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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en Published: August 5, 2016 doi: 10.3791/54263
Automatic Translation
*1, *1, *1,4, *1,3, 2, 2, 1
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH
* These authors contributed equally

Abstract

Las especies de Brucella son patógenos intracelulares facultativos que infectan a los animales como sus huéspedes naturales. La transmisión al hombre es más comúnmente causada por el contacto directo con animales infectados o por la ingestión de alimentos contaminados y puede conducir a infecciones crónicas graves.

Brucella puede invadir las células fagocíticas profesionales y no profesionales y replica dentro del retículo endoplasmático (ER) -derivado vacuolas. Los factores del huésped requeridos para entrar en las células huésped Brucella, la evitación de la degradación lisosomal, y la replicación en el compartimiento ER-como siguen siendo en gran parte desconocido. A continuación se describen dos ensayos para identificar los factores del huésped implicados en la entrada de Brucella y replicación en células HeLa. Los protocolos describen el uso de ARN de interferencia, mientras que los métodos de detección alternativos se podrían aplicar. Los ensayos se basan en la detección de bacterias marcadas con fluorescencia en la etiqueta fluorescente células huésped utilizando automatizadoLa microscopía de campo amplio. Las imágenes fluorescentes se analizaron mediante un análisis de tuberías imagen normalizada en CellProfiler que permite solo de puntuación infección basado en células.

En el ensayo de punto final, la replicación intracelular se mide dos días después de la infección. Esto permite que las bacterias tráfico a su nicho replicativo en que se inicia la proliferación alrededor de 12 horas después de la entrada de bacterias. Brucella que se han establecido con éxito un nicho intracelular se hace un enérgico han proliferado en el interior de las células huésped. Puesto que las bacterias intracelulares serán más numerosos que en gran medida las bacterias no replicativos extracelulares o intracelulares individuales, una cepa que expresa constitutivamente GFP se puede utilizar. La señal de GFP fuerte se utiliza entonces para identificar las células infectadas.

Por el contrario, para el ensayo de entrada es esencial diferenciar entre intracelular y las bacterias extracelulares. Aquí, se utiliza una codificación de cepa para una GFP inducible por tetraciclina. Inducciónde GFP con la inactivación simultánea de bacterias extracelulares por gentamicina permite la diferenciación entre intracelular y bacterias extracelulares en base a la señal de GFP, con sólo las bacterias intracelulares ser capaz de expresar GFP. Esto permite la detección robusta de bacterias intracelulares individuales antes de que se inicie la proliferación intracelular.

Introduction

Las especies de Brucella son gram-negativos, patógenos intracelulares facultativos pertenecientes a la clase de α-proteobacterias. Causan abortos e infertilidad en sus huéspedes naturales tales como vacas, cabras, ovejas o que resulta en graves pérdidas económicas en las zonas endémicas. La brucelosis es una de las enfermedades zoonóticas más importantes en todo el mundo que causan más de medio millón de nuevos casos de infección humana por año 1. La transmisión a humanos es causada generalmente por el contacto directo con animales infectados o por la ingestión de alimentos contaminados, tales como la leche no pasteurizada. Los síntomas de la enfermedad febril son inespecíficos, lo que provoca dificultades en el diagnóstico de la brucelosis. Si no se trata, los pacientes pueden desarrollar una infección crónica con síntomas más graves como la artritis, endocarditis y la neuropatía 2.

En el nivel celular Brucella es capaz de invadir las células fagocíticas y no fagocíticas y se replica dentro de un intracelularcompartimento conocida como la Brucella -Con vacuola (BCV). La internalización de bacterias requiere reordenamientos del citoesqueleto de actina por Rac, Rho, y la activación directa de Cdc42 3. Dentro de la célula huésped eucariota, el BCV transita a lo largo de la vía endocítica y pese a la interacción con los lisosomas, las bacterias logran evitar la degradación 4. Se requiere la acidificación del BCV por el vesicular ATPasa para inducir la expresión del sistema de secreción de tipo IV bacteriana (T4SS) 5. Se cree que los efectores bacterianas secretadas por el T4SS son esenciales para Brucella a establecer su nicho replicativo, ya que la deleción de la T4SS 6 o la inhibición de la ATPasa vesicular de plomo a defectos en el establecimiento del nicho intracelular 7. Las bacterias no se multiplican durante la fase de tráfico hasta que se llegar a un compartimiento vacuolar derivados del ER 8. Una vez que se produce la proliferación intracelular, el BCV se encuentra en close asociación con marcadores ER como calnexina y la glucosa-6-fosfatasa 6.

Los mecanismos moleculares por los que entra en las células Brucella, evita la degradación lisosomal y, finalmente, se replica en un compartimento de ER-como siguen siendo en gran medida desconocido. Los factores del huésped implicados en diferentes pasos de la infección principalmente han sido identificados por los enfoques dirigidos o una pequeña pantalla pequeña escala ARN de interferencia (siRNA) realizado en células de Drosophila 9. Estos han arrojado luz sobre la contribución de los factores del huésped durante la infección por Brucella pero aún estamos lejos de una comprensión global de todo el proceso.

