Abstract
Brucella arter är fakultativa intracellulära patogener som infekterar djur som sina naturliga värdar. Överföring till människor orsakas oftast genom direkt kontakt med smittade djur eller genom intag av förorenad mat och kan leda till allvarliga kroniska infektioner.
Brucella kan invadera professionella och icke-professionella fagocytiska celler och replikerar inom endoplasmatiska retiklet (ER) härledda vakuoler. Värd faktorer som krävs för Brucella inträde i värdceller, undvikande av lysosomal nedbrytning, och replikering i ER liknande fack fortfarande till stor del okända. Här beskriver vi två analyser för att identifiera värd faktorer som Brucella inträde och replikation i HeLa-celler. Protokollen beskriver användningen av RNA-interferens, medan alternativa screeningmetoder kan tillämpas. De analyser är baserade på detektion av fluorescensmärkta bakterier i fluorescerande värdceller med användning av automatiseradbrett fält mikroskopi. De fluorescerande bilderna analyseras med hjälp av en standardiserad bildanalys pipeline i CellProfiler som möjliggör enkel cellbaserad infektion poäng.
I endpoint assay, är intracellulär replikation mäts två dagar efter infektion. Detta gör det möjligt för bakterier att trafik till sin replika nisch där spridning initieras ca 12 timmar efter bakteriell inträde. Brucella som framgångsrikt har etablerat en intracellulär nisch kommer således har starkt frodats i värdceller. Eftersom intracellulära bakterier kommer att kraftigt fler än enskilda extracellulära eller intracellulära icke-replikativa bakterier, kan en stam konstitutivt uttrycker GFP användas. Den starka GFP-signal används sedan för att identifiera infekterade celler.
Däremot är det för posten analysen viktigt att skilja mellan intracellulära och extracellulära bakterier. Här, är en stam som kodar för en tetracyklin-inducerbara GFP användes. Induktionav GFP med samtidig inaktivering av extracellulära bakterier genom gentamicin möjliggör differentieringen mellan intracellulära och extracellulära bakterier baserade på GFP-signal, med endast intracellulära bakterier att kunna uttrycka GFP. Detta gör den robusta detektering av enstaka intracellulära bakterier innan intracellulär spridning initieras.
Introduction
Brucella arter är gramnegativa, fakultativt intracellulära patogener som tillhör den klass av α-Proteobacteria. De orsakar aborter och infertilitet hos sina naturliga värdar såsom nötkreatur, getter, eller får som resulterar i allvarliga ekonomiska förluster i endemiska områden. Brucellos är en av de viktigaste zoonotiska sjukdomar i världen som orsakar över en halv miljon nya mänskliga infektioner årligen 1. Överföring till människa orsakas oftast genom direkt kontakt med smittade djur eller genom intag av förorenad mat såsom opastöriserad mjölk. Symptom på febril sjukdom är ospecifika, vilket medför svårigheter vid diagnos av brucellos. Om den inte behandlas, kan patienter utveckla en kronisk infektion med mer allvarliga symtom som artrit, endokardit och neuropati 2.
På cellnivå Brucella kan invadera fagocytiska och icke-fagocytiska celler och replikerar inom en intracellulärfack kallas Brucella-innehållande vakuolen (BCV). Internalisering av bakterier kräver aktincytoskelettet omflyttningar av Rac, Rho, och direkt aktivering av Cdc42 3. Inne i eukaryot värdcell, trafiksätts BCV längs den endocytiska reaktionsvägen och trots interaktionen med lysosomer, bakterier lyckas undvika nedbrytning 4. Surgörning av BCV av det vesikulära ATPas krävs för att inducera uttryck av den bakteriella typ IV sekretionssystem (T4SS) 5. Man tror att bakterie effektorer utsöndras av T4SS är avgörande för Brucella att fastställa sin replika nisch, eftersom deletion av T4SS 6 eller hämning av vesikulär ATPas leda till brister i inrättandet av den intracellulära nisch 7. Bakterier inte replikera under fasen för handel tills de nå en ER-härledd vakuolär utrymmet 8. När intracellulär spridning sker, är BCV finns i close association med ER markörer såsom kalnexin och glukos-6-fosfatas 6.
De molekylära mekanismer genom vilka Brucella träder celler, undviker lysosomal nedbrytning och slutligen replikerar i en ER-liknande fack förblir till stor del okända. Värdfaktorer som är involverade i olika steg av infektion har huvudsakligen identifierats av målinriktade strategier eller liten skala små störande RNA (siRNA) skärm utförs i Drosophila-celler 9. Dessa har belysa bidrag individuella värdfaktorer under Brucella infektion men vi är fortfarande långt ifrån en omfattande förståelse av hela processen.
