt i stor grad ukjent. Vertsfaktorer som er involvert i ulike trinn av infeksjonen har i hovedsak blitt identifisert av målrettede metoder eller en liten skala liten interfering RNA (siRNA) skjerm utført i Drosophila celler 9. Disse har belyse bidrag av individuelle vertsfaktorer i løpet av Brucella infeksjon, men vi er fortsatt langt fra en helhetlig forståelse av hele prosessen.

Her er protokoller som gjør det mulig å identifisere menneskelige vertsfaktorer ved bruk av storskala RNA interferens (RNAi) screening i kombinasjon med automatiserte bredt felt fluorescens mikroskopi og automatisert bildeanalyse presentert. Omvendt siRNA transfeksjon av HeLa-celler utføres som described tidligere 10,11 med mindre modifikasjoner. Endepunktet assay dekker en stor del av Brucella intracellulære livssyklus unntatt utgang og infeksjon av naboceller. For ytterligere å karakterisere treff identifisert i endepunktet analysen, er en modifisert protokoll for å identifisere faktorer som er involvert i tidlige stadier av infeksjonen anvendes.

En Brucella abortus stamme som konstitutivt uttrykker GFP brukes for endepunktet assay hvor bakterien får lov til å infisere cellene i to dager. I løpet av denne tiden, bakterier inn celler, trafikk til ER-avledet replicative nisje, og gjenskape i peri-atom plass. De høye nivåene av GFP signal kan deretter brukes til å pålitelig påvise enkeltceller som inneholder replikerende bakterier.

For å studere Brucella oppføring i en high-throughput-analysen, er det viktig å være i stand til å skille mellom de intracellulære og ekstracellulære bakterier. Metoden som presenteres her circumventene differensial antistoff farging av intracellulære og ekstracellulære bakterier. Den er basert på en Brucella-stamme som uttrykker en tetracyklin-induserbar GFP i kombinasjon med konstitutiv ekspresjon av DsRed. Tilstedeværelsen av en konstitutiv DsRed markør tillater identifikasjon av alle bakterier som er til stede i prøven. GFP-ekspresjon indusert ved tilsetting av den ikke-giftig tetracyklin-analog anhydrotetracycline (ATC) samtidig med inaktivering av ekstracellulære bakterier av gentamicin (Gm). Mens celle-ugjennomtrengelig antibiotika Gm dreper ekstracellulære bakterier, kan ATC gå inn i vertscellen og indusere GFP uttrykk selektivt i intracellulære bakterier. Denne doble reporter gjør den robuste separasjon av enkelt intracellulære bakterier (GFP og DsRed signal) fra ekstracellulære bakterier (bare DsRed signal) ved hjelp av bredt felt mikroskopi. For å nå påvisbart GFP-ekspresjon av intracellulær Brucella har man funnet at fire timer med induksjon ved ATC resulterer i et relistand signal. Lignende induksjons ordninger for å selektivt uttrykker GFP i intracellulære bakterier har blitt brukt tidligere for å studere intracellulær Shigella 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Alt arbeid med live Brucella abortus stammer må utføres innenfor et biosikkerhetsnivå 3 (BSL3) laboratorium vurderer alle nødvendige forskrifter og sikkerhetsregler.