A continuación, se presentan los protocolos que permiten la identificación de los factores del huésped humano usando interferencia de ARN de cribado a gran escala (RNAi) en combinación con microscopía de fluorescencia de campo amplio y análisis automatizado de imágenes automatizado. Reverse transfección siRNA de células HeLa se realizó como se described anterior 10,11 con modificaciones menores. El ensayo de punto final cubre una gran parte del ciclo de vida intracelular Brucella excepto la salida y la infección de las células vecinas. Para caracterizar adicionalmente los accesos identificados en el ensayo de punto final, se utiliza un protocolo modificado para identificar los factores que intervienen en los primeros pasos de la infección.

Una cepa de Brucella abortus que expresa constitutivamente GFP se utiliza para el ensayo de punto final donde se permite a las bacterias para infectar las células durante dos días. Durante este tiempo, las bacterias entran en las células, el tráfico con el nicho replicativo derivados del ER, y se replican en el espacio peri-nuclear. Los altos niveles de la señal de GFP entonces se pueden utilizar para detectar de forma fiable las células individuales que contienen las bacterias que se replican.

Para estudiar entrada Brucella en un ensayo de alto rendimiento, es importante ser capaz de distinguir entre las bacterias intracelulares y extracelulares. El método que aquí se presenta circumvpadres tinción de anticuerpos diferencial de bacterias intracelulares y extracelulares. Se basa en una cepa Brucella expresar una GFP inducible por tetraciclina en combinación con la expresión constitutiva de dsRed. La presencia de un marcador dsRed constitutiva permite la identificación de todas las bacterias que están presentes en la muestra. expresión de GFP es inducida por la adición de la anhidrotetraciclina análogo de tetraciclina no tóxico (ATC) simultáneamente con la inactivación de bacterias extracelulares por gentamicina (Gm). Mientras que el antibiótico Gm impermeable a las células mata las bacterias extracelulares, el ATC puede entrar en la célula huésped e inducir la expresión de GFP selectivamente en bacterias intracelulares. Esta doble reportero permite la separación sólido de bacterias intracelulares individuales (GFP) y de la señal dsRed de bacterias extracelulares (única señal DSred) mediante microscopía de campo amplio. Con el fin de llegar a la expresión de GFP detectable por intracelular Brucella hemos encontrado que 4 h de inducción por el ATC resulta en una RELIseñal de poder. Regímenes de inducción similares para expresar selectivamente GFP en las bacterias intracelulares se ha utilizado previamente para estudiar Shigella intracelular 12.

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Protocol

Nota: Todo el trabajo con cepas de Brucella abortus en vivo debe ser realizado dentro de un laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (NBS3) teniendo en cuenta todas las normas requeridas y las precauciones de seguridad.

1. Preparación de las placas de detección y cultivo de bacterias y células

  1. Preparación de Brucella abortus cultivos iniciadores
    1. Racha de Brucella abortus 2308 (B. abortus) de -80 ° C leche stock en una placa de agar tripticasa de soja (TSA) que contiene 50 mg / ml de kanamicina (TSA / Km). Incubar la placa durante 3-4 días a 37 ° C. Utilice Brucella abortus cepa 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 para el ensayo de punto final y la tensión de Brucella abortus pAC042.08 (apht :: dsRed, teto :: tetR-GFP) para el ensayo de entrada.
      Nota: El lipopolisacárido liso (LPS) de Brucella abortus es un importante determinante de virulencia pero mutantes en bruto puede ocurrir a frecuencias relativamente altas 14. Wpor lo tanto e recomiendan probar el estado de la cepa de cultivo antes de comenzar con este experimento.
    2. bacterias Restreak sobre cuatro placas de TSA / Km que cubren el plato lleno y se incuban durante 2-3 días a 37 ° C.
    3. Con un asa de plástico desechable, la transferencia y volver a suspender las bacterias de las placas de TSA / Km en 10 ml de 10% de leche desnatada en autoclave. Asegúrese de que las bacterias se volvieron a suspender bien para asegurar concentraciones bacterianas consistentes en todos los cultivos iniciadores.
    4. Alícuotas de 250 l de la suspensión bacteriana en 2 ml tubos con tapón de rosca y se congelan a -80 ° C.
    5. Descongelar una alícuota del cultivo iniciador y la transferencia de 25 l, 50 l y 100 l de cultivo iniciador bacteriano para separar 250 ml tornillo botellas de tapa con 50 ml de caldo de soja tríptico (TSB) que contienen 50 mg / ml de kanamicina (TSB / Km) . Sellar las botellas con Parafilm.
    6. Incubar las botellas durante la noche en un agitador orbital a 100 rpm y 37 ° C.
    7. Se mide la densidad óptica a 600 nm (OD 600) para determinar el volumen de cultivo iniciador requerida para alcanzar una DO 600 = 0,8 a 1,1 después del cultivo durante la noche.
  2. Preparación de las células HeLa
    1. Se cultivan las células HeLa en Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) (DMEM / 10% FCS) en un incubador húmedo 37 ° C con 5% de CO 2. Se cultivan las células a 80% de confluencia.
  3. Preparar las placas protectoras con siRNAs.
    1. Diluir siRNAs en RNasa libre de agua a una concentración final de 0,32 M. Transferir 5 l / pocillo para placas de 384 pocillos negras clara pocillos de fondo plano.
      1. Utilice columnas 1, 2, 23, y 24 para los controles estándar. Para los controles negativos, utilizar no dirigidos siRNA (codificados) y simulacros de pozos sin siRNAs (reactivo de transfección solamente). Para los controles de transfección, utilizar un siRNA que induce la muerte celular (KIF11), así como los controles positivos de los factores del huésped conocidos implicados en la infección por Brucella (por ejemplo, ARPC3,un componente del complejo Arp2 / 3 implicado en la polimerización de actina). Transferir disponibles comercialmente bibliotecas siRNA o siRNAs personalizados a los pocillos restantes.
      2. placas de sellado con láminas de aluminio desprendibles. placas, almacenarlas a -20 ° C.
        Nota: Las placas pueden ser almacenadas a -20 ° C durante al menos 6 meses y hasta años, dependiendo de las recomendaciones del fabricante.