Här är protokoll som möjliggör identifiering av mänskliga värdfaktorer som använder storskalig RNA-interferens (RNAi) screening i kombination med automatiserad brett fält fluorescensmikroskopi och automatiserad bildanalys presenteras. Omvänd siRNA transfektion av HeLa-celler utförs som described tidigare 10,11 med mindre modifieringar. Slutpunkten analys täcker en stor del av Brucella intracellulär livscykeln utom avstigning och infektionen av angränsande celler. För att ytterligare karaktärisera de träffar som identifierats i endpoint assay, är ett modifierat protokoll för att identifiera faktorer som är inblandade i tidiga stegen av infektionen användas.
En Brucella abortus-stam som konstitutivt uttrycker GFP används för endpoint analys där bakterier tillåts infektera celler i två dagar. Under denna tid, bakterier in i celler, trafik till ER-härledd replikativ nisch, och replikera i peri-nukleära utrymme. De höga nivåerna av GFP-signal kan sedan användas för att tillförlitligt detektera individuella celler, vilka innehåller replikerande bakterier.
Att studera Brucella post i en hög genomströmning analys är det viktigt att kunna skilja mellan intracellulära och extracellulära bakterier. Den metod som presenteras här circumvents differentiell antikroppsfärgning av intracellulära och extracellulära bakterier. Den är baserad på ett Brucella-stam som uttrycker en tetracyklin-inducerbara GFP i kombination med konstitutivt uttryck av dsRed. Närvaron av en konstitutiv dsRed markör medger identifiering av alla bakterier som finns i provet. GFP-uttryck induceras genom tillsats av den icke-toxiska tetracyklin-analog anhydrotetracyklin (ATC) samtidigt med inaktivering av extracellulära bakterier genom gentamicin (Gm). Medan cellimpermeabel antibiotikum Gm dödar extracellulära bakterier, kan ATC ange värdcellen och inducerar uttryck av GFP selektivt i intracellulära bakterier. Denna dubbla reporter gör den robusta separation av enskilda intracellulära bakterier (GFP och dsRed signal) från extracellulära bakterier (endast dsRed signal) genom att använda brett fält mikroskopi. För att nå detekterbara GFP-expression genom intracellulär Brucella har vi funnit att 4 h av induktion genom ATC resulterar i en relikunna signal. Liknande induktionssystem för att selektivt uttrycka GFP i intracellulära bakterier har tidigare använts för att studera intracellulära Shigella 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Allt arbete med levande Brucella abortus stammar skall utföras inne i en biosäkerhet nivå 3 (BSL3) laboratorium med tanke på alla nödvändiga regler och säkerhetsföreskrifter.
1. Framställning av silplattorna och Odling av bakterier och celler
- Framställning av Brucella abortus Starter Cultures
- Strimma Brucella abortus 2308 (B. abortus) från -80 ° C mjölk lager på en Tryptic Soy Agar (TSA) platta innehållande 50 | j, g / ml kanamycin (TSA / Km). Inkubera plattan under 3-4 dagar vid 37 ° C. Använd stam Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 för slutpunkten analys och stam Brucella abortus pAC042.08 (apht :: dsRed, tetO :: tetR-GFP) för posten analysen.
Obs: Den släta lipopolysackarid (LPS) av Brucella abortus är en viktig virulensdeterminant men grova mutanter kan ske vid relativt höga frekvenser 14. We rekommenderar därför att testa status av kulturstammen innan med detta experiment. - Restreak bakterier på fyra TSA / km plattor som täcker hela plattan och inkubera under 2-3 dagar vid 37 ° C.
- Med hjälp av en engångsplastögla, överföring och suspendera bakterier från TSA / km plattor i 10 ml 10% autoklaveras skummjölk. Se till att bakterierna är väl resuspenderas att säkerställa enhetliga bakteriehalter i alla startkulturer.
- Alikvot 250 | il av den bakteriella suspensionen till 2 ml med skruvlock rör och frys vid -80 ° C.
- Tina en alikvot av startkulturen och överföra 25 | il, 50 | il, och 100 | il av bakteriestartkultur för att separera 250 ml med skruvlock flaskor med 50 ml Tryptic Soy Broth (TSB) innehållande 50 | ig / ml kanamycin (TSB / Km) . Täta flaskorna med Parafilm.
- Inkubera flaskorna över natten på en orbital skakanordning vid 100 rpm och 37 ° C.
- Mät den optiska tätheten vid 600 nm (OD 600) för att fastställa omfattningen av startkultur som krävs för att nå en OD 600 = 0,8-1,1 efter odling över natten.