1. Utarbeidelse av innretningen og dyrking av bakterier og celler

  1. Utarbeidelse av Brucella abortus startkulturer
    1. Serie Brucella abortus 2308 (B. abortus) fra -80 ° C melk lager på et tryptisk soya-agar (TSA) plate inneholdende 50 ug / ml kanamycin (TSA / Km). Inkuber platen i 3-4 dager ved 37 ° C. Bruk belastning Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 for endepunktet analysen og belastning Brucella abortus pAC042.08 (apht :: DsRed, Teto :: tetR-GFP) for oppføringen analysen.
      Merk: glatt lipopolysakkarid (LPS) av Brucella abortus er en viktig virulens determinant men grove mutanter kan oppstå ved relativt høye frekvenser 14. We anbefaler derfor å teste status av kulturen stammen før start med dette eksperimentet.
    2. Restreak bakterier på fire TSA / Km plater som dekker hele plate og inkuberes i 2-3 dager ved 37 ° C.
    3. Ved hjelp av en engangs plast loop, overføring og resuspender bakterier fra TSA / Km plater i 10 ml 10% autoklaveres skummet melk. Sørg for at bakteriene er godt resuspendert å sikre konsistente bakteriekonsentrasjon i alle startkulturer.
    4. Alikvote 250 pl av bakteriesuspensjonen i 2 ml skrukork og frysing ved -80 ° C.
    5. Tine en delmengde av startkulturen og overfør 25 pl, 50 pl og 100 pl av det bakterielle starterkultur for å separere 250 ml skrukork-flasker med 50 ml tryptisk soyamedium (TSB) inneholdende 50 ug / ml kanamycin (TSB / Km) . Tett flaskene med Parafilm.
    6. Inkuber flaskene over natten på en orbital-rystemaskin ved 100 rpm og 37 ° C.
    7. Måle den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600) for å bestemme volumet av startkulturen som kreves for å oppnå en OD 600 = 0,8-1,1 etter dyrking over natten.
  2. Utarbeidelse av HeLa celler
    1. HeLa-celler vokse i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) (DMEM / 10% FCS) i et 37 ° C fuktig inkubator med 5% CO 2. dyrke celler til 80% sammenflytning.
  3. Forbered Screening plater med siRNAs.
    1. Fortynn sirnas i RNase-fritt vann til en endelig konsentrasjon på 0,32 uM. Transfer 5 ul / brønn for å svart klar-brønners flatbunnede 384-brønns plater.
      1. Bruk kolonnene 1, 2, 23 og 24 for standard kontroller. For negative kontroller, bruke ikke-målretting siRNA (kryptert) og håne brønner uten sirnas (transfeksjon reagens only). For transfeksjon kontroller ved å bruke et siRNA som induserer celledød (KIF11), så vel som positive kontroller med kjente vertsfaktorer som er involvert i Brucella-infeksjon (f.eks, ARPC3,en komponent av Arp2 / 3-komplekset som er involvert i aktin polymerisasjon). Overfør kommersielt tilgjengelig siRNA biblioteker eller egendefinerte sirnas til de resterende brønnene.
      2. Seal plater med avtagbare aluminiumsfolie. Oppbevar plater ved -20 ° C.
        Merk: Plater kan lagres ved -20 ° C i minst 6 måneder og opp til år avhengig av produsentens anbefalinger.

2. Snu siRNA Transfeksjon

  1. Tine et svart 384-brønners plate ved sentrifugering ved 300 xg i 20 minutter ved romtemperatur.
    Merk: Dette vil få ned all væske som kan forholde seg til lokket eller på siden av brønnene.
  2. Klargjør transfeksjon medium ved fortynning av transfeksjon reagens 1: 200 i DMEM, uten FCS ved romtemperatur. Forbered transfeksjon medium ikke lenger enn 20 min før bruk. bland forsiktig løsningen før bruk.
  3. Tilsett 25 mL transfeksjon medium i hver brønn med en reagentutdelerog blande oppløsningene ved å bevege platen frem og tilbake.
  4. Inkuber platen i 1 time ved romtemperatur for å tillate siRNA / transfeksjon reagens kompleksdannelse.
  5. I mellomtiden fremstille HeLa-celler ved å vaske de sub-konfluente celler i en 75 cm2 kolbe én gang med 2,5 ml 0,05% trypsin-EDTA i PBS (trypsin).
  6. Tilsett 1,5 ml frisk trypsin og overføre kolben til 37 ° C i 2-3 min inntil cellene runde opp.
  7. Resuspender cellene i 10 ml forvarmet DMEM / 16% FCS.
  8. Telle celler ved hjelp av en automatisert celleteller og utarbeide en cellesuspensjon på 10.000 celler / ml i DMEM / 16% FCS.
  9. Tilsett 50 ul cellesuspensjon til hver brønn ved anvendelse av en reagens dispenser som resulterer i 500 celler / brønn.
  10. Bevege platen frem og tilbake for å oppnå jevn fordeling av cellene. La platen ved romtemperatur i 5-10 min for å tillate cellene å slå seg ned.
  11. Tett plate med Parafilm og inkuber den for 72 timer på en forvarmet aluminiumplate i en 37 ° C fuktig inkubator med 5% CO2.
    Merk: forvarmet aluminiumsplate gir lik temperaturfordeling i hele 384-brønners plate.