2. Invertir siRNA transfección

  1. Descongelar una placa de color negro de 384 pocillos por centrifugación a 300 xg durante 20 min a temperatura ambiente.
    Nota: Esta hará bajar todo el líquido que podría adherirse a la tapa o el lado de los pocillos.
  2. Preparar el medio de transfección por dilución de la transfección reactivo 1: 200 en DMEM sin FCS a temperatura ambiente. Preparar el medio de transfección no más de 20 min antes de su uso. Con cuidado, mezclar la solución antes de su uso.
  3. Añadir 25 l medio de transfección a cada pocillo usando un dispensador de reactivosy mezclar las soluciones moviendo la placa hacia atrás y adelante.
  4. Incubar la placa durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir siRNA / transfección formación del complejo reactivo.
  5. Mientras tanto, preparar células HeLa por lavado de las células sub-confluente de un matraz de 75 cm 2 una vez con 2,5 ml 0,05% de tripsina-EDTA en PBS (tripsina).
  6. Añadir 1,5 ml de tripsina fresca y transferir el matraz a 37 ° C durante 2-3 min hasta que las células completan.
  7. Resuspender las células en 10 ml pre-calentado DMEM / 16% FCS.
  8. Recuento de células usando un contador de células automatizado y preparar una suspensión de células de 10.000 células / ml en DMEM / 16% FCS.
  9. Añadir suspensión de células 50 l a cada pocillo usando un dispensador de reactivos resultante en 500 células / pocillo.
  10. Mover la placa de un lado a otro para lograr una distribución uniforme de las células. Deje la placa a temperatura ambiente durante 5-10 minutos para permitir que las células se calmen.
  11. Sellar la placa con parafilm y se incuba durante 72 horas en una de aluminio pre-calentadoplaca en una incubadora a 37ºC húmedo con 5% de CO 2.
    Nota: La placa de aluminio pre-calentado permite una distribución igual de temperatura a lo largo de toda la placa de 384 pocillos.

3. La infección y la fijación

  1. Un día antes de la infección, inocular la cantidad determinada en 1.1.7 de B. abortus cultivo iniciador en 50 ml de TSB / Km medio en unos 250 ml de tornillo de la cápsula. Sellar la botella con Parafilm y hacer crecer las bacterias durante la noche a 37 ° C y 100 rpm en un agitador orbital a OD 600 = 0,8-1,1.
  2. Medir OD 600 del cultivo bacteriano y preparar el medio de infección por dilución del cultivo bacteriano en DMEM / 10% FCS para lograr la multiplicidad deseada de infección (MOI).
    Nota: Para obtener una tasa de infección de 5 a 10% en células HeLa, se utiliza una MOI de 10.000. Una curva de valoración MOI debe realizarse para cada tipo celular para obtener las tasas de infección óptimos.
  3. Intercambiar el medio de transfección de la placa de 384 pocilloscon 50 l de medio de infección usando un lavador de placas automatizado.
  4. Centrifugar la placa de 384 pocillos a 400 x g y 4 ° C durante 20 minutos.
    Nota: Esto ayuda a sincronizar el proceso de infección.
  5. Sellar la placa con parafilm y se incuba en un plato de aluminio pre-calentado en un incubador húmedo 37 ° C con 5% de CO2 durante 4 horas.
  6. Se lavan las células con DMEM / FCS al 10% que contiene 100 mg / ml de GM para inactivar bacterias extracelulares usando el lavador de placas automatizado (utilizar 200 l de lavado / pocillo de desbordamiento).
    Nota: Durante un lavado de desbordamiento, el lavador de placas automatizado dispensa y aspira medio al mismo tiempo.
  7. Para el ensayo de entrada, lavar las células una segunda vez con DMEM / 10% FCS que contiene 100 mg / ml de GM y 100 ng / ml ATC usando el lavador de placas automatizado (utilizar 200 l de lavado / pocillo de desbordamiento).
  8. Sellar la placa con Parafilm y devolverlo a una placa de aluminio pre-calentado en la incubadora húmeda de 37 ° C con 5% de CO2 durante otra40 horas o 4 horas, para el ensayo de punto final y el ensayo de entrada, respectivamente.
  9. Para la fijación, lavar los pocillos con PBS utilizando el lavador de placas automatizado (utilizar 200 l de lavado / pocillo de desbordamiento).
  10. Cambio de PBS con 50 l 3,7% de paraformaldehído en 0,2 M de HEPES a pH 7,4 (PFA) utilizando el lavador de placas automatizado.
    Nota: Precaución: PFA es tóxico por inhalación, contacto con la piel y por ingestión.
  11. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
  12. Intercambiar el medio de fijación con 50 l de PBS usando el lavador de placas automatizado. Nota: Las muestras están ya listos para ser sacada de la NBS3 si es necesario.
    Precaución: La eliminación de cualquier muestra de una instalación NBS3 está sujeta a la evaluación del riesgo y la validación del procedimiento y depende de la normativa aplicable en materia de bioseguridad.