- Strimma Brucella abortus 2308 (B. abortus) från -80 ° C mjölk lager på en Tryptic Soy Agar (TSA) platta innehållande 50 | j, g / ml kanamycin (TSA / Km). Inkubera plattan under 3-4 dagar vid 37 ° C. Använd stam Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 för slutpunkten analys och stam Brucella abortus pAC042.08 (apht :: dsRed, tetO :: tetR-GFP) för posten analysen.
- Framställning av HeLa-celler
- Växa HeLa-celler i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS) (DMEM / 10% FCS) i en 37 ° C fuktig inkubator med 5% CO 2. Odla celler till 80% sammanflytning.
- Förbered Screening Plattor med siRNA.
- Späd siRNA i RNas-fritt vatten till en slutlig koncentration av 0,32 | iM. Transfer 5 l / brunn till svart klar väl flatbottnade 384-brunnsplattor.
- Använd kolumnerna 1, 2, 23 och 24 för standardkontroller. För negativa kontroller, använda icke-inriktade siRNA (oordning) och mock brunnar utan siRNA (transfektion endast reagens). För transfektion kontroller använda en siRNA som inducerar celldöd (KIF11), liksom positiva kontroller av kända värd faktorer som Brucella infektion (t.ex. ARPC3,en del av Arp2 / 3-komplex involverade i aktin polymerisation). Överföring till de återstående brunnarna kommersiellt tillgängliga siRNA bibliotek eller anpassade siRNA.
- Tätningsskivorna med avdragbara aluminiumfolier. Förvara plattorna vid -20 ° C.
Notera: Plattorna kan förvaras vid -20 ° C under minst 6 månader och upp till år beroende på tillverkarens rekommendationer.
- Späd siRNA i RNas-fritt vatten till en slutlig koncentration av 0,32 | iM. Transfer 5 l / brunn till svart klar väl flatbottnade 384-brunnsplattor.
2. Omvänd siRNA Transfektion
- Tina en svart 384-brunnsplatta genom centrifugering vid 300 xg under 20 min vid rumstemperatur.
Obs! Det här kommer att få ner all vätska som kan ansluta sig till locket eller på sidan av brunnarna. - Förbered transfektionsmediet genom utspädning av transfektionsreagens 1: 200 i DMEM utan FCS vid rumstemperatur. Förbereda transfektion mediet inte längre än 20 min före användning. Blanda försiktigt lösningen före användning.
- Tillsätt 25 | il transfektion medium till varje brunn med användning av en reagensfördelarenoch blanda lösningarna genom att förflytta plattan fram och tillbaka.
- Inkubera plattan i 1 h vid rumstemperatur för att tillåta siRNA / transfektionsreagens komplexbildning.
- Under tiden förbereder HeLa-celler genom att tvätta undersammanflytande celler i en 75 cm 2 kolv gång med 2,5 ml 0,05% trypsin-EDTA i PBS (trypsin).
- Tillsätt 1,5 ml färskt trypsin och överföra kolven till 37 ° C under 2-3 min tills cellerna runda upp.
- Resuspendera cellerna i 10 ml förvärmda DMEM / 16% FCS.
- Räkna celler med användning av en automatiserad cellräknare och förbereda en cellsuspension av 10000 celler / ml i DMEM / 16% FCS.
- Tillsätt 50 | il cellsuspension till varje brunn med användning av en reagensfördelaren vilket resulterar i 500 celler / brunn.
- Förflytta plattan fram och tillbaka för att uppnå jämn fördelning av cellerna. Lämnar plattan vid rumstemperatur under 5-10 min för att möjliggöra för cellerna att slå sig ner.
- Täta plattan med Parafilm och inkubera det i 72 timmar på en förvärmda aluminiumplattan i en 37 ° C fuktig inkubator med 5% CO2.
Obs: Den förvärmda aluminiumplatta tillåter distribution jämn temperatur i hela 384-brunnsplatta.
3. Infektion och Fixering
- En dag före infektion, ympa det belopp som fastställts i 1.1.7 av B. abortus startkultur i 50 ml TSB / Km-medium i en 250 ml skruvlock flaska. Försegla flaskan med Parafilm och växa bakterier över natten vid 37 ° C och 100 rpm på en orbital shaker till OD 600 = 0,8-1,1.
- Mäta OD 600 av bakteriekulturen och förbereda infektionen mediet genom spädning av bakteriekultur i DMEM / 10% FCS för att uppnå önskad mångfald av infektion (MOI).