3. Infeksjon og Fiksering

  1. En dag før infeksjon, inokulere den mengde som er bestemt i 1.1.7 av B. abortus starterkultur i 50 ml TSB / Km medium i en 250 ml skrukork flaske. Forsegl flasken med Parafilm og dyrke bakterier over natten ved 37 ° C og 100 opm, på en orbital-rystemaskin til OD600 = 0,8-1,1.
  2. Måle OD 600 av bakteriekulturen og forberede infeksjonen medium ved fortynning av bakteriekulturen i DMEM / 10% FCS for å oppnå den ønskede multiplisitet av infeksjon (MOI).
    Merk: For å få en infeksjon rate på 5-10% i HeLa-celler, er en MOI på 10.000 brukt. En MOI titrering kurve skal utføres for hver celletype for å oppnå optimale infeksjonsrater.
  3. Utveksle transfeksjon medium av 384-brønners platemed 50 ul av infeksjonen medium ved hjelp av en automatisk platevasker.
  4. Sentrifuger 384-brønners plate ved 400 xg og 4 ° C i 20 min.
    Merk: Dette bidrar til å synkron infeksjonen prosessen.
  5. Tett plate med Parafilm og inkuber det på en forvarmet aluminiumplate i en 37 ° C fuktig inkubator med 5% CO2 i 4 timer.
  6. Vask cellene med DMEM / 10% FCS inneholdende 100 ug / ml Gm for å inaktivere ekstracellulære bakterier ved hjelp av automatisk platevasker (bruke 200 pl / brønn overløp vask).
    Merk: Under et overløp vask, den automatiserte tallerken skive samtidig utleverer og aspirerer medium.
  7. For inngangs analysen, vaskes cellene en gang med DMEM / 10% FCS inneholdende 100 ug / ml Gm og 100 ng / ml ATC ved hjelp av automatisk platevasker (bruke 200 pl / brønn overløp vask).
  8. Tett plate med Parafilm og returnere det til en forvarmet aluminiumsplate i 37 ° C fuktig inkubator med 5% CO 2 for en annen40 timer eller 4 timer, for endepunktet analysen og oppføring analysen, respektivt.
  9. For fiksering, vaske brønnene med PBS ved hjelp av automatiserte platevasker (bruk 200 ul / brønn overløp vask).
  10. Utveksling PBS med 50 ul 3,7% paraformaldehyd i 0,2 M HEPES ved pH 7,4 (PFA) ved hjelp av automatisk platevasker.
    Merk: Advarsel: PFA er giftig ved innånding, hudkontakt og svelging.
  11. Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
  12. Bytt fiksering medium med 50 pl PBS med automatisk platevasker. Merk: Prøvene er nå klar til å bli tatt ut fra den BSL3 om nødvendig.
    Forsiktig: Fjerning av enhver prøve fra en BSL3 anlegget er gjenstand for risikovurdering og validering av prosedyren og avhenger av gjeldende regelverk for biosikkerhet.

4. Farging

  1. Vask cellene to ganger med 50 ul PBS.
  2. Permeabilisere celler i 50 ul 0,1% Triton-X-100 i PBS i 10 min.
  3. Waske cellene tre ganger med PBS. Tilsett 20 mL PBS inneholdende 1 pg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur.
  4. Vask cellene tre ganger i PBS og beskytte fargingen mot lys med aluminiumfolie.

5. Imaging

  1. Sett opp automatiske wide-feltet mikroskop for bildeopptak.
    Merk: Innstillingene for en Molecular Device ImageXpress mikroskopet med MetaXpress programvaren er beskrevet nedenfor. Alternative 2D bredt felt mikroskopi enheter med riktige maskinvarespesifikasjoner og bildebehandlingsprogrammer kan brukes (se tabell av materiell / utstyr for detaljer).
    1. Velg 10X objektiv, kamera binning = 1, gain = 1.
    2. Velge den plateformat som svarer til den 384-brønners plate.
    3. Acquire 9 sider per brønn.
    4. Bruk "Aktiver laserbasert fokus" og "Fokus på plate og godt bottom".
    5. Sett "Første brønn" som den første godt forfinne prøven og "Alle steder" for nettstedet autofokus.
    6. Bruk DAPI kanal for å sette Z-Offset for fokus manuelt.
    7. velg Z-Offset fra DAPI for alle andre kanaler manuelt.
    8. Manuelt korrigere eksponeringstiden for alle kanaler for å sikre et bredt dynamisk område med lav overeksponering.
      1. Acquire et bilde av en representant området ved hjelp av autoeksponering funksjon. Bruk denne eksponeringstiden til bilde 3-5 steder over hele platen og justere eksponeringstiden manuelt til de lyseste pikslene nå ~ 80% av maksimal lysstyrke enn alle områder.
    9. Bildet i full platen ved hjelp av DAPI og GFP kanaler for endepunkt analysen. For posten analysen velge RFP kanal i tillegg.

6. Automated Image Analysis

Merk: CellProfiler 2 15 er ansatt som bildeanalyse programvare for å segmentere mobilnettet og bakterielle objekter og utføre automatisert Måltements innenfor de identifiserte objekter. Programvaren inneholder bildeanalysealgoritmer i enkeltmoduler, som kan slås sammen til en rørledning som vil utføre modulene fortløpende på alle bildene, for automatisk å utføre en bestemt bildeanalyse oppgave. Å følge protokollen, installere CellProfiler 2.1.1 eller en nyere versjon. Deretter legger du den medfølgende rørledningen og følg instruksjonene nedenfor for å justere de nødvendige parametre innenfor modulene. En beskrivelse av de enkelte moduler av alle rørledninger kan bli funnet i Supplemental filer.