4. La tinción

  1. Lavar las células dos veces con 50 l de PBS.
  2. Permeabilizar las células en 50 l 0,1% de Triton-X-100 en PBS durante 10 min.
  3. Wcélulas de ceniza tres veces con PBS. Añadir 20 l de PBS que contenía DAPI 1 mg / ml (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
  4. Lavar las células tres veces en PBS y proteger la tinción de la luz con una lámina de aluminio.

5. Imaging

  1. Configurar el microscopio de campo amplio automatizado para la adquisición de imágenes.
    Nota: La configuración de un microscopio ImageXpress Molecular Device utilizando el software MetaXpress se describen a continuación. dispositivos de microscopía de campo amplio 2D alternativos con especificaciones de hardware y software de formación de imágenes se pueden utilizar (véase la Tabla de Materiales / Equipos para más detalles).
    1. Seleccionar objetivo de 10X, cámara de intervalos = 1, la ganancia = 1.
    2. Seleccione el formato de placa correspondiente a la placa de 384 pocillos.
    3. Adquirir 9 sitios por pocillo.
    4. Use "Activar enfoque basado en láser" y "Centrarse en el plato y el fondo del pozo".
    5. Ajuste "En primer lugar, así" como el pozo inicial dela búsqueda de la muestra y "Todos los sitios" para el enfoque automático sitio.
    6. Utilizar el canal de DAPI para establecer manualmente para el enfoque de compensación Z.
    7. seleccionar manualmente el Z-Desplazamiento desde DAPI para todos los demás canales.
    8. corregir manualmente el tiempo de exposición para todos los canales para asegurar un amplio rango dinámico con baja exposición.
      1. Adquirir una imagen de un sitio representativo que usa la función de auto-exposición. Use este tiempo de exposición a la imagen 3-5 sitios a través de la placa y ajustar el tiempo de exposición manualmente hasta que los píxeles más brillantes llegan a ~ 80% de la luminosidad máxima sobre todos los sitios.
    9. La imagen de la placa por completo el uso de los canales DAPI y GFP para el ensayo de punto final. Para el ensayo de entrada de seleccionar el canal de RFP, además.

6. Automatizado de Análisis de Imágenes

Nota: CellProfiler 2 15 se emplea como software de análisis de imágenes para segmentar celular y objetos bacterianas y llevar a cabo automatizado measurelemen- dentro de los objetos identificados. El software proporciona algoritmos de análisis de imagen en módulos individuales, que se pueden combinar en una tubería que va a ejecutar los módulos de forma consecutiva en todas las imágenes, para realizar automáticamente una tarea específica de análisis de imágenes. Para seguir el protocolo, instale CellProfiler 2.1.1 o una versión más reciente. A continuación, cargar la tubería proporcionado y siga las instrucciones a continuación para ajustar los parámetros requeridos dentro de los módulos. Una descripción de los módulos individuales de todas las tuberías se puede encontrar en los archivos de consulta.

Nota: dos tuberías separadas se utilizan para cada ensayo. La primera tubería calcula un modelo de sombreado, que se utiliza por la segunda tubería para corregir las imágenes antes del análisis. Corrección de sombra se aplica a las imágenes para reducir los efectos de una trayectoria de la luz no homogénea del microscopio. Computar el modelo de sombreado en la primera tubería es un proceso largo, pero los resultados serán de mayor precisión.