Obs: För att få en infektion hastighet på 5-10% i HeLa-celler, är en MOI på 10.000 används. En MOI titrerkurvan bör utföras för varje celltyp att erhålla optimala infektionhastigheter. - Utbyta transfektion mediet i 384-brunnars plattamed 50 pl av infektionen mediet med användning av en automatiserad plattvätt.
- Centrifugera 384-brunnars platta vid 400 xg och 4 ° C under 20 min.
Obs: Detta bidrar till att synkronisera infektionsprocessen. - Förslut plattan med Parafilm och inkubera den på en förvärmd aluminiumplatta i en 37 ° C fuktig inkubator med 5% CO2 under 4 h.
- Tvätta cellerna med DMEM / 10% FCS innehållande 100 | ig / ml Gm att inaktivera extracellulära bakterier med användning av den automatiserade plattvättare (använd 200 | j, l / brunn överflöde tvätt).
Obs: Under ett spill tvätta, den automatiserade plattvättare doserar samtidigt och suger medium. - För posten assay, tvätta cellerna en andra gång med DMEM / 10% FCS innehållande 100 | ig / ml Gm och 100 ng / ml ATC hjälp av automatiserad plattvätt (använd 200 | j, l / brunn överflöde tvätt).
- Täta plattan med Parafilm och returnera den till en förvärmd aluminiumplåt i 37 ° C fuktig inkubator med 5% CO2 under en annan40 timmar eller 4 timmar, för endpoint analysen och posten analysen, respektive.
- För fixering, tvätta brunnarna med PBS genom att använda den automatiska plattvätt (använd 200 ul / brunn overflow tvätt).
- Exchange PBS med 50 | il 3,7% paraformaldehyd i 0,2 M HEPES vid pH 7,4 (PFA) med automatiserad platt bricka.
Obs: Varning: PFA är giftigt vid inandning, hudkontakt och förtäring. - Inkubera i 20 min vid rumstemperatur.
- Utbyta fixeringsmedium med 50 | il PBS med användning av den automatiserade plattvättare. Notera: Proverna är nu redo att tas ut från BSL3 om det behövs.
Varning: Borttagning av något prov från en BSL3 Anläggningen är föremål för riskbedömning och validering av förfarandet och beror på gällande regler för biosäkerhet.
4. Färgning
- Tvätta cellerna två gånger med 50 | il PBS.
- Permeabilize celler i 50 | il 0,1% Triton-X-100 i PBS under 10 min.
- Waska cellerna tre gånger med PBS. Tillsätt 20 | il av PBS innehållande 1 | ig / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna tre gånger i PBS och skydda färgning från ljus med en aluminiumfolie.
5. Imaging
- Ställ in automatisk brett fält mikroskop för bildtagning.
Obs: Inställningarna för en Molecular Device ImageXpress mikroskop med hjälp MetaXpress programvara beskrivs nedan. Alternativa 2D brett fält mikroskopi enheter med lämpliga hårdvara specifikationer och bildbehandlingsprogram kan användas (se tabell av material / utrustning för detaljer).- Välj 10X objektiv, kamera binning = 1, förstärkning = 1.
- Välja plattformat som motsvarar den 384-brunnar.
- Förvärva 9 platser per brunn.
- Använd "Aktivera laserbaserade fokus" och "Fokus på plattan och brunnens botten".
- Ställ in "första brunnen" som första brunn förhitta provet och "Alla platser" för plats autofokus.
- Använd DAPI kanal för att manuellt ställa in Z-Offset för fokus.
- Välj Z-Offset från DAPI för alla andra kanaler manuellt.
- korrigera manuellt exponeringstiden för alla kanaler för att säkerställa ett brett dynamiskt område med låg överexponering.
- Förvärva en bild av en representativ plats med hjälp av automatisk exponeringsfunktion. Använd denna exponeringstid bilden 3-5 platser över hela plattan och justera exponeringstiden manuellt tills ljuspunkter når ~ 80% av den maximala ljusstyrkan över alla platser.
- Bild hela plattan med hjälp av DAPI och GFP kanaler för endpoint analysen. För posten analysen väljer RFP kanal dessutom.
6. Automatiserad bildanalys
Obs: CellProfiler 2 15 används som bildanalysprogram för segmentet cellulära och bakteriella objekt och utföra automatiserad measurements inom de identifierade objekt. Programmet ger bildanalysalgoritmer i enskilda moduler, som kan kombineras i en rörledning som kommer att utföra modulerna i följd på alla bilder, för att automatiskt utföra en viss bildanalys uppgift. För att följa protokollet, installera CellProfiler 2.1.1 eller nyare version. Därefter laddar den medföljande rörledningen och följ instruktionerna nedan för att justera de parametrar som krävs inom modulerna. En beskrivning av de olika modulerna i alla rörledningar kan hittas i Supplemental filer.