Merk: To separate rørledninger blir brukt for hver analyse. Den første rørledning beregner en skyggelegging modell, som brukes av den andre rørledning for å korrigere bilder før analyse. Skyggelegging korreksjon påføres bildene for å redusere virkningene av et inhomogent lysbanen fra mikroskopet. Beregne skyggelegging modellen i første rørledningen er en langvarig prosess, men resultatene vil være av høyere nøyaktighet.

    <li> Endpoint analysen
    1. Beregn skyggelegging modell
      1. Gå til menyen "File", velg "Import" → "Pipeline fra fil ...", og velg gitt rørledning "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Når du blir spurt om du vil konvertere arven rørledningen, svarer "Ikke konvertere".
      2. Gå til "Output" → "Vis utgang innstillinger" og velg en inngangs mappe med bilder og en output mappe for de resulterende skygge modeller.
      3. I Module (1) "LoadImages" justerer navnet på "Text at disse bildene har til felles" for å matche bildenavnene.
      4. Pass på at ingen av modulene vise sin skjerm før du kjører full analyse ved å fjerne merket alle øyen symboler ved siden av modulene. Merk: Dette reduserer betraktelig nødvendige beregningsressurser under behandlingen av rørledningen.
      5. Trykk på "Analyze bilder" for å starte beregningen av skyggelegging modell.
      6. Kjør bildeanalyse
        1. Gå til menyen "File", velg "Import" → "Pipeline fra fil ...", og velg gitt rørledning "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Når du blir spurt om du vil konvertere arven rørledningen, svarer "Ikke konvertere".
        2. Gå til "Output" → "Vis utgang innstillinger" og velg en inngangs mappe med bilder og en output mappe for den resulterende regneark.
        3. I modul (1) "LoadImages" justerer navnet på "Text at disse bildene har til felles" for å matche bildenavnene.
        4. I modul (2) "LoadSingleImage", legger de skyggelegging modeller beregnet etter 6.1.1 ved å velge plassering og filnavn på de to skygge modeller.
        5. I moduler (4) - (5) "ImageMath", justere parameteren "Multipliser det første bildet av" matche bitdybde av mikroskopet kameraet. For 8 og 16 bitbildene setter parameteren til "1.0", for 12-bits bilder setter parameteren til "16,0".
        6. I modul (9) "ImageMath" justere parameteren "Multipliser det andre bildet med" til en verdi (start med 0,25) som vil undertrykke Brucella signal i DAPI flekker uten å undertrykke kjernene.
          1. Klikk "Start Test Mode", og deretter aktivere pausesymbolet og visningsfunksjonen for modul (9) ved å klikke på de tilhørende ikoner av modulen.
            Merk: pausesymbolet vises i gult, mens øyet symbol vil vise et åpent øye hvis aktivert.
          2. Klikk "Kjør" for å kjøre analysen opp til modul (9) med aktiv pause symbol. For å teste verdiene for modulen, trykk på "Step".
          3. Høyreklikk på nyåpnede bilde og sette "Image kontrast" til "Log normalisert". Gjentatte ganger gå tilbake til modul (9), justere parameteren "Multipliser det andre bildet av", og gå over tHan modul igjen, inntil Brucella signal er fullt undertrykt, mens på samme tid sorte områder som indikerer over subtraksjon er minimert i resultatet bildet.
        7. I modul (10) "IdentifyPrimaryObjects", sette parameteren "Nedre grense på terskel" høy nok (starter med null) slik at kjerner er segmentert og bakgrunnen blir ignorert.
          1. For å identifisere en god verdi for modul (10), step over modulen og vise inngangsbildet som forklart i trinn 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2.
          2. Høyreklikk på inngangsbildet og vise histogrammet.
            Merk: Toppen av histogram indikerer vanligvis bakgrunn.
          3. Å starte fra bakgrunnsintensitet øke parameteren til en god oppdeling av kjerner er oppnådd som vist i utgangsbildet.
            Merk: Innstilling terskelen høyere enn bakgrunns intensitet er spesielt viktig for tomme områder.
        8. I modul (15)4, FilterObjects ", justere parameteren" Minimum verdi ", slik at celler med godt synlig Brucella i kjernen blir holdt, og alle andre blir filtrert bort I dette trinnet, ignorere Brucella utenfor kjernen..
          1. For å identifisere en god verdi, step over modulen og vise digitalbilde som forklart i trinn 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2. Start fra null, som identifiserer alle celler som er infisert, og øke verdien av små skritt til bare celler med godt synlig Brucella ved kjernen holdes.
        9. I modul (16) "FilterObjects", justere parameteren "Minimum verdi", slik at celler med godt synlig Brucella ved perinucleus holdes, og alle andre celler blir filtrert bort. Bruke en lignende metode som i det foregående modul.
        10. I modul (17) "FilterObjects", justere parameteren "Minimum verdi", slik at celler med godt synlig Brucella ved Voronoi cellen kroppen holdes, og alle andre celler blir filtrert bort. Bruke en lignende metode som i det foregående modul.