    <Ensayo li> Punto de llegada
    1. Calcular el modelo de sombreado
      1. Ir al menú "Archivo", seleccione "Importar" → "Pipeline desde archivo ..." y seleccione la tubería proporcionada "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Cuando se le pregunta si desea convertir la tubería legado, responda "No convierta".
      2. Ir a "Salida" → "Ver la configuración de salida" y seleccione una carpeta de entrada con las imágenes y una carpeta de salida para los modelos de sombreado resultantes.
      3. En el Módulo (1) "LoadImages", ajustar el nombre del "texto que estas imágenes tienen en común" para que coincida con los nombres de las imágenes.
      4. Asegúrese de que ninguno de los módulos de mostrar su pantalla antes de ejecutar el análisis completo desactivando todos los símbolos del ojo al lado de los módulos. Nota: Esto disminuye significativamente recursos computacionales requeridos durante el procesamiento de la tubería.
      5. Pulse el botón "Analizar las imágenes" para iniciar el cálculo del modelo de sombreado.
      6. Análisis de Imágenes de gestión
        1. Ir al menú "Archivo", seleccione "Importar" → "Pipeline desde archivo ..." y seleccione la tubería proporcionada "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Cuando se le pregunta si desea convertir la tubería legado, responda "No convierta".
        2. Ir a "Salida" → "Ver la configuración de salida" y seleccione una carpeta de entrada con las imágenes y una carpeta de salida para la hoja de cálculo resultante.
        3. En el módulo (1) "LoadImages", ajustar el nombre del "texto que estas imágenes tienen en común" para que coincida con los nombres de las imágenes.
        4. En el módulo (2) "LoadSingleImage", cargar los modelos de sombreado, calculados conforme a 6.1.1 mediante la selección de la ubicación y los nombres de archivo de los dos modelos de sombreado.
        5. En los módulos (4) - (5) "ImageMath", ajustar el parámetro "Multiplicar la primera imagen de" búsqueda de la profundidad de bits de la cámara microscopio. Para 8 y 16 bitsimágenes configurar el parámetro como "1.0", para 12 bits de imágenes configurar el parámetro como "16.0".
        6. En el módulo (9) "ImageMath" ajustar el parámetro "Multiplicar la segunda imagen" a un valor (empezar con 0,25) que suprimirá la señal de Brucella en el DAPI sin suprimir los Núcleos.
          1. Haga clic en "modo de prueba Inicio", a continuación, activar el símbolo de pausa y la función de visualización para el módulo (9) haciendo clic en los iconos correspondientes del módulo.
            Nota: El símbolo de pausa aparecerá en color amarillo, mientras que el símbolo del ojo mostrará un ojo abierto si está activado.
          2. Haga clic en "Ejecutar" para ejecutar el análisis hasta el módulo (9) con el símbolo de pausa activa. Para poner a prueba los valores para el módulo, pulse "Paso".
          3. Haga clic en la imagen de reciente apertura y ajuste "contraste de imagen" a "Log normalizada". Repetidamente un paso atrás al módulo (9), ajustar el parámetro "Multiplicar la segunda imagen", y pasar por encima de tél módulo de nuevo, hasta que la señal Brucella está totalmente suprimida mientras que en las mismas áreas negras de tiempo que indican un exceso de la resta se reducen al mínimo la imagen resultante en.
        7. En el módulo (10) "IdentifyPrimaryObjects", ajuste el parámetro "Límite inferior en el umbral de" lo suficientemente alto (comenzar con cero) de modo que los núcleos están segmentados y el fondo se ignora.
          1. Para identificar una buena relación calidad-módulo (10), el paso sobre el módulo y mostrar la imagen de entrada, como se explica en los pasos 6.1.2.6.1 y 6.1.2.6.2.
          2. Haga clic en la imagen de entrada y visualizar el histograma.
            Nota: El pico del histograma indica típicamente fondo.
          3. A partir de la intensidad de fondo aumente el parámetro hasta que se consigue una buena segmentación de núcleos como se muestra la imagen de salida.
            Nota: Si establece un umbral más alto que la intensidad de fondo es especialmente importante para los sitios vacíos.
        8. En el módulo (15)4; FilterObjects ", ajuste el parámetro" Valor mínimo ", de modo que las células con Brucella claramente visible en el núcleo se mantienen, y todos los demás se filtraron En este paso, hacer caso omiso de Brucella fuera del núcleo..
          1. Para identificar una buena relación calidad-precio, el paso sobre el módulo y mostrar la imagen de salida, como se explica en los pasos 6.1.2.6.1 y 6.1.2.6.2. Empezar desde cero, lo que identifica a todas las células como infectado y aumentar el valor en pequeños pasos hasta que sólo las células con Brucella claramente visible en el núcleo se mantienen.
        9. En el módulo (16) "FilterObjects", ajustar el parámetro "Valor mínimo", por lo que se mantienen las células con Brucella claramente visible en las perinucleus, y todas las demás células se filtran de distancia. Utilice un enfoque similar como en el módulo anterior.
        10. En el módulo (17) "FilterObjects", ajustar el parámetro "Valor mínimo", de modo que las células con Brucella claramente visible en el Voronoi cuerpo celular se mantienen, y todas las demás células se filtran de distancia. Utilice un enfoque similar como en el módulo anterior.
          Nota: El cuerpo de la celda de Voronoi es una extensión radial del núcleo por 25 píxeles sin que se solapen con los cuerpos celulares de Voronoi vecino.
        11. Salir del modo de prueba y asegurarse de que ninguno de los módulos de mostrar su pantalla antes de ejecutar el análisis completo desactivando todos los símbolos del ojo al lado de los módulos.
          Nota: Esto disminuye significativamente recursos computacionales requeridos durante el procesamiento de la tubería.
        12. Pulse el botón "Analizar las imágenes" para iniciar el análisis.
        13. Cuando el análisis ha terminado, inspeccionar las imágenes PNG resultantes, así como la hoja de CSV para asegurar que el análisis funcionaba de forma fiable a lo largo de la placa.
    2. Ensayo de entrada
      1. Calcular el modelo de sombreado
        1. Ir al menú "Archivo", seleccione "Importar" → "Pipeline desde archivo ..." y seleccione el proporcionard tubería "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Cuando se le pregunta si desea convertir la tubería legado, responda "No convierta".
        2. Ir a "Salida" → "Ver la configuración de salida" y seleccione una carpeta de entrada con las imágenes y una carpeta de salida para los modelos de sombreado resultantes.
        3. En el módulo (1) "LoadImages", ajustar el nombre del "texto que estas imágenes tienen en común" para que coincida con los nombres de las imágenes.
        4. Asegúrese de que ninguno de los módulos de mostrar su pantalla antes de ejecutar el análisis completo desactivando todos los símbolos del ojo al lado de los módulos.
          Nota: Esto disminuye significativamente recursos computacionales requeridos durante el procesamiento de la tubería.
        5. Pulse el botón "Analizar las imágenes" para iniciar el cálculo del modelo de sombreado.
      2. Análisis de Imágenes de gestión
        1. Ir al menú "Archivo", seleccione "Importar" → "Pipeline desde archivo ..." y seleccione el provided tubería "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Cuando se le pregunta si desea convertir la tubería legado, responda "No convierta".
        2. Ir a "Salida" → "Ver la configuración de salida" y seleccione una carpeta de entrada con las imágenes y una carpeta de salida para la hoja de cálculo resultante.
        3. En el módulo (1) "LoadImages", ajustar el nombre del "texto que estas imágenes tienen en común" para que coincida con los nombres de las imágenes.
        4. En el módulo (2) "LoadSingleImage", cargar los modelos de sombreado calculados en el punto 6.2.1 mediante la selección de la ubicación y los nombres de archivo de los dos modelos de sombreado.
        5. En los módulos (4) - (5) "ImageMath", ajustar el parámetro "Multiplicar la primera imagen de" búsqueda de la profundidad de bits de la cámara microscopio. Por 8 y 16 bits de imágenes configurar el parámetro como "1.0", para imágenes de 12 bits establecer el parámetro a "16,0".
        6. En el módulo (6) "IdentifyPrimaryObjects", ajuste el parámetro "Lower obligado en el umbral de "lo suficientemente alto que sólo los núcleos están segmentados y el fondo se ignora.
          1. Para identificar una buena relación calidad-módulo (6), el paso sobre el módulo y mostrar la imagen de entrada, como se explica en los pasos 6.1.2.6.1 y 6.1.2.6.2.
          2. Haga clic en la imagen de entrada y visualizar el histograma.
            Nota: El pico del histograma indica típicamente fondo.
          3. A partir de la intensidad de fondo aumente el parámetro hasta que se consigue una buena segmentación de núcleos como se muestra la imagen de salida.
            Nota: Ajuste del umbral por encima del fondo es importante para los sitios vacíos.
        7. En el módulo (8) "IdentifyPrimaryObjects", ajuste el parámetro "Límite inferior en el umbral de" lo suficientemente alto que sólo Brucella de manera segmentada y de fondo se ignora.
          1. Para identificar una buena relación calidad-módulo (8), el paso sobre el módulo y mostrar la imagen de entrada, como se explica en los pasos 6.1.2.6.1 y 6.1.2.6.2.
          2. Haga clic en la imagen de entrada y visualizar el histograma.
            Nota: El pico del histograma indica típicamente fondo.
          3. A partir de la intensidad de fondo aumente el parámetro hasta que se consigue una buena segmentación de Brucella como muestra la imagen de salida.
            Nota: Ajuste del umbral por encima del fondo es importante para los sitios vacíos.
        8. En el módulo (11) "FilterObjects", ajustar el parámetro "Valor mínimo" para que el fondo y los artefactos se filtran de distancia, y sólo colonias de Brucella se mantienen.
          1. Para identificar una buena relación calidad-precio, el paso sobre el módulo y mostrar la imagen de salida, como se explica en los pasos 6.1.2.6.1 y 6.1.2.6.2. Comience con el valor seleccionado en 6.2.2.7 y en etapas aumentarla hasta que se mantienen sólo los objetos de Brucella.
        9. Salir del modo de prueba y asegúrese de que ninguno de los módulos de mostrar su pantalla antes de ejecutar el análisis completo por CNUMAHcking todos los símbolos de ojo junto a los módulos.
          Nota: Esto disminuye significativamente recursos computacionales requeridos durante el procesamiento de la tubería.
        10. Pulse el botón "Analizar las imágenes" para iniciar el análisis.
        11. Cuando el análisis ha terminado, inspeccionar las imágenes PNG resultantes, así como la hoja de CSV para asegurar que el análisis funcionaba bien a lo largo de la placa.