Obs: Två separata rörledningar användes för varje analys. Den första rörledningen beräknar en skuggning modell som används av den andra rörledningen att korrigera bilder före analys. Skuggning korrigering appliceras på bilderna för att minska effekterna av en inhomogen ljusbana från mikroskopet. Beräkna skuggning modellen i den första rörledningen är en lång process, men resultaten kommer att vara högre noggrannhet.
- <li> Endpoint analys
- Beräkna skuggning modell
- Gå till menyn "File", välj "Importera" → "Pipeline från fil ...", och välj den medföljande pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". På frågan om att omvandla äldre pipeline, svara "Konvertera inte".
- Gå till "Output" → "Visa utgångsInställningar" och välja en ingångs mapp med bilder och en utgång mapp för de resulterande skuggning modeller.
- I modul (1) "LoadImages", justera namnet på "Text som dessa bilder har gemensamt" för att matcha bildnamnen.
- Se till att ingen av modulerna visa sin skärm innan du kör den fullständiga analysen genom att avmarkera alla ögon symboler bredvid modulerna. Obs: detta avsevärt minskar krävs beräkningsresurser vid bearbetning av rörledningen.
- Tryck på "Analysera bilder" för att starta beräkningen av skuggning modell.
- Kör bildanalys
- Gå till menyn "File", välj "Importera" → "Pipeline från fil ...", och välj den medföljande pipeline "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". På frågan om att omvandla äldre pipeline, svara "Konvertera inte".
- Gå till "Output" → "Visa utgångsInställningar" och välja en ingångs mapp med bilder och en utgång mapp för den resulterande kalkylblad.
- Modul (1) "LoadImages", justera namnet på "Text som dessa bilder har gemensamt" för att matcha bildnamnen.
- Modul (2) "LoadSingleImage", ladda skuggning modeller beräknats enligt 6.1.1 genom att välja plats och filnamn för de två skugg modellerna.
- Moduler (4) - (5) "ImageMath", justera parametern "Multiplicera den första bilden av" matcha lite djup mikroskopkamera. För 8 och 16 bitarbilder ställa in parametern till "1,0", för 12 bitarsbilder in parametern till "16,0".
- Modul (9) "ImageMath" justera parametern "Multiplicera den andra bilden med" till ett värde (börja med 0,25) som kommer att undertrycka Brucella signal i DAPI-färgning utan att undertrycka den Nuclei.
- Klicka på "Starta testläge", sedan aktivera paussymbolen och visningsfunktionen för modul (9) genom att klicka på motsvarande ikoner i modulen.
Obs: paussymbolen visas i gult, medan ögonsymbolen visar en öppen ögat om aktiverad. - Klicka på "Kör" för att köra analysen upp till modul (9) med den aktiva paussymbolen. För att testa värdena för modulen genom att trycka på "Step".
- Högerklicka på den nyligen öppnade bilden och ställ in "Bildkontrast" till "Log normaliserad". Upprepade gånger gå tillbaka till modulen (9), justera parametern "Multiplicera den andra bilden av", och steg över than Module igen, tills Brucella signalen helt undertrycks medan samtidigt svarta områden som indikerar över subtraktion minimeras i resultatbilden.
- Klicka på "Starta testläge", sedan aktivera paussymbolen och visningsfunktionen för modul (9) genom att klicka på motsvarande ikoner i modulen.
- Modul (10) "IdentifyPrimaryObjects", ställ in parameter "Lägre gräns för tröskel" tillräckligt hög (börja med noll), så att kärnor segmenteras och bakgrunden ignoreras.
- För att identifiera en bra värde för modul (10), steg över modulen och visar inmatningsbilden som beskrivs i steg 6.1.2.6.1 och 6.1.2.6.2.
- Högerklicka den inmatade bilden och visa histogrammet.
Obs: Toppen av histogrammet indikerar typiskt bakgrund. - Med början från bakgrundsintensiteten öka parameter tills ett bra segmentering av kärnorna uppnås som visas i utgångsbilden.
Obs: Ställa tröskeln högre än bakgrundsintensiteten är särskilt viktigt för tomma platser.
- Modul (15)4; FilterObjects ", justera parametern" Minsta värde ", så att celler med tydligt Brucella i kärnan hålls, och alla andra filtreras bort i detta steg, ignorera Brucella utanför kärnan..
- För att identifiera en bra värde, steg över modulen och visa den utgående bilden som beskrivs i steg 6.1.2.6.1 och 6.1.2.6.2. Utgå från noll, som identifierar alla celler som infekterats, och öka värdet av små steg tills endast celler med tydligt Brucella på kärnan hålls.