          Merk: Voronoi cellekroppen er en radial forlengelse av kjernen med 25 piksler med ingen overlapping med nabo Voronoi celle organer.
        11. Avslutt testmodus og sørg for at ingen av modulene vise sin skjerm før du kjører full analyse ved å fjerne merket alle øyen symboler ved siden av modulene.
          Merk: Dette reduserer betraktelig nødvendige beregningsressurser under behandlingen av rørledningen.
        12. Trykk på "Analyze bilder" for å starte analysen.
        13. Når analysen er ferdig, inspisere de resulterende PNG-bilder, så vel som CSV-arket for å sikre at analysen virket på en pålitelig måte gjennom hele platen.
    2. Entry analyse
      1. Beregn skyggelegging modell
        1. Gå til menyen "File", velg "Import" → "Pipeline fra fil ...", og velg gid rørledning "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Når du blir spurt om du vil konvertere arven rørledningen, svarer "Ikke konvertere".
        2. Gå til "Output" → "Vis utgang innstillinger" og velg en inngangs mappe med bilder og en output mappe for de resulterende skygge modeller.
        3. I modul (1) "LoadImages" justerer navnet på "Text at disse bildene har til felles" for å matche bildenavnene.
        4. Pass på at ingen av modulene vise sin skjerm før du kjører full analyse ved å fjerne merket alle øyen symboler ved siden av modulene.
          Merk: Dette reduserer betraktelig nødvendige beregningsressurser under behandlingen av rørledningen.
        5. Trykk på "Analyze bilder" for å starte beregningen av skyggelegging modell.
      2. Kjør bildeanalyse
        1. Gå til menyen "File", velg "Import" → "Pipeline fra fil ...", og velg innsamlingsløsed rørledning "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Når du blir spurt om du vil konvertere arven rørledningen, svarer "Ikke konvertere".
        2. Gå til "Output" → "Vis utgang innstillinger" og velg en inngangs mappe med bilder og en output mappe for den resulterende regneark.
        3. I modul (1) "LoadImages" justerer navnet på "Text at disse bildene har til felles" for å matche bildenavnene.
        4. I modul (2) "LoadSingleImage", legger de skyggelegging modeller beregnet etter 6.2.1 ved å velge plassering og filnavn på de to skygge modeller.
        5. I moduler (4) - (5) "ImageMath", justere parameteren "Multipliser det første bildet av" matche bitdybde av mikroskopet kameraet. For 8 og 16 bits bilder setter parameteren til "1.0", for 12-bits bilder setter parameteren til "16,0".
        6. I modul (6) "IdentifyPrimaryObjects", sette parameteren "Lower bundet på terskel "høy nok til at bare kjerner er segmentert og bakgrunnen blir ignorert.
          1. For å identifisere en god verdi for modul (6), step over modulen og vise inngangsbildet som forklart i trinn 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2.
          2. Høyreklikk på inngangsbildet og vise histogrammet.
            Merk: Toppen av histogram indikerer vanligvis bakgrunn.
          3. Å starte fra bakgrunnsintensitet øke parameteren til en god oppdeling av kjerner er oppnådd som vist i utgangsbildet.
            Merk: Innstilling terskelen ovenfor bakgrunn er viktig for tomme områder.
        7. I modul (8) "IdentifyPrimaryObjects", sette parameteren "Nedre grense på terskel" høy nok til at bare Brucella er segmentert og bakgrunnen blir ignorert.
          1. For å identifisere en god verdi for modul (8), step over modulen og vise inngangsbildet som forklart i trinn 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2.
          2. Høyreklikk på inngangsbildet og vise histogrammet.
            Merk: Toppen av histogram indikerer vanligvis bakgrunn.
          3. Å starte fra bakgrunnsintensiteten øker parameter inntil god oppdeling av Brucella som vises i utgangsbildet er oppnådd.
            Merk: Innstilling terskelen ovenfor bakgrunn er viktig for tomme områder.
        8. I modul (11) "FilterObjects", justere parameteren "Minimum verdi", slik at bakgrunnen og gjenstander blir filtrert bort, og bare Brucella kolonier holdes.
          1. For å identifisere en god verdi, step over modulen og vise digitalbilde som forklart i trinn 6.1.2.6.1 og 6.1.2.6.2. Start med valgt i 6.2.2.7 og trinnvis verdien øke det før bare Brucella gjenstander holdes.
        9. Avslutt testmodus og sørg for at ingen av modulene vise sin skjerm før du kjører full analyse av unchecking alle øyen symboler ved siden av modulene.
          Merk: Dette reduserer betraktelig nødvendige beregningsressurser under behandlingen av rørledningen.
        10. Trykk på "Analyze bilder" for å starte analysen.
        11. Når analysen er ferdig, inspisere de resulterende PNG-bilder samt CSV ark for å sikre at analysen jobbet godt gjennom hele platen.