    7. Infección de puntuación

    Nota: siRNAs que tienen un impacto significativo sobre la viabilidad de las células tienen que ser considerados con cautela, ya que esto puede promover descubrimientos falsos positivos. Un número celular alterada afecta a la MOI real y la orientación de los genes esenciales puede tener efectos pleiotrópicos sobre la infección por patógenos. Mientras que el agotamiento incompleto de siRNAs permite el estudio de los genes esenciales, tales objetivos han de ser validado por métodos alternativos (por ejemplo, la interferencia farmacéutica) para corroborar su papel como factores del huéspeddurante la infección.

    1. Ensayo de punto final
      1. Abra la hoja de CSV generado en la etapa 6.1.2.12 y calcular una tasa de infección por bien dividiendo el número de células infectadas (CellProfiler lectura: "Count_InfectedCells") por el número total de células (CellProfiler lectura: "CountNuclei"). Si han obtenido imágenes múltiples sitios por pocillo, resumir en primer lugar todos los lugares para cada pozo, para construir un número por cada pocillo de células infectadas y un número total así per-de las células.
      2. Realizar la normalización de puntuación Z para dar cuenta de las variaciones de placa a placa si las placas contienen suficiente no golpear siRNAs. Supongamos que un número suficiente de no-hit siRNAs por placa si se criban bibliotecas completas.
        Ecuación 1
    2. Ensayo de entrada
      1. Abra la hoja de CSV generado en la etapa 6.2.2.10 y calcular una tasa de infección por así dividiendo el número de células infectadas (lectura CellProfiler: "Count_InfectedCeLLS ") por el número total de células (lectura CellProfiler:". CountNuclei ") Si se han fotografiado varios sitios por pocillo, se resumen en primer lugar todos los lugares para cada pozo, para construir un número por cada pocillo de células infectadas y por pocillos número total de células.
      2. Para cuantificar la carga bacteriana de las células infectadas, estimar el área media ocupada por bacterias intracelulares por célula infectada. Con este fin, dividir el área integrada de todas las bacterias intracelulares se solapan con las células (CellProfiler lectura: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") por el número de células infectadas en este sitio. Para dar cuenta de artefactos, utilizar la mediana de todos los sitios de esta lectura como la lectura también.
        Nota: Si este ensayo se utiliza como un ensayo de seguimiento que contiene un gran número de genes implicados en la infección por Brucella, no se aplican Z puntuación de normalización. En su lugar, lleve a cabo la normalización utilizando pozos simulados como referencia para tener en cuenta la variación de placa a placa.

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Representative Results

La Figura 1A muestra un ejemplo de análisis de imágenes se utiliza para identificar automáticamente las células infectadas en el ensayo de punto final. se identificaron núcleos de las células HeLa teñidas con DAPI, se calcularon una peri-núcleo de anchura 8 píxeles que rodea el núcleo, y un cuerpo celular Voronoi por extensión del núcleo por 25 píxeles. Puesto que las bacterias proliferan principalmente en el espacio peri-nuclear, la intensidad de GFP en este área de la célula es la medida más robusta para discriminar entre células infectadas y no infectadas. En algunos casos, se encuentran bacterias proliferando fuera de la peri-núcleo o superposición en gran medida con el núcleo. Por lo tanto, estos dos objetos adicionales también se consideraron para la identificación de las células infectadas. La segmentación, así como mediciones de la intensidad de GFP se realizaron con el software de análisis de imágenes CellProfiler 2.

Brucella 3. Por lo tanto, el agotamiento de los componentes de remodelación de actina es un control positivo adecuado para el cribado siRNA. Hemos encontrado que siRNA mediada por el agotamiento de Arp2 / 3 componentes complejos, que están implicadas en la polimerización de actina, inhibe fuertemente la infección por Brucella de células HeLa (datos no publicados). Por lo tanto, se utilizó desmontables de ARPC3 como control positivo. Como se ve en la Figura 1B, el agotamiento de ARPC3 redujo el número de células que muestran la proliferación de las bacterias dos días después de la infección. La aplicación de la tubería de análisis de imagen automatizado para estas imágenes permite la cuantificación del efecto observado (Figura 1C). Los datos que se muestran aquí se originan en los pocillos de control de una pantalla de siRNA en todo el genoma. Z puntuación se aplicó para tener en cuenta las variaciones de placa a placa.

La Figura 2A ilustra la ianálisis mago utiliza para identificar las células infectadas y medir la carga bacteriana intracelular en el ensayo de entrada. En contraste con el ensayo de punto final, el ensayo de entrada utiliza la segmentación bacteriana y un cuerpo celular Voronoi como objeto celular. Sólo se utiliza la señal de GFP intracelular de Brucella para segmentar el patógeno en esta tubería de análisis de imágenes. bacterias intracelulares fueron definidos por un tamaño mínimo de 2 píxeles y una intensidad de GFP que supera la intensidad de fondo GFP tenue de las bacterias extracelulares. Una célula se consideró infectado si al menos un objeto bacteriana intracelular se superponen con su cuerpo de la celda de Voronoi. Además, la carga bacteriana se estimó mediante el cálculo de la superficie media de las células infectadas que está cubierta por bacterias intracelulares.

Como para el ensayo de punto final, el agotamiento de ARPC3 mostró una reducción en la infección por Brucella en el ensayo de entrada en comparación con células tratadas con un concontrol de siRNA (Figura 2B). La cuantificación de la tasa de infección confirmó que el número de células infectadas (Figura 2C), así como el número de bacterias intracelulares en las células infectadas (Figura 2D) se redujo por el agotamiento de ARPC3.

Figura 1
Figura 1: Análisis de células HeLa infectadas por B. abortus que expresan GFP en el ensayo de punto final (A) de ensayo de punto final:. imagen de fluorescencia que muestra un ejemplo del ensayo de punto final (verde = B. abortus que expresan GFP, azul = núcleos teñidos con DAPI, barra de escala = 50 m). GFP expresando B. abortus se les permitió entrar en las células HeLa durante 4 horas seguido de la matanza de bacterias extracelulares por GM. Además de la incubación durante 40 hr bacterias permitido para replicar dentro de las células HeLa. Automatizado analysi imagen s: Una tubería CellProfiler se utilizó para núcleos segmento DAPI manchado, seguido de cálculo de la peri-núcleo (que no se solapan anillo de 8 píxeles que rodean el núcleo) y cuerpo celular Voronoi (que no se solapan extensión radial del núcleo por 25 píxeles), tanto se muestra en rojo. Una célula infectada se consideró si la intensidad de GFP integrado en al menos un compartimento celular (núcleo, peri-núcleo, cuerpo de la celda de Voronoi) supera el umbral correspondiente. (B) Imágenes representativas de células HeLa infectadas con B. abortus que expresan GFP 44 horas después de la infección. Las células fueron transfectadas ya sea con un (no-targeting) de control revueltos siRNA o un siRNA dirigidos ARPC3. Barra de escala = 50 micras. (C) Cuantificación de la infección de células HeLa empobrecido para ARPC3. Los datos se representan como gráficos de barras (barra = media; Z puntuación de normalización; barras de error = error estándar de la media; *** p <0,001; prueba de Mann-Whitney; n = 7).en / ftp_upload / 54263 / 54263fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: La cuantificación de la infección de células HeLa por B. . abortus expresan TetR-GFP en el ensayo de entrada (A) Ensayo de Entrada: Imagen de fluorescencia que muestra un ejemplo de ensayo de entrada (amarillo = intracelular de B. abortus mostrando dsRed y la señal de GFP, rojo = extracelular de B. abortus que muestra la señal dsRed, azul = núcleos teñidas con DAPI, barra de escala = 50 micras). B. abortus expresar dsRed y TetR-GFP se les permitió entrar en las células HeLa durante 4 horas seguido de la matanza de bacterias extracelulares e inducción simultánea de GFP en las bacterias intracelulares con el ATC durante 4 horas el análisis automatizado de imágenes:. Se utilizó una tubería CellProfiler para detectar DAPInúcleos teñidos, seguido de cálculo de un cuerpo celular Voronoi por extensión radial del núcleo por 25 píxeles (muestran en blanco). Las bacterias fueron segmentados sobre la base de la señal de GFP. Una célula se consideró infectado si su cuerpo celular Voronoi se superponen con al menos un objeto bacteriana segmentado de tamaño suficiente y la intensidad de GFP. La carga bacteriana en las células infectadas se ilustra por la integración de la zona de todos los objetos segmentados bacterianas con su cuerpo de la celda de Voronoi (unidad = pixels; NaN = sin número se calcula en las células no infectadas). (B) Ejemplo de imágenes que ilustra una disminución intracelular de B. abortus (que se muestra por el número de bacterias de color amarillo) en las células transfectadas con un siRNA dirigidos ARPC3 en comparación con las células de control tratadas con siRNA revueltos. El número de células infectadas, así como el número medio de bacterias intracelulares en las células infectadas se reduce a ARPC3 derribar. (C) Cuantificación de la tasa de infección en células HeLa agotadopara ARPC3. Los datos se representan como gráficos de barras (barra = media; la normalización de simulacro; barras de error = error estándar de la media; * p <0,05; prueba de Mann-Whitney; n = 4). (D) La cuantificación de la carga bacteriana de las células HeLa infectadas empobrecido para ARPC3. Los datos se representan como gráficos de barras (barra = media; normalización para burlarse; barras de error = error estándar de la media; prueba de Mann-Whitney;; * p <0,05 n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario. 1: CP2 oleoducto - corrección de sombreado Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Suplementario 2: Tubería CP2- Punto final del ensayo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario. 3: tubería CP2 - ensayo de entrada Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario. 4: Descripción de los módulos Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Agar (TSA) BD 236950
Tryptic Soy Broth (TSB) Fluka 22092
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Skim milk
250 ml screw cap bottle Corning 8396
DMEM Sigma-Aldrich D5796
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270 Heat-inactivated
Trypsin-EDTA (0.5%) Gibco 15400-054 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Cell Counter Merck Milipore PHCC20060 Alternative cell counting devices can be used
Greiner CELLSTAR 384-well plate Sigma-Aldrich M2062
Peelable aluminum foil Costar 6570
Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" Thermo Scientific 5840150 Alternative reagent dispenser can be used.
Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778-150
Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" BioTek ELX5016 This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil
PBS Gibco 20012
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI Roche 10236276001
Scrambled siRNA Dharmacon D-001810-10
Kif11 siRNA Dharmacon L-003317-00
ARPC3 siRNA Dharmacon L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP) Celli et al.12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.
Primer prAC090 Sigma-Aldrich TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092 Sigma-Aldrich TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2 ATCC CCL-2
ImageXpress Micro Molecular Devices  IXM IMAGING MSCOPE Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.
High-Speed Laser Auto-Focus Molecular Devices  1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objective Nikon  MRF00100 N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded
Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera Molecular Devices  1-2300-1060 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization
MetaXpress software Molecular Devices  9500-0100
LUI-Spectra-X-7 Lumencor SPECTRA X V-XXX-YZ Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)
Single Band Exciter for DAPI Semrock FF01-377/50-25
Single Band Emitter for DAPI Semrock FF02-447/60-25
Single Band Dichroic for DAPI Semrock FF409-Di03-25x36
Single Band Exciter for GFP Semrock FF02-472/30-25
Single Band Emitter for GFP Semrock FF01-520/35-25
Single Band Dichroic for GFP Semrock FF495-Di03-25x36
Single Band Exciter for RFP Semrock FF01-562/40-25
Single Band Emitter for RFP Semrock FF01-624/40-25
Single Band Dichroic for RFP Semrock FF593-Di03-25x36

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References

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Infección No. 114 siRNA (ARN interferente pequeño) el ARNi (ARN de interferencia) de alto contenido de ensayo de cribado / de alto rendimiento análisis de imágenes automatizado microscopía de fluorescencia la infección biología biología celular, Patógeno intracelular las células HeLa la invasión de células
Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en<em&gt; Brucella</em&gt; Infección de células Hela
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Casanova, A., Low, S. H.,… More

Casanova, A., Low, S. H., Emmenlauer, M., Conde-Alvarez, R., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P., Dehio, C. Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells. J. Vis. Exp. (114), e54263, doi:10.3791/54263 (2016).

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