- Modul (16) "FilterObjects", justera parametern "Minsta värde", så att celler med tydligt Brucella vid perinucleus hålls, och alla andra celler filtreras bort. Använda en liknande metod som i den föregående modulen.
- Modul (17) "FilterObjects", justera parametern "Minsta värde", så att celler med tydligt Brucella på Voronoi cellkroppen hålls, och alla andra celler filtreras bort. Använda en liknande metod som i den föregående modulen.
Obs! Voronoi cellkroppen är en radiell förlängning av kärnan med 25 pixlar med någon överlappning med grann Voronoi cellkroppar. - Avsluta testläget och se till att ingen av modulerna visa sin skärm innan du kör den fullständiga analysen genom att avmarkera alla ögon symboler bredvid modulerna.
Obs: detta avsevärt minskar krävs beräkningsresurser vid bearbetning av rörledningen. - Tryck på "Analysera bilder" för att starta analysen.
- När analysen är klar, inspektera de resulterande PNG-bilder samt CSV arket för att säkerställa att analysen fungerade på ett tillförlitligt sätt i hela plattan.
- Entry Assay
- Beräkna skuggning modell
- Gå till menyn "File", välj "Importera" → "Pipeline från fil ...", och välj ged pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". På frågan om att omvandla äldre pipeline, svara "Konvertera inte".
- Gå till "Output" → "Visa utgångsInställningar" och välja en ingångs mapp med bilder och en utgång mapp för de resulterande skuggning modeller.
- Modul (1) "LoadImages", justera namnet på "Text som dessa bilder har gemensamt" för att matcha bildnamnen.
- Se till att ingen av modulerna visa sin skärm innan du kör den fullständiga analysen genom att avmarkera alla ögon symboler bredvid modulerna.
Obs: detta avsevärt minskar krävs beräkningsresurser vid bearbetning av rörledningen. - Tryck på "Analysera bilder" för att starta beräkningen av skuggning modell.
- Kör bildanalys
- Gå till menyn "File", välj "Importera" → "Pipeline från fil ...", och välj provided pipeline "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". På frågan om att omvandla äldre pipeline, svara "Konvertera inte".
- Gå till "Output" → "Visa utgångsInställningar" och välja en ingångs mapp med bilder och en utgång mapp för den resulterande kalkylblad.
- Modul (1) "LoadImages", justera namnet på "Text som dessa bilder har gemensamt" för att matcha bildnamnen.
- Modul (2) "LoadSingleImage", ladda skuggning modeller beräknats enligt 6.2.1 genom att välja plats och filnamn för de två skugg modellerna.
- Moduler (4) - (5) "ImageMath", justera parametern "Multiplicera den första bilden av" matcha lite djup mikroskopkamera. 8 och 16 bitars bilder in parametern till "1,0", 12 bitarsbilder ställa in parametern "16,0".
- Modul (6) "IdentifyPrimaryObjects", ställ in parameter "Lower bunden på tröskeln "tillräckligt hög att endast kärnor segmenteras och bakgrunden ignoreras.
- För att identifiera en bra värde för modul (6), steg över modulen och visar inmatningsbilden som beskrivs i steg 6.1.2.6.1 och 6.1.2.6.2.
- Högerklicka den inmatade bilden och visa histogrammet.
Obs: Toppen av histogrammet indikerar typiskt bakgrund. - Med början från bakgrundsintensiteten öka parameter tills ett bra segmentering av kärnorna uppnås som visas i utgångsbilden.
Obs: Inställning av tröskel över bakgrunden är viktig för tomma platser.
- Modul (8) "IdentifyPrimaryObjects", ställ in parameter "Lägre gräns för tröskel" högt nog att endast Brucella segment och bakgrunden ignoreras.
- För att identifiera en bra värde för modul (8), steg över modulen och visar inmatningsbilden som beskrivs i steg 6.1.2.6.1 och 6.1.2.6.2.
- Högerklicka den inmatade bilden och visa histogrammet.
Obs: Toppen av histogrammet indikerar typiskt bakgrund. - Från och med bakgrundsintensiteten ökar parametern tills god segmentering av Brucella som visas i utgångsbilden uppnås.
Obs: Inställning av tröskel över bakgrunden är viktig för tomma platser.
- Modul (11) "FilterObjects", justera parametern "Minsta värde", så att bakgrunden och artefakter filtreras bort, och endast Brucella kolonier hålls.
- För att identifiera en bra värde, steg över modulen och visa den utgående bilden som beskrivs i steg 6.1.2.6.1 och 6.1.2.6.2. Börja med den valda i 6.2.2.7 och stegvis värde öka den tills endast Brucella objekt hålls.
- Avsluta testläget och se till att ingen av modulerna visa sin skärm innan du kör den fullständiga analysen av unchecking alla ögon symboler bredvid modulerna.
Obs: detta avsevärt minskar krävs beräkningsresurser vid bearbetning av rörledningen. - Tryck på "Analysera bilder" för att starta analysen.
- När analysen är klar, inspektera de resulterande PNG-bilder samt CSV arket för att säkerställa att analysen fungerade bra hela plattan.
- Beräkna skuggning modell
- endpoint Assay
- Öppna CSV arket genereras i steg 6.1.2.12 och beräkna en per brunn infektionsfrekvensen genom att dividera antalet infekterade celler (CellProfiler avläsning: "Count_InfectedCells") med det totala antalet celler (CellProfiler avläsning: "CountNuclei"). Om flera platser per brunn har avbildats, först sammanfatta alla platser för varje brunn, för att bygga en per brunn antalet infekterade celler och en per brunn totala antalet celler.
- Utför Z poäng normalisering att redogöra för platta mot platta variationer om plattorna innehåller tillräckligt icke-drabbade siRNA. Antag ett tillräckligt antal icke-drabbade siRNA per platta om fullständiga biblioteken screenas.
- Entry Assay
- Öppna CSV arket genereras i steg 6.2.2.10 och beräkna en per brunn infektionsfrekvensen genom att dividera antalet infekterade celler (CellProfiler avläsning: "Count_InfectedCells ") av det totala antalet celler (CellProfiler avläsning". CountNuclei ") Om flera platser per brunn har avbildats, först sammanfatta alla platser för varje brunn, för att bygga en per brunn antalet infekterade celler och en per brunn totala antalet celler.
- För att kvantifiera bakteriehalten av infekterade celler, uppskatta den genomsnittliga område som upptas av intracellulära bakterier per infekterad cell. För detta ändamål, dela den integrerade ytan av alla intracellulära bakterier som överlappar med celler (CellProfiler avläsning: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") av antalet infekterade celler i denna webbplats. Att redogöra för artefakter, använda medianen av alla platser i denna avläsning som också avläsning.
Obs: Om denna analys används som en uppföljning analys innehåller ett stort antal gener som är involverade i Brucella infektion, gäller inte Z poäng normalisering. Istället utföra normalisering med hjälp av falska brunnar som en hänvisning till redogöra för platta till platta variation.
7. Infektion Scoring
Obs: siRNA som har en betydande inverkan på cellernas livsduglighet måste betraktas med försiktighet, eftersom det kan främja falskt positiva upptäckter. En förändrad cell nummer påverkar själva MOI och inriktning av essentiella gener kan ha pleiotropa effekter på patogen infektion. Medan den ofullständiga utarmning av siRNA möjliggör studier av viktiga gener, har sådana mål som skall godkännas av alternativa metoder (t.ex. läkemedels störningar) att bekräfta sin roll som värdfaktorerunder infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar ett exempel på bildanalys som används för att automatiskt identifiera infekterade celler i endpoint assay. Kärnor av HeLa-celler som färgats med DAPI identifierades, var en peri-kärna av 8 pixlar bredd som omger kärnan, och en Voronoi cellkropp genom utvidgning av kärnan med 25 bildpunkter beräknas. Eftersom bakterier prolifererar huvudsakligen i peri-nukleär utrymme, är den GFP-intensitet i detta område av cellen den mest robusta mätningar för att diskriminera mellan infekterade och icke-infekterade celler. I vissa fall är bakterier som finns att proliferera utanför den peri-kärnan eller overlay till stor del med kärnan. Därför var dessa två ytterligare objekt också övervägas för att identifiera infekterade celler. Segmentering samt GFP intensitetsmätningar utfördes med bildanalysmjukvara CellProfiler 2.
Brucella
Figur 2A illustrerar den i:mage analys används för att identifiera infekterade celler och mäta den intracellulära bakteriehalten i posten analysen. I motsats till den endpoint assay använder ingångs assay bakteriesegmentering och en Voronoi cellkropp som cellulära objekt. Endast GFP signal av intracellulär Brucella användes för att segmentera patogen i denna bild pipeline analys. Intracellulära bakterier definierades av en minimal storlek på 2 pixlar och en GFP intensitet som överskrider det svaga GFP bakgrundsintensiteten av extracellulära bakterier. En cell ansågs vara infekterad om minst en intracellulär bakterie objektet överlappad med dess Voronoi cellkroppen. Dessutom var bakteriehalten uppskattades genom beräkning av genomsnittlig yta på infekterade celler som är täckt av intracellulära bakterier.
Som för den endpoint assay, utarmning av ARPC3 uppvisade en reduktion av Brucella infektion i ingångs analysen jämfört med celler behandlade med en konkontroll siRNA (Figur 2B). Kvantifiering av infektionsfrekvensen bekräftade att antalet infekterade celler (figur 2C) samt antalet intracellulära bakterier i infekterade celler (figur 2D) reducerades genom utarmning av ARPC3.
Figur 1: Analys av HeLa-celler infekteras av B. abortus uttrycker GFP i slutpunkt analys (A) Endpoint analys. Fluorescens bild som visar ett exempel på slutpunkt analys (grön = B. abortus uttrycka GFP, blå = kärnor färgade med DAPI, Skala bar = 50 pm). GFP-uttryck B. abortus tilläts komma in HeLa-celler under 4 timmar följt av döda av extracellulära bakterier av GM. Ytterligare inkubation under 40 timmar får bakterier att replikera i HeLa-celler. Automatiserad bild analysi s: En CellProfiler rörledning användes för att segmentera DAPI stained kärnor följt av beräkning av den peri-kärna (icke-överlappande plattor av 8 pixlar som omger kärnan) och Voronoi cellkroppen (icke-överlapp radiell utsträckning av kärnan med 25 bildpunkter), båda visas i rött. En cell anses vara smittade om den integrerade GFP intensitet i åtminstone en cellulär (kärna, peri-kärna, Voronoi cellkroppen) översteg motsvarande tröskelvärde. (B) Representativa bilder av HeLa-celler infekterade med B. abortus uttrycker GFP 44 timmar efter infektion. Celler antingen transfekterades med en kodad (icke-targeting) siRNA kontroll eller en siRNA inriktning ARPC3. Skalstreck = 50 | im. (C) Kvantifiering av infektion av HeLa-celler utarmat för ARPC3. Data är representerade som stapeldiagram (bar = medelvärde; Z score normalisering; felstaplar = standardfel för medelvärdet; *** p <0,001; Mann-Whitney-test; n = 7).es / ftp_upload / 54.263 / 54263fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av infektion av HeLa-celler av B. . abortus uttrycker TetR-GFP i posten analysen (A) För analys: Fluorescens bild som visar ett exempel på ingångsanalys (gul = intracellulära B. abortus visar dsRed och GFP signal, röd = extracellulärt B. abortus visar dsRed signal, blå = kärnor färgades med DAPI, Skala bar = 50 pm). B. abortus som uttrycker dsRed och TetR-GFP tilläts komma in HeLa-celler under 4 h följt av dödande av extracellulära bakterier och samtidig induktion av GFP i intracellulära bakterier med ATC under 4 h Automatiserad bildanalys:. En CellProfiler rörledning användes för att detektera DAPIfärgade kärnor följt av beräkning av en Voronoi cellkroppen genom radiell utvidgning av kärnan med 25 bildpunkter (visat i vitt). Bakterier segmente baserat på GFP-signal. En cell anses vara smittade om dess Voronoi cellkroppen överlappade med åtminstone en segmenterad bakteriell föremål för tillräcklig storlek och GFP intensitet. Bakteriehalten i infekterade celler illustreras av integrationen av området för alla segmenterade bakterie föremål med sin Voronoi cellkroppen (enhet = pixlar, NaN = ingen siffra beräknas i icke-infekterade celler). (B) Exempel bilder som visar en minskning av intracellulär B. abortus (visad med antalet gula bakterier) i celler transfekterade med en siRNA targeting ARPC3 jämfört med kontrollceller behandlade med kodat siRNA. Antalet infekterade celler såväl som det genomsnittliga antalet intracellulära bakterier i infekterade celler minskas upon ARPC3 slå ner. (C) Kvantifiering av infektioner i HeLa-celler utarmatför ARPC3. Data är representerade som stapeldiagram (bar = medelvärde; normalisering till mock; felstaplar = standardfel för medelvärdet; * p <0,05; Mann-Whitney-test; n = 4). (D) Kvantifiering av bakteriehalten av infekterade HeLa-celler utarmat för ARPC3. Data representeras som stapeldiagram (bar = medelvärde, normalisering till mock, felstaplar = standardfel av medelvärdet, * p <0,05, Mann-Whitney-test, n = 4). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1. CP2 pipeline - skuggning korrigering Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande fil 2: CP2 pipeline- Endpoint analys. Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande Fil 3:. CP2 pipeline - Detta test Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande fil 4. Beskrivning av moduler Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10X objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25x36 |
References
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
- Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
- Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
- Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
- Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
- Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
- Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
- Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
- Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
- Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
- Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
- von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