    7. Infeksjon Scoring

    Merk: sirnas som har en betydelig innvirkning på celle levedyktighet må vurderes med forsiktighet, siden dette kan fremme falske positive funn. En endret celle nummer påvirker selve MOI og målretting av essensielle gener kan ha pleiotrope effekter på patogen infeksjon. Mens ufullstendig tømming av siRNAs åpner for studiet av viktige gener, slike mål må bli godkjent av alternative metoder (for eksempel farmasøytisk interferens) for å underbygge sin rolle som vertsfaktoreri løpet av infeksjon.

    1. Endpoint analyse
      1. Åpne CSV ark generert i trinn 6.1.2.12 og beregne en per brønn infeksjon rate ved å dividere antall infiserte celler (CellProfiler avlesning: "Count_InfectedCells") av det totale antall celler (CellProfiler avlesning: "CountNuclei"). Hvis flere steder pr godt ha blitt fotografert, først sammenfatte alle områder for hver brønn, for å bygge en per-brønn antall infiserte celler og et per-brønn totale antall celler.
      2. Utfør Z scoring normalisering å gjøre rede for plate-til-plate variasjoner hvis platene inneholder tilstrekkelig ikke-hit sirnas. Anta et tilstrekkelig antall ikke-treffet sirnas per plate hvis fulle bibliotekene er skjermet.
        ligning 1
    2. Entry analyse
      1. Åpne CSV ark generert i trinn 6.2.2.10 og beregne en per brønn infeksjon rate ved å dividere antall infiserte celler (CellProfiler avlesning: "Count_InfectedCells ") av det totale antall celler (CellProfiler avlesning:". CountNuclei ») Hvis flere steder pr godt ha blitt fotografert, først sammenfatte alle områder for hver brønn, for å bygge en per-brønn antall infiserte celler og et per-brønners totale antall celler.
      2. For å kvantifisere bakteriemengden av infiserte celler, anslår gjennomsnittlig areal som opptas av intracellulære bakterier per infisert celle. For dette formål deles den integrerte arealet for alle intracellulære bakterier overlappende med celler (CellProfiler avlesning: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") ved antallet infiserte celler i dette området. For å veie opp for gjenstander, bruke medianen av alle stedene i denne avlesning som vel avlesning.
        Merk: Hvis denne analysen blir brukt som en følge opp assay inneholdende et stort antall gener som er involvert i Brucella-infeksjon, gjelder ikke Z stillingen normalisering. I stedet utføre normalisering bruker mock brønner som referanse til å gjøre rede for plate-til-plate variasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A viser et eksempel på en bildeanalyse brukes til automatisk å identifisere infiserte celler i endepunktet analysen. Nuclei fra HeLa-celler farget med DAPI ble identifisert, ble en peri-kjerne av 8 bildeelementer bredde som omgir kjernen, og et Voronoi-celle legeme ved forlengelse av kjernen med 25 bildeelementer beregnet. Siden bakterier hovedsakelig proliferere i peri-atom plass, GFP intensitet i dette område av cellen er den mest robuste måling for å skjelne mellom infiserte og ikke-infiserte celler. I noen tilfeller er bakterier funnet å formere seg utenfor det peri-kjernen eller overlegg i stor grad med kjernen. Derfor er disse to ytterligere objektene ble også vurdert for identifikasjon av infiserte celler. Segmentering samt GFP intensitetsmålinger ble utført med bildeanalyseprogramvaren CellProfiler 2.

Brucella 3. Dermed uttømming av aktin ombygging komponenter er en passende positiv kontroll for siRNA screening. Vi har funnet at siRNA-mediert nedbrytning av Arp2 / 3 komplekse komponenter som er involvert i aktin polymerisasjon, hemmer sterkt Brucella infeksjon av HeLa-celler (upubliserte data). Således knockdown av ARPC3 ble anvendt som en positiv kontroll. Som det fremgår av figur 1B, uttømming av ARPC3 redusert antall celler som viser prolifererende bakterier to dager etter infisering. Anvendelse av automatisert bildeanalyse rørledning til disse bilder tillatt kvantifisering av den observerte effekt (figur 1C). De data som er vist her stammer fra kontrollbrønnene av et genom-wide siRNA skjerm. Z scoring ble brukt til å gjøre rede for plate-til-plate variasjoner.

Figur 2A viser jegmage analyse anvendes for å identifisere infiserte celler og måle intracellulær bakteriemengden i inngangs analysen. I motsetning til endepunktet analysen benytter inngangs analysen bakteriell segmentering og et Voronoi-celle-legeme som cellulære objekt. Bare den GFP signal av intracellulær Brucella ble anvendt for å segmentere patogenet i denne bildeanalyse rørledning. Intracellulære bakterier ble definert ved en minimal størrelse på 2 piksler, og et GFP intensitet som overstiger den svake GFP bakgrunn intensiteten av ekstracellulære bakterier. En celle ble ansett infisert hvis minst en intracellulær bakteriell objekt overlappet med sin Voronoi cellelegemet. Videre ble bakteriemengden estimeres ved å beregne gjennomsnittlig areal på infiserte celler som er dekket av intracellulære bakterier.

Som for endepunktet analysen, uttømming av ARPC3 viste en reduksjon i Brucella-infeksjon i posten analysen sammenlignet med celler behandlet med en conkontroll siRNA (figur 2B). Kvantifisering av infeksjonsraten bekreftet at antallet infiserte celler (figur 2C), så vel som antallet av intracellulære bakterier i infiserte celler (figur 2D) ble redusert ved uttømming av ARPC3.

Figur 1
Figur 1: Analyse av HeLa-celler infisert med B. abortus uttrykker GFP i endepunktet assay (A) endepunktet analyse:. Fluorescens bilde som viser et eksempel på den endepunktet analysen (grønn = B. abortus som uttrykker GFP, blå = atomkjerner farget med DAPI, Skala bar = 50 um). GFP uttrykke B. abortus fikk lov til å gå inn HeLa cellene i 4 timer, etterfulgt av å drepe av ekstracellulære bakterier ved Gm. Videre inkubasjon i 40 hr lov bakterier å formere inne HeLa-celler. Automatisert image analyseverktø s: En CellProfiler rørledning ble anvendt for å segmentere DAPI farget kjerner, etterfulgt av beregningen av peri-kjerne (ikke-overlappende ring av 8 bildeelementer som omgir kjernen) og Voronoi cellelegeme (ikke-overlappende radial utvidelse av kjernen med 25 bildeelementer), begge vist i rødt. En celle ble ansett infisert hvis det integrerte GFP intensitet i det minste ett celledelt kammer (nucleus, peri-kjernen, Voronoi cellekroppen) overskrides den tilsvarende terskel. (B) Representative bilder av HeLa-celler infisert med B. abortus uttrykker GFP 44 timer etter smitte. Cellene ble enten tilført med en egge (ikke-måls) siRNA kontroll eller en siRNA rettet mot ARPC3. Scale bar = 50 mikrometer. (C) Kvantifisering av infeksjon av HeLa-celler utarmet for ARPC3. Dataene er representert som søylediagrammer (bar = midlere; Z ballen normalisering; feilfelt = standard feil av gjennomsnittet, *** p <0,001; Mann-Whitney-test; n = 7).es / ftp_upload / 54263 / 54263fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Kvantifisering av infeksjon av HeLa-celler av B. . abortus uttrykker tetra-GFP i oppføringen analysen (A) Entry analysen: Fluorescens bilde som viser et eksempel på oppføring analysen (gul = intracellulær B. abortus viser DsRed og GFP signal, rød = ekstracellulære B. abortus viser DsRed signal, blå = kjerner farget med DAPI, Scale bar = 50 mikrometer). B. abortus uttrykker DsRed og tetR-GFP ble tillatt å gå inn HeLa-celler i 4 timer, etterfulgt av å drepe av ekstracellulære bakterier og samtidig induksjon av GFP i intracellulære bakterier med ATC i 4 timer automatisert bildeanalyse. En CellProfiler rør ble anvendt for å detektere DAPIfargede kjerner, etterfulgt av beregningen av en Voronoi-celle legeme ved radial forlengelse av kjernen med 25 bildeelementer (vist i hvitt). Bakteriene ble segmentert basert på det GFP signal. En celle ble ansett infisert hvis dens Voronoi cellelegemet overlappet med i det minste en segmentert bakteriell formål med tilstrekkelig størrelse og GFP intensitet. Den bakteriemengde i infiserte celler er illustrert ved integrering av arealet av alle segmenterte bakterielle objekter med sin Voronoi cellelegemet (enhet = piksler, NaN = ingen tall er beregnet på ikke-infiserte celler). (B) Eksempel bilder som illustrerer en reduksjon av intracellulær B. abortus (vist med antall gule bakterier) i celler transfektert med et siRNA målretting ARPC3 sammenlignet med kontrollceller som ble behandlet med egge siRNA. Antallet infiserte celler, så vel som det gjennomsnittlige antall intracellulære bakterier i infiserte celler blir redusert ved ARPC3 slå ned. (C) Kvantifisering av infeksjonsraten i HeLa-celler utarmetfor ARPC3. Dataene er representert som søylediagrammer (bar = midlere; normalisering til mock; feilfelt = standard feil av gjennomsnittet; * p <0,05, Mann-Whitney-test; n = 4). (D) Kvantifisering av bakteriemengde av infiserte HeLa celler utarmet for ARPC3. Dataene er representert som søylediagram (bar = midlere; normalisering til mock, feilfelt = standard feil av gjennomsnittet; * p <0,05, Mann-Whitney test; n = 4). Klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Supplemental Fil. 1: CP2 rørledning - skyggelegging korreksjon Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplemental Fil 2: CP2 rørledning- Endpoint analysen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplemental Fil. 3: CP2 rørledning - Entry assay Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplemental Fil. 4: Beskrivelse av moduler Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Agar (TSA) BD 236950
Tryptic Soy Broth (TSB) Fluka 22092
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Skim milk
250 ml screw cap bottle Corning 8396
DMEM Sigma-Aldrich D5796
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270 Heat-inactivated
Trypsin-EDTA (0.5%) Gibco 15400-054 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Cell Counter Merck Milipore PHCC20060 Alternative cell counting devices can be used
Greiner CELLSTAR 384-well plate Sigma-Aldrich M2062
Peelable aluminum foil Costar 6570
Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" Thermo Scientific 5840150 Alternative reagent dispenser can be used.
Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778-150
Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" BioTek ELX5016 This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil
PBS Gibco 20012
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI Roche 10236276001
Scrambled siRNA Dharmacon D-001810-10
Kif11 siRNA Dharmacon L-003317-00
ARPC3 siRNA Dharmacon L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP) Celli et al.12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.
Primer prAC090 Sigma-Aldrich TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092 Sigma-Aldrich TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2 ATCC CCL-2
ImageXpress Micro Molecular Devices  IXM IMAGING MSCOPE Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.
High-Speed Laser Auto-Focus Molecular Devices  1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objective Nikon  MRF00100 N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded
Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera Molecular Devices  1-2300-1060 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization
MetaXpress software Molecular Devices  9500-0100
LUI-Spectra-X-7 Lumencor SPECTRA X V-XXX-YZ Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)
Single Band Exciter for DAPI Semrock FF01-377/50-25
Single Band Emitter for DAPI Semrock FF02-447/60-25
Single Band Dichroic for DAPI Semrock FF409-Di03-25x36
Single Band Exciter for GFP Semrock FF02-472/30-25
Single Band Emitter for GFP Semrock FF01-520/35-25
Single Band Dichroic for GFP Semrock FF495-Di03-25x36
Single Band Exciter for RFP Semrock FF01-562/40-25
Single Band Emitter for RFP Semrock FF01-624/40-25
Single Band Dichroic for RFP Semrock FF593-Di03-25x36

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
  2. Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
  3. Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
  4. Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
  5. Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
  6. Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
  7. Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
  8. Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
  9. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
  10. Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
  11. Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
  12. Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
  13. Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
  14. von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
  15. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).

Tags

Infeksjon siRNA (small interfering RNA) RNAi (RNA interferens) høy-innhold / high-throughput screening analyse automatisert bildeanalyse fluorescens mikroskopi infeksjon cellebiologi, Intracellulær patogen HeLa-celler celle invasjon
Mikroskopi-baserte analyser for High-throughput screening av Host faktorer involvert i<em&gt; Brucella</em&gt; Infeksjon av HeLa-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casanova, A., Low, S. H.,… More

Casanova, A., Low, S. H., Emmenlauer, M., Conde-Alvarez, R., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P., Dehio, C. Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells. J. Vis. Exp. (114), e54263, doi:10.3791/54263 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter