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Biology

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54265
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

Introduction

A angiogênese é desencadeada por sinais extracelulares de sinalização que promovem células endoteliais (ECS) para polarizar, migrar com especificidade direcional, e formam nova vasculatura em tecidos que exigem fornecimento de sangue. Os factores contributivos pensados ​​para conduzir a angiogénese são sinais a partir da matriz extracelular (ECM). Em resposta a estímulos físicos, ECs conceder novos ramos com especificidade direcional para guiar o movimento direcional na formação do 1,2 rede vascular. A arquitetura da morfologia CE e ramificação é definida por regulamento localizada do citoesqueleto de microtúbulos (MT) de uma forma que é coordenado com o regulamento da OTCA-miosina contratilidade 3. Para que ramos da CE para formar, miosina-II deve ser localmente reprimidos, resultando em saliências membrana localizadas 4. Ao mesmo tempo e no mesmo local no interior da célula, a dinâmica de crescimento tornam-se MT modificado resultando em crescimento lento MT e persistente para promover elon ramogação e estabilidade 5. Este regulamento do citoesqueleto coordenado permite ECs para polarizar sua morfologia para facilitar a migração direcional.

O desenvolvimento de uma morfologia celular polarizada requer montagem MT polarizada 6. Na migração células epiteliais, o MTS crescer lentamente e persistentemente especificamente no bordo de ataque da célula 7-9; enquanto nos neurónios, o início e o alongamento dos axónios ou dendritos requer que o MTS não só estão presentes, mas que estão a ser sujeitos dinamicamente os processos de montagem e desmontagem de 10-15. Desta forma, o controlo da dinâmica de crescimento localizada MT determina a arquitectura da célula e permite a rápida remodelação da morfologia celular como ECs navegar através da sua ECM.

dinâmica de crescimento MT são regulados por famílias de proteínas motor molecular e proteínas não-motorizado, denominado microtúbulos Proteínas Associadas ou microtúbulos proteínas que interagem (doravante referred como mapas). Os mapas podem ser localmente activado ou inactivado, normalmente através de cascatas de sinalização iniciadas na interface célula-ECM 16,17. função, mapas Uma vez ativo através da ligação à MT e alterando a cinética de montagem e desmontagem MT; funcionando assim para localmente regular a dinâmica MT, a fim de promover a forma da célula e polaridade 18-20. Mitótico Centromere Associated Cinesina (MCAK) é um mapa família Cinesina-13 que se liga a extremidades MT e casais hidrólise do ATP para MT desmontagem 21-23. Este papel funcional de MCAK é conhecido por ser crítico dentro do fuso mitótico 24-28, bem como durante a interfase 29,30. Dentro interfase ECs, desmontagem MT mediada por MCAK é regulada por localizada Aurora-A fosforilação induzida de MCAK em resposta a ferida de ponta a ativação induzida da pequena GTPase Rac1. O resultado desta cascata de sinalização é a inibição de MCAK no bordo de ataque de células endoteliais, resultando em crescimento MT polarizada para o leading borda e desmontagem MT induzida por MCAK no bordo de fuga de migrar ECs 31.

metodologias tradicionais para medir a dinâmica de crescimento MT têm tipicamente usado rastreamento mão de qualquer tubulina fluorescente marcado ou, mais recentemente, fluorescente marcado com proteína de ligação MT End 1 ou 3 (EB1 ou EB3, respectivamente). A abordagem tubulina fluorescentes tem a vantagem de rotular a matriz MT inteiro. No entanto, porque a maioria dos tipos de células mitóticas manter um agregado radial de Mts durante a interfase 8,32,33, Mts perto do centrossoma são muito denso, e, como resultado, o crescimento de rastreamento MT e desmontagem da tubulina com fluorescente é geralmente limitada ao periférico regiões da célula. Devido a essas limitações, a utilização de proteínas EB marcado com fluorescência (EB1 ou EB3) tem sido a abordagem mais comum para avaliar a dinâmica MT. Porque EBs única rotular as crescentes mais-extremidades dos MTs, eles aparecem como pequenos (1-3 mm), fluorescente brilhantemente vemts, proporcionando assim um marcador facilmente discernível de MT polimerização com fundo muito limitado de fluorescência 34-37. Embora o facto de que a EBS etiqueta apenas um subconjunto da matriz MT representa uma grande força da abordagem EB, também realça uma limitação importante, que o MTS não-crescimento não são rotulados pela abordagem EB3. No entanto, a capacidade de medir e controlar cometas EB3 ao longo do tempo e visualizar o crescimento MT dentro das regiões sub-celular que esta abordagem seja ideal para aplicações que requerem avaliação regional da organização MT.

Outra limitação crítica das metodologias tradicionais de medição dinâmica de crescimento MT tem sido muito grandes conjuntos de dados e o tempo necessário para a análise de dados. Essa limitação decorre da necessidade de acompanhamento lado de centenas de cometas EB na resolução temporal alta. Além disso, estas medições devem ser feitas num número estatisticamente significativo de células e também realizada sob uma variedade de controlo e experimecondições ntal. Recentemente, estas restrições foram superados através de técnicas de análise computacional especificamente dirigidas a cometas rastreamento EB3 meio de microscopia de lapso de tempo em células vivas 35. Quando usado adequadamente, esta abordagem computacional serve tanto para restringir a possibilidade de erro humano associado com a mão-de rastreamento, além de fornecer um método de alto rendimento de medição MT polimerização. Análise computacional da dinâmica MT utilizando o pacote de software baseado em MatLab, plusTipTracker, permite medições de crescimento MT por rastreamento cometas EB3 fluorescente-etiquetados 5,31,35,38. Além disso, o software plusTipTracker permite cálculos de eventos catastróficos MT (aka desmontagem) com base no desaparecimento de cometas EB3 dentro de uma faixa MT crescendo, e permite a análise de sub-celular (aka regional) da dinâmica de crescimento MT dentro de regiões definidas pelo usuário de interesse . Para os nossos estudos, a dinâmica de crescimento MT foram comparadas dentroregiões ramificada contra regiões não ramificados, ou dentro de líder em relação à direita bordas celulares. A saída de dados a partir de software plusTipTracker também pode ser usado para gerar sobreposições de pista com código de cores para células individuais e as regiões sub-celulares.

Aqui nós descrevemos a metodologia utilizada para investigar o papel do MCAK na modulação da dinâmica de crescimento MT e a contribuição deste depolimerase MT para a regulamentação da EC ramificação morfologia e migração direcional. A nossa abordagem utilizada uma linha celular humana primária, Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs), que são facilmente cultivadas e altamente passível de induzida por electroporação, transfecção transiente de ADNc de plasmídeo. Em seguida, usamos de alta resolução, microscopia de fluorescência de lapso de tempo de HUVECs transfectadas com MT End Binding Protein 3 (EB3) e cDNA espec�ico mitótico Centromere Associated Cinesina (MCAK) constrói para avaliar os efeitos sobre a dinâmica MT transfectadas HUVECs. análise de imagem com base computacional de PlusTipTracker-EB3MT marcado com mais extremidades foi medir as velocidades de crescimento MT e vidas de crescimento MT em imagens de lapso de tempo, para medir e comparar os efeitos das manipulações experimentais sobre a dinâmica de crescimento MT. Esta metodologia permite o estudo da dinâmica de MT e a identificação de como a regulação da dinâmica MT localizada dentro de regiões sub-celulares contribui para os processos angiogénicos CE de ramificação e a migração. Estas técnicas são aplicáveis ​​às investigações de qualquer mapa que podem ser marcados com fluorescência e expressos em células vivas.

Protocol

1. HUVEC Cultura e Manutenção

  1. Prepare meio basal endotelial completa adicionando todo o conteúdo do pacote de suplemento de meio de crescimento de células endoteliais e 5% de penicilina mistura antibiótica / estreptomicina ao fenol meio basal endotelial livre vermelho (ver lista de materiais / equipamentos para detalhes). Quente completa meio basal endotelial a 37 ° C num banho de água.
  2. Remover um criotubo HUVEC da armazenagem em azoto líquido e descongelar rapidamente num banho de água a 37 ° C durante 2 min. Quando ~ 80-90% descongeladas, adicionar 500 mL de meio basal endotelial completa aqueceu-se ao frasco de congelação, misturar por pipetagem, e dispensar uniformemente células num prato de cultura de tecidos de plástico 100 milímetros contendo 15 ml de meio basal endotelial completa aquecida.
  3. Células coloque em um 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. Permitir que as células a aderir durante a noite. Não remover ou alterar o meio de cultura celular.
  4. Quando a placa de 100 mm tem> 90% confluentes, transferir HUVECs into a 75 cm2 de cultura de tecidos tratados balão e manter a> 60% de confluência em todos os tempos (veja o passo 1.5).
    Nota: Quando mantida a uma densidade de> 60%, as HUVEC tempo de duplicação de 18-20 h é consistente.
    1. Para situações em que a passagem das células não é necessário (isto é, a densidade é de <90%), Aspirar o meio e substituir com meio basal endotelial completo fresco cada 48 h.
  5. Quando chegar a HUVECs> 90% de confluência, lavar 2 vezes com 10 ml de 1x PBS, e depois remover as células do prato de cultura de tecidos, tratando-se 1,5 ml de 0,25% de tripsina durante 1-2 min a 37 ° C. Nota: A viabilidade das células HUVEC é grandemente reduzida através da extensão do tempo de exposição a tripsina.
  6. células de socorro por adição de meio basal endotelial 8,5 ml completa-se à mistura de tripsina / HUVEC a uma razão de 4: 1 endotelial basal completa meios: tripsina (razão mínima), e recolher num tubo de 15 ml.
  7. Centrifugar a 1.400 g durante 4 min. Aspiraro sobrenadante.
  8. Ressuspender o sedimento em 2 ml de meio basal endotelial completa e adicionar as células para um novo balão de 225 centímetros cultura de tecidos contendo 2 25 ml de meio basal endotelial completa.

2. Coverslip preparação antes da Cultura HUVEC

  1. As lamelas de revestimento com fibronectina substratos.
    1. Prepare ficha limpa 22 mm No. 1,5 lamelas 39 e armazenar a temperatura ambiente (RT) em 100% de etanol.
    2. Use um bico de Bunsen a chama uma lamela e colocá-lo em uma placa de Petri 35 mm utilizando uma pinça.
    3. Prepara-se uma mistura de f ibronectina / PBS por mistura de 10 ul de estoque de fibronectina (1 mg / ml) com 990 ul de PBS.
    4. Pipete 250 pi da mistura de fibronectina / PBS para a lamela, no prato de 35 mm. Espalhe uniformemente para cobrir a superfície da lamela.
    5. Incubar a placa durante um mínimo de 3 horas a 37 ° C e lavar 3 vezes com 2 ml de 1x PBS antes da utilização.
  2. Ativação lamela
    1. Coloque um 22 mm Ref lamela 1,5 em 50% de 3-aminopropyltrimethyloxysilane durante 10 minutos numa placa de agitação. Após incubação, lavam 10 vezes durante 2 minutos cada em banho-H2O destilada (ddH2O).
    2. Incubar a lamela em glutaraldeído a 0,5% durante 30 minutos numa placa de agitação. Após incubação, lavam 10 vezes durante 2 minutos em ddH 2 O.
  3. poliacrilamida Preparação
    1. Prepara-se uma gel de PA com um cumprimento de 0,7 quilopascal (kPa) pela adição de 3,75 ml de 40% de acrilamida, 0,3 ml de 2% de bis-acrilamida, e 0,95 ml de ddH 2 O.
    2. Preparar uma solução de trabalho de 10% de persulfato de amónio (APS) e armazenar em gelo até à sua utilização.
    3. Para preparar a solução de PA para uma lamela (volume total = 166,7 ul), adicionar 0,83 mL de ddH2O, 41,7 ul de solução de bis-acrilamida (feito no passo 2.2.2.1), 124 ul de APS a 10%, e0,25 ul de TEMED.
    4. pipete imediatamente 15 ml de solução de PA sobre uma lâmina de vidro hidrofóbico (ver lista Reagentes) e cubra com um 22 milímetros No. 1.5 lamela activado. Permitir que o PA para polimerizar durante 20 min à TA.
    5. Retirar as lamelas e transferir para um prato de 35 mm. Lavar 3 vezes com 2 ml de PBS 1x. Armazenar para <2 semanas a 4 ° C.
    6. Para ligar à f ibronectina em gel de poliacrilamida, expor as lamelas revestidas de poliacrilamida a 2 mM de sulfo-SANPAH com 7500 J de luz UV (254 nm). Lavar uma vez com DDH 2 O.
    7. Prepara-se uma mistura de f ibronectina / PBS por mistura de 10 ul de estoque de fibronectina (1 mg / ml) com 990 ul de PBS.
    8. Pipete 250 pi da mistura de fibronectina / PBS para a lamela (s) numa placa de petri de 35 mm. Espalhe uniformemente para cobrir a superfície da lamela.
    9. Incubar a placa durante um mínimo de 3 horas a 37 ° C e lavar 3 vezes com 2 ml de 1x PBS antes da utilização.
class = "jove_title"> 3. cDNA Transfecção e Cultura HUVEC em Coverslip

  1. Complete as etapas 1,5-1,6.
  2. Usando um hemocitômetro, contar o número de células e recolher um volume contendo células 100.000 / lamela (para experiências de não-migração) ou 500.000 células / lamela (para experiências de migração). Agregar as células através de centrifugação a 1400 x g durante 4 min.
    Nota: protocolo de migração é descrito na secção 9, abaixo.
  3. Ressuspender as células a serem transf ectadas com 100 ul de tampão de electroporação. Combinar com 1 ug de cDNA e colocar em cuvete de electroporação. Células electroporate: mistura de ADN utilizando o programa designado por electroporação HUVEC (por exemplo, programa #: A-034).
  4. Resgate células com 500 mL de células médio e placa basal endoteliais completos transfectados para um 22 milímetros No. 1.5 lamela revestido com fibronectina (ver protocolo 2.1, acima). Incubar a 37 ° C durante 3-4 horas para permitir o tempo para a expressão de construções de cDNA.
le "> 4. Preparação de Amostras for Imaging

  1. Corte de fita dupla face em 2,5 cm x 0,65 cm tiras.
  2. Obter uma lâmina de vidro limpa. Tome duas tiras de fita dupla face e protegê-las horizontalmente ao longo da borda superior e inferior do slide. Nota: É importante para permitir que uma pequena quantidade de espaço entre a fita e a borda corrediça para vedar a câmara, tal como descrito no passo 4.5).
  3. Montagem lamela (do Passo 3.4; celular voltado para baixo) de tal modo que 2 bordas do resto lamela sobre a fita. Use uma pinça para pressionar para baixo com cuidado para garantir a lamela.
  4. Usando uma micropipeta, adicione 40 mL de meio de imagens (meio basal endotelial completo suplementado com 25 mM HEPES) entre a lamela e slide. Certifique-se de que o espaço entre as lamelas e slide é completamente preenchido com meio de imagem. Aspirar o meio de imagem excesso (se necessário).
  5. Vede todas as bordas com valap quente (1: 1: 1 vaselina: lanolina: parafina). Verifique se há vazamentos, empurrando gently sobre a lamela de vidro.
  6. Coloque montada e selada lamela para pré-aquecido (37 ° C) platina do microscópio.

5. Microscopia

  1. Usando um microscópio fiação disco confocal equipado com um 60X, 1,40 Abertura numérica (NA) interferência diferencial Contrast (DIC) de imersão em óleo lente objetiva, um sistema de monitoramento de foco automático (PFS), obturador eletrônico para iluminação transmitida, um X-e-Y motorizado fase, filtros passa-banda alojados numa roda de filtro electrónico, e um módulo combinador de laser monolítico, focar o microscópio na interface da célula / lamela e usar o joystick platina do microscópio para localizar uma única célula.
  2. Clique no botão "Configurações de câmera" painel no programa de software de imagem. Dentro do "tempo de exposição" janela suspensa do painel de definições da câmara, seleccione 400 ms.
    Nota: Os tempos de exposição pode variar e deve ser determinada empiricamente.
  3. Clique no painel "ND Aquisição" nosoftware de imagem programa. Na guia lambda (λ) do painel ND Acquisition, clique nas caixas de seleção para selecionar os 488 e 561 lasers nm. Dentro da guia "tempo" do painel de ND Aquisição, defina o tempo de aquisição de 2 segundos e o tempo total de 2 min.
  4. Clique no botão "Run Now" dentro do painel de ND Aquisição de adquirir uma sequência de imagens de lapso de tempo de 2 min com intervalos de 2 seg de aquisição utilizando um tempo de exposição ms 400 tanto para a iluminação 488- e 561 nm.
  5. No painel "Optical Config" do programa de software de imagem e usando as configurações da câmera descritas no passo 5.2, clique no botão de laser 405 nm e, em seguida, clique em "Adquirir" para capturar uma única imagem da proteína fluorescente azul (BFP) proteínas marcado com .
    Nota: É geralmente aconselhável para limitar a exposição de células (frequência de captura de imagem e / ou o tempo de exposição) para iluminação do laser 405 nm como comprimento de onda esta pode danificar as células ao longo do tempo.
    1. Para os estudos de MCAK-shRNA, umacquire uma imagem 405 nm único para verificar a expressão do shRNA BFP-rotulados.
  6. No painel "Optical Config" do programa de software de imagem e usando as configurações da câmera descritas no passo 5.2, clique no botão DIC e clique em "Adquirir" para capturar uma única imagem DIC da célula para ramificação análise da morfologia (ver secção 10 , abaixo).
  7. Após a aquisição de imagem, utilizar a função de "Brilho / Contraste" no programa de software para aumentar digitalmente o sinal de imagem.
  8. Exportar o brilho e imagens ajustadas contraste. Clique em "Arquivo" e clique em "Salvar como", em seguida, clique para selecionar ".tif" para o tipo de arquivo de imagem.
    Nota: Isso normalmente gera 61 .tif arquivos de imagem a partir de um único 2 min aquisição de lapso de tempo, quando capturado, conforme descrito no Passo 5.4.

6. MT Análise Dynamics

  1. Para rastreamento EB3, use software plusTipTracker 35, um open-source,pacote de software computacional baseado em MatLab concebidos para a detecção automática, rastreamento, análise e visualização de EBs fluorescente etiquetado.
  2. plusTipGetTracks Graphical User Interface (GUI)
    1. Para acessar o plusTipGetTracks GUI, digite plusTipGetTracks.
    2. Para a detecção EB3 cometa, utilize a GUI para procurar e selecionar o diretório pai que contém as imagens .tif.
    3. Dentro do painel de parâmetros de acompanhamento da plusTipGetTracks GUI, digite os seguintes valores: Pesquisa Faixa Raio = 5 - 10; Comprimento mínimo Sub-Track = 3; Max Gap Comprimento (Frames) = 12; Max Encolhimento Fator = 1,0; Avanço máxima Ângulo = 25; Ângulo máximo Backward = 10; Flutuação Radius (Pixels) = 2; Frame Rate (s) = 2; Tamanho Pixel (mm) = 110.
      Nota: Primeiro verifique se os parâmetros de acompanhamento ideal usando o plusTipParamSweepGUI em um conjunto representativo de .tif arquivos de imagem. O valor digitado para o tamanho do pixel é específico para a lente objetiva usado para adquirir a imagem time-lapses (ver Passos 5,1-5,2, acima).
    4. Para a região de interesse de selecção (ROI), criar máscaras binárias de toda a célula, traçando manualmente a extremidade da célula usando a imagem DIC da célula para formar um polígono.
    5. Para Sub-Região de Interesse (sub-ROI) seleção, criar esquerda e à direita máscaras ponta desenhando manualmente uma linha grossa de 2 pontos através da célula ferida de ponta de interesse usando uma ferramenta de seleção sub-ROI plusTipTracker modificado.
      Nota: A linha deve ser traçada paralela ao bordo da ferida na posição em que a célula de interesse se estende para além do bordo da ferida células 31 vizinha.
  3. plusTipSeeTracks GUI
    1. Verificar e inspecionar visualmente as sobreposições de trilha das imagens .tif armazenados na pasta "ROI" clicando no botão "Plot Tracks" botão na coluna da trilha de sobreposições. Repita o procedimento para todas as sobreposições de pista.
    2. Execute agrupamento de dados, clicando no botão "Criar grupos de" na coluna de configurações opcionais. Selecione o experimdados ental que pertencem ao mesmo conjunto de dados, clicando nos arquivos de dados. Salvar a seleção, dando o "grupo" um nome que pode ser facilmente identificados (por exemplo, "grupo de controle").
    3. Para Sub ROI-MT medidas de dinâmica de crescimento, digite o número mínimo de imagem Frames que um EB3 trilha cometa deve ser detectado dentro do sub-ROI, a fim de qualificar-se como uma "faixa" e extrair excursões de crescimento MT dentro do ROI bordas superior e inferior clicando em "seleção manual" dentro do painel "Sub-ROIs" do GUI.
      Nota: Por exemplo, usar 3 quadros (6 s) que o comprimento mínimo de detecção a ser extraído como uma "faixa". faixas extraídas de sub-ROIs são armazenados dentro de uma pasta sub-projeto dentro da pasta ROI original para cada célula.
    4. crescimento MT sub-track e análise subpopulação
      1. Calcular a velocidade média de crescimento MT e significa vida crescimento MT para conjuntos de dados "grupo" (veja o passo 6.3.2), para cada ROI (veja step 6.2.4), e para cada sub-ROI (veja o passo 6.2.5).
    5. Dentro do Quadrante coluna Gráficos de Dispersão do plusTipSeeTracks GUI, clique em "Selecionar Grupos" e clique sobre os grupos (criado na etapa 6.3.2) a serem comparados.
      1. Seleccione "Velocidade de crescimento" para a opção do eixo x e digite o valor médio para a velocidade de crescimento (do Passo 6.3.4) na caixa. Selecione "tempo de vida Crescimento" para a opção do eixo y e digite o valor médio para a vida de crescimento (do Passo 6.3.4) na caixa.
    6. Marque a caixa ao lado de "Remover faixas no início / fim" e ao lado de "Processo de lote em grupos." Clique em "Make Plots" para gerar um perfil de distribuição de MT faixas de crescimento para toda a célula, bordas, e bordos de fuga sub-ROI.
      Nota: Para estudos aqui descritos, as faixas de crescimento MT são distribuídos em quatro subpopulações: lenta e de curta duração, lento e de longa duração, rápida e de curta duração, e rápido e de longa duração.
    7. Clique em "Dados", em seguida, clique em "Análise de Dados" na janela suspensa de dados. Selecione "t-teste: duas amostras assumindo variâncias iguais" para comparar as médias velocidades de crescimento MT e vidas de crescimento MT. Realce as células de dados dentro da planilha onde as comparações t-teste resultar em um valor de p <0,001.

7. Análise de co-localização

  1. Para subtração de fundo, usando a "ferramenta de linha" do programa de software de imagem, desenhe uma região de interesse (ROI), clicando na tela para criar uma forma quadrada, que é 10 m 2 na imagem do canal verde (488 nm de excitação) a uma posição em que não há nenhuma fluorescência de células (fundo). Repita este procedimento para a imagem do canal vermelho (561 nm de excitação), utilizando as imagens a partir do Passo 5.8.
  2. Usando o pr software de imagemogram, clique direito sobre o ROI a partir do passo 7.1 e selecione "definir como ROI de fundo." Clique em "Imagem", depois clique em "fundo de subtração" da janela de lista suspensa para subtrair os valores de fundo médios (do passo 7.1) da inteira imagem. Efectuar a subtracção de fundo para as células co-expressando Em-Aurora A e quer mCherry-MCAK, Mapple-EB3, ou Mapple-tubulina.
  3. Na imagem canal vermelho fundo subtraído somente, clique na faixa de opções binário e selecione "Definir Threshold" e selecione a função "por canal" para excluir o marcador fluorescente designado.
    Nota: A etapa de limiar foi realizada em ambos a imagem Mapple-tubulina mCherry-MCAK, Mapple-EB3, ou para permitir o desenho de linhas que, especificamente, marcaram o objeto thresholded para análise de co-localização (veja o passo 7.4).
  4. Usando a ferramenta de linha no software de imagem, desenhe uma linha grossa de 2 pontos sobre os objetos excluídos dentro da imagem thresholded.
  5. Selecione os objetos linha traçada no passo 7.4. Copie e cole os objetos de linha do canal vermelho sobre sua imagem correspondente canal verde (Em-Aurora A).
  6. Medir os valores de intensidade de pixel em escala de cinza abaixo da linha de objetos para calcular o co-localização e valores totais Em-Aurora-A para cada célula individual, selecionando "Medida", depois "perfil de intensidade" da janela de suspenso dentro do programa de software de imagem.
    1. Organizar os dados por tratamento experimental e região sub-celular por exportar para um programa de software de planilha e salvando o arquivo como tipo .xls (por exemplo, "control_grayscale_intensity.xls").
      Nota: Os dados apresentados desta forma representa a fração de co-localização do total medido Em-Aurora-A por região sub-celular.
  7. Utilizando os valores medidos a partir do passo 7.6, repita o passo 6.3.7 para calcular a significância estatística usando p <0,05 como ponto de corte para significância.
  1. Fix células (veja o passo 3.4) com paraformaldeído / glutaraldeído co-extracção / tampão de fixação (PGF-PHEM; paraformaldeído a 4%, 0,15% de glutaraldeído, 0,2% de detergente em tubos de 60 mm, HEPES 27,3 mM, EGTA 10 mM, e MgSO 8,2 mM 4, pH 7,0) durante 10 min à TA.
  2. Lavar 3 vezes durante 5 min com 2 ml de PBS 1x.
  3. Tratar 2 vezes durante 15 min com 0,01 g / ml de NaBH 4 em 1x PBS para extinguir aldeídos reactivos.
    Nota: bolhas NaBH 4 formas que podem causar as lamelas a flutuar. É fundamental que as lamelas permanecer submerso durante estas incubações. Se as lamelas começam a flutuar, utilizar uma pinça para elevar uma extremidade da lamela de modo a permitir que as bolhas de escapar.
  4. Lavar 2 vezes com 1x de PBS antes de bloqueio com 5% de leite livre de gordura em 1x PBS numa plataforma de agitação durante 1 h à TA.
  5. Incubar as células em anticorpos primários (anticorpo de coelho anti-pT288-Aurora A (1: 1000)) e de rato anti-α-tubulina (1: 500) preparado em solução de PBS 1x. Incubar a 4 ° C durante a noite numa plataforma de agitação.
  6. Remover os anticorpos primários e lavar 3 vezes durante 5 minutos em 1x PBS antes da incubação com os anticorpos secundários (anti-coelho de burro (1: 1000) e anticorpos de cabra anti-rato (1: 1000)), preparado no leite isento de gordura a 5% durante 2 h a 37 ° C.
  7. Mount lamela numa lâmina de vidro em meio de montagem otimizado-fluorescência. Selar as bordas lamela para o slide usando unha polonês clara e armazenar no escuro a 4 ° C.

9. Cell Migration Assay

  1. Realizar cultura HUVEC para ensaios de migração conforme descrito acima (Protocolo 3: cDNA Transfecção e Cultura HUVEC em Lamela, Passos 3,2-3,3).
  2. A seguir à transfecção de células, as células transfectadas com resgate meio basal endotelial 80 ul completa. Pipetar 80 ul da amostra como uma única gota para o centro de um 22-mm redondo 1,5 lamela No. revestidos por fibronectina seca. Não espalhe o visualizador 80 ulp. Incubar a 37 ° C durante 3-4 horas para permitir o tempo para a adesão de células em uma monocamada confluente.
    Nota: A secagem da lamela é necessário para evitar que a gota de 80 ul de espalhamento após contacto da lamela. Esta abordagem permite a HUVECs para ser concentrada dentro de uma pequena área da lamela e, deste modo promove a rápida formação de uma monocamada confluente de células.
  3. Lavar 2 vezes em meio basal endotelial completa para remover as células não-ligados.
  4. Para criar uma "borda da ferida," scrape a lamela com uma lâmina de barbear esterilizada arrastando suavemente uma lâmina limpa através da monocamada de HUVEC (a partir do Passo 9.2). Segure a lamela suavemente no lugar com uma pinça para evitar o deslizamento da lâmina de barbear durante a raspagem.
  5. Permitir que as células para recuperar numa incubadora a 37 ° C durante 3 h. Montar e montar lamela (s) para geração de imagens (ver Protocolo 4).
  6. Adquirir imagens 488 nm de contraste de fase e em intervalos de 10 min durante 12 horas no microscópio usando um10x 0,45 NA fase objectivo e um condensador de NA LWD 0,52 usando o painel "ND Aquisição" do programa de software de aquisição de imagem (descrito no Passo 5.3).

10. Quantificação de HUVEC Ramificação e Migração

  1. Para ramificação análise e para permitir uma iluminação uniforme de células e quantificação imparcial, adquirir uma imagem microscópica de um HUVEC transfectadas (veja o passo 3.3) e expressando o cDNA Mapple-C1 construir, um marcador de volume da célula.
  2. Utilizando o programa de software de imagem, abra a imagem Mapple-C1 e rotular a posição em ambos os lados do ramo onde a membrana apresenta o maior ângulo de curvatura. Ligue esses dois pontos com uma linha reta. Esta linha é a "origem do ramo."
  3. Usando a ferramenta de linha do software de imagem, identificar visualmente ramos que medem> 10 mm de comprimento a partir da "origem ramo" determinado na Etapa 10.2. Calcular o comprimento do ramo através da medição da distância a partir the "ramo de origem" para o ponto mais distante da ponta do ramo (ver a Figura 4).
  4. Contar o número de saliências ramificada que medem> 10 mm de comprimento para obter "número da agência celular."
  5. Para a análise de migração, utilizando as imagens recolhidas no passo 9.6, identificar visualmente uma HUVEC ferida de ponta com base na localização física (isto é, células fisicamente no bordo da ferida) e perfil de expressão (isto é, seleccionar uma célula de extremidade da ferida verde se o experimento envolve expressão da GFP).
  6. Usando as imagens de contraste de fase da célula, identificar visualmente o núcleo (a estrutura esférica semi-transparente perto do centro da célula), e depois identificar visualmente o nucléolo (uma pequena estrutura, de cor escura, esférica dentro do núcleo) a o primeiro ponto de tempo das imagens de lapso de tempo. Clique na posição do nucléolo para rotular os xey coordenadas do nucléolo.
  7. Usando o software de imagem, mão-acompanhar onucléolo em imagens com lapso de tempo sucessivos, clicando sobre a posição do nucléolo para rotular os xey coordenadas do nucléolo em cada quadro do filme de lapso de tempo (Figura 4).
  8. Usando o software de imagem, clique em "Arquivo" e clique em Salvar como "clique para selecionar o tipo de arquivo de imagem" .xls ".
  9. Abra o arquivo de dados de mão-tracking (do passo 10.8) usando um programa de software de planilha. Calcule a velocidade de migração média e média distância de migração de origem.
  10. Usando um programa de software de planilha, clique em "Dados", em seguida, clique em "Análise de Dados" da janela suspensa de dados. Selecione Bonferroni corrigida análise, de um modo de teste de variância com> 95% de confiança como ponto de corte para significância estatística.

Representative Results

cultura HUVEC para microscopia de células vivas
Processamento de imagem de células vivas, de células HUVEC que expressam proteínas fluorescentes requer que HUVECs são mantidas num ambiente que é adequado para o crescimento normal das células e manutenção, bem como a expressão da proteína e a função normal. A Figura 1 mostra uma representação esquemática do protocolo utilizado para preparar um tamponada e sistema fechado que mantém otimizado características ópticas para a recolha de imagens de lapso de tempo de células vivas. Tiras finas de fita de face dupla são colocadas sobre uma lâmina de vidro (Figura 1A) e, em seguida, a lamela contendo a HUVEC cultivadas é invertido por cima da fita de modo a que as células estão virados para a lâmina (ver figura 1B). Desta forma, a fita fornece uma pequena diferença entre as duas superfícies de vidro, e cria um espaço no qual as células podem ser banhados em apropriado meios de cultura celular (Figura 1C; ver Protocolo 4, acima). Euna etapa final, a lamela de vidro é selada para a lâmina de vidro usando uma geleia de petróleo: cera de parafina: lanolina (1: 1: 1 mistura, valap; Figura 1D) para estabelecer um sistema fechado. Esta abordagem de cultura de células foi utilizado para ambos o mais curto tempo de imagiologia sequência cometas EB3 e para a sequência de tempo mais longo de ramificação e experiências de migração. Além disso, a consistência do tipo cera de valap permite a fácil remoção da lâmina de vidro e a lamela, no final de uma imagem experimentar tais que as abordagens complementares, incluindo fixação e imunomarcação (ver Protocolo 8), pode ser realizada no mesmo lamela e amostra de células que foi visualizada usando a abordagem de imagem de células vivas.

figura 1
Figura 1:. Metodologia da cultura HUVEC de imagens microscópicas de células vivas (A) Corte 2 pedaços de fita dupla face em 0,65 cm x 2.50 cm tiras rectangulares e garantir um pedaço de fita adesiva de dupla face na horizontal ao longo da borda superior da lâmina, e a outra peça, ao longo da borda inferior da lâmina. É importante para permitir que uma pequena quantidade de espaço entre a fita e a borda corrediça para vedar a câmara, tal como descrito em (D). (B) Utilizando uma pinça remover a lamela contendo células HUVEC e inverter a lamela (lado célula para baixo) na parte superior das tiras de fita. (C) Com uma micropipeta, adicione 40 mL de meios de imagem (meio basal endotelial completo suplementado com 25 mM HEPES) entre a lamela e a lâmina de vidro. Certifique-se de que o espaço entre as lamelas e slide é completamente preenchida com a mídia de imagem e evitar bolhas. Usar um aspirador ao longo da borda da lamela para remover o excesso de meios de comunicação, se necessário. (D) Use valap quente (1: 1: 1 de vaselina: lanolina: parafina) para vedar em torno das bordas da lamela. Verifique se há vazamento de mídia de imagems, empurrando ao redor suavemente sobre a lamela. Use valap adicional para remediar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

monitoramento automatizado de EB3 fluorescente marcado permite a análise abrangente de célula inteira e dinâmica de crescimento MT regionais. A recolha de claras e distintas e altamente tempo e resolvida no espaço imagens microscópicas da proteína EB3 é essencial para a análise dos movimentos EB3 dentro da célula. expressão de HUVEC EB3 fluorescentemente marcado varia amplamente de célula para célula e a intensidade da fluorescência aumenta tipicamente dentro da mesma célula ao longo de um período de horas. Assim, é importante considerar e monitorar essas mudanças no perfil de expressão, a fim de identificar os potenciais efeitos de aumento da expressão EB na dinâmica de crescimento MT. Isto é melhor realizado através da avaliação intensit fluorescência em escala de cinzay perfis para cada célula fotografada, e, em seguida, restringindo a análise de dados para as células que exibem uma variedade de perfis de expressão definido de escala de cinzentos. A avaliação inicial dos conjuntos de dados de perfil de expressão é crítica, e deverá ser comparado com dados de MT dinâmica de crescimento que é obtido pelo software plusTipTracker para cada célula. perfis de expressão pode ser registada em função da velocidade de crescimento MT e duração de crescimento MT para cada célula dentro de um grupo experimental, a fim de determinar o alcance desejado de expressão em escala de cinza e identificar potenciais valores atípicos.

A Figura 2 destaca a HUVEC cultivadas em um substrato de fibronectina (ver protocolo 2.1, acima) e expressando perto dos níveis óptimos de EB3 Mapple marcado. Cometas EB3 fluorescentes são mostrados em uma série de lapso de tempo de imagens ao longo de um período de 12 segundos (Figura 2A). Análise de cometas EB3 usando software plusTipTracker envolve um, quadro-a-quadro EB3 cometa dete automatizadoction (pontos verdes e amarelos, Figura 2B). Cometas detectados dentro de cada quadro são, então, ligadas, dependente da sua mudança de posição de quadro-a-quadro, para gerar faixas EB3 e uma sobreposição de faixa EB3 visual (Figura 2C-F). sobreposições de faixa são e distinções de cor pode ser determinada por parâmetros introduzidos pelo utilizador com código de cores. Normalmente, estas distinções utilizar a média mundial de velocidade de crescimento MT e MT vida crescimento 5,31 e, assim, dividir os dados em quatro grupos: lenta e de curta duração (vermelho), lenta e longa duração (amarelo), rápidas e de curto viveu (verde), e crescimento MT rápido e longa vida (azul; Figura 2G). rastreamento PlusTipTracker mediada da dinâmica de crescimento MT marcado com EB3 também permite Regiões definidas pelo usuário de interesse (ROI). PlusTipTracker extrai os dados da faixa de crescimento MT de dentro do ROI definida pelo usuário (Figura 2A, B e F), permitindo assim comparações de DYNAM crescimento MTICS dentro de diferentes regiões da mesma célula.

Figura 2
Figura 2: Detecção cometa EB3, controle e saída de dados plusTipTracker (A) filme de lapso de tempo de um HUVEC expressando Mapple EB3.. O painel esquerdo mostra uma vista de células inteiras e uma máscara de célula inteira (linha branca) demarcando os limites da célula. Caixa vermelha representa a região ampliada mostrado nas imagens de lapso de tempo (painéis da direita). painéis da direita mostram imagens de lapso de tempo em escala de cinza matérias de cometas EB3 em quadros de imagem sucessivos (t = 0 seg - t = 12 seg). (B) Detecção de cometas plusTipTracker EB3 das imagens apresentadas em (A). O painel esquerdo mostra uma vista de células inteiras de cometas detectados (pontos amarelos). Caixa vermelha representa a região ampliada mostrado nas imagens de lapso de tempo (painéis da direita). painéis da direita destacar cinco cometas EB3 detectados (setas vermelhas) e traçar esses cinco cometas durante o período de imagem 12 seg. verde Os pontos representam detectado cometas EB3 que não existiam (ou não foram detectados) no intervalo de tempo anterior. (C) projeção de intensidade máxima de 61 quadros (2 min) de filme de cometas EB3 mostrado em (A). (D) plusTipTracker MT sobreposição de controle dos mesmos 61 quadros (2 min de filme) mostrados em (C). (E) Zoom de projeção de intensidade máxima (caixa vermelha na C). (F) Zoom de plusTipTracker MT sobreposição de controle de projeção de intensidade máxima (caixa vermelha na D). Legenda para as sobreposições de trilha mostrado em (D) e (F) (G) com código de cores. Designação como lento, rápido, de vida curta ou longa duração baseia-se no valor médio para todas as faixas de crescimento, medida em um grupo de HUVECs expressando dez Mapple-EB3. Para melhor visualização, sobreposições de pista em (D) e (F) são gerados usando intensidades de pixel da imagem invertida célula mostrado em (A). Barras de escala = 20 uM./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

HUVEC ramificação e padrões de migração são sensíveis a mecano-físico sinais do ECM.

HUVECs são bem conhecidos para responder aos diversos tipos de sinais de sinalização e, ao fazê-lo, se submeter a alterações morfológicas que determinam uma resposta celular apropriada para a sinalização sinalização específica (s) 36,40-42. HUVECs cultivadas em substratos de vidro revestidas com fibronectina (Figura 3a), ou em rígidas ECMs de poliacrilamida de 2 dimensões (55 kPa) tipicamente exibir uma morfologia redonda ou alongada com poucas protuberâncias ramificados distintos (Figura 3B). No entanto, quando cultivadas em muito suaves ECMs de poliacrilamida de 2 dimensões (0,7 kPa), HUVEC exibir uma morfologia altamente ramificada que se sabe resultar de cumprimento induzida para baixoregulação da miosina-II contractilidade 4,5,31 (Figura 3C). Assim, HUVECs regular sua morfologia celular através mechanosensing ECM, e isso é feito através da modulação localizada de dinâmica de MT e contratilidade acto-miosina.

Porque HUVECs exibir uma ampla variedade de atributos morfológicas, de modo a medir a HUVEC ramificação é fundamental para o primeiro definir uma saliência é ramificado, e, em seguida, para definir uma saliência como ramificada será medido objectivamente. Uma técnica utiliza uma abordagem de quatro etapas, através da qual um limite de célula ou "máscara" é gerada pelo lado traçando as arestas da célula usando uma imagem de uma célula que expressa um marcador fluorescente de volume para definir as arestas de células (Figura 3D). Após geração de máscara, origens de ramo são definidas por localização maior ângulo de curvatura entre a saliência ramificado e o corpo da célula. A linha é desenhada para DEMArk a "origem branch" (linhas angulares roxas; Figura 3E). Número da agência é medida simplesmente pela contagem do número de agências com um ramo de origem definida (Figura 3F). Comprimento do ramo é medida como a distância a partir da origem ramo para a ponta ramo distal (Figura 3G). Para evitar a inclusão de pequenas projeções lamellipodial de análise de dados, critério adicional exigir das sucursais deve ser mais longo ( "comprimento do ramo") do que eles são largas (na "origem ramo"), e que as sucursais devem ser pelo menos dez mícrons de comprimento 5 , 31.

Figura 3
. Figura 3: Análise de HUVEC morfologia ramificação (A - C) Exemplos de imagem DIC HUVECs cultivadas em revestidas com fibronectina ECMs de vidro (A) rígidas (55 kPa) ECMs poliacrilamida (B) e moles (0,7kPa) ECMs poliacrilamida (C). Ramificante é aumentada drasticamente em células HUVEC cultivadas em 0,7 ECMs poliacrilamida kPa (C), em comparação com ECMs duras (A, B). (D). DIC imagem microscópica (imagem da esquerda) de um HUVEC transfectadas expressando um cDNA Mapple-C1 construir (um marcador volume celular, a imagem à direita). (E) Definir a origem ramo, localizando o maior ângulo de curvatura (isto é, a posição em que a membrana apresenta o maior curvatura; linhas de cor roxa) em ambos os lados do ramo e, em seguida, conectar os ângulos com uma linha reta (linhas azuis) . (F) Identificar e selecionar saliências ramificados que se estendem> 10 mm a partir da "origem branch" (definido em E). Contar o número de saliências ramificada obter o "número da agência." (L) Medir a distância a partir do centro do "ramo de origem" para o MOponto distal st do ramo usando a ferramenta de linha na anotações e medições aplicação do NIS Elements Software para obter o "comprimento do ramo." Barras de escala = 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para além do cumprimento ECM detecção, HUVECs também perceber e responder à eliminação de contactos celulares adjacentes como induzidas por zero ferimento. No ensaio de migração, HUVECs cultivadas numa monocamada são submetidos a uma ferida zero e características de migração são medidas (ver Protocolo 9, acima). Após a indução da ferida por raspagem da monocamada, HUVECs ferida de ponta polarizar através do desenvolvimento de um bordo de ataque de protrusão que se estende para dentro da ferida (Figura 4A, t = 0 h). Ao longo de um curso de tempo de 10-12 horas, HUVECs ferida de ponta polarizadas migram para a área da ferida e encher oferida, que estabelece uma nova monocamada confluente (Figura 4A, t = 11 h). Tal como acontece com HUVEC ramificação, a evidência atual sugere que a polarização e migração é criticamente dependente da re-organização coordenada do MT e citoesqueleto de actina 43-49. Isto é conseguido, em parte, através da inibição localizada da desmontagem MT induzida por MCAK no bordo de ataque, mas não no bordo de fuga da ferida de ponta 31 de HUVECs. polarização é iniciada pela Rac1 GTPase, que tem como alvo várias proteínas reguladoras a jusante, incluindo Aurora-A cinase que fosforila e inibe MCAK no bordo de ataque, e outras quinases que sejam capazes de inibir ou activar mapeia a sensibilidade da dinâmica do MT para induzida ferida localmente modular o crescimento MT e encolhimento 18,31,36,48,50-53. evidência experimental extensa apoia a noção de que a coordenação de contração líder protrusão de ponta e bordo de fuga é regido por ciclos de activação Rac1para promover a montagem MT na vanguarda e ativação RhoA a contratilidade acto-miosina no bordo de fuga, aumentando assim a motilidade dirigido 9,41,51,52,54-58.

Até à data, não há uma metodologia estabelecida para a realização de seguimento automatizado de migração celular. Este é um resultado da dificuldade em analisar computacionalmente limites célula-ECM que são constantemente mudando à medida que as células ferida de ponta polarizar e migrar. Enquanto muitos programas de software são capazes de rastrear as células marcadas com fluorescência 59-64, a população de células HUVEC marcado por fluorescência em experiências de migração ferida de ponta é de cerca de 30-40% da população total de HUVEC, e, por conseguinte, a maioria das células de feridas-aresta deve ser visualizado por contraste de fase ou imagem DIC. Além disso, é importante quando se mede a migração ferida de ponta para avaliar células fluorescentes e não fluorescentes dentro da mesma ferida, a fim de identificar específicaefeitos de construções de expressão tanto dentro dos grupos experimentais e de estudo entre os dois grupos de estudo experimentais. Actualmente, a melhor abordagem para medir a migração de HUVEC é a utilização de uma abordagem de rastreamento de mão em que uma célula de ferida de ponta é identificado pela primeira vez e, em seguida, o núcleo e o nucléolo são identificados (Figura 4B). O nucléolo é utilizado como determinante para a posição de seguimento de células, devido à sua densidade de dispersão de luz elevada e o tamanho relativamente pequeno. Estas duas características do nucléolo torná-lo mais fácil de identificar e reduzir os erros de medição, limitando a área em que o usuário pode colocar posições de faixas individuais. HUVEC faixas de migração são, então, gerado clicando no nucléolo em sucessivos quadros de imagem time-lapse. Finalmente, a velocidade de migração e distância de migração de origem são medidos e analisados ​​por grupos de células experimentais (Figura 4B) e controle de.

Figura 4 Figura 4: Análise das HUVECs ferida de ponta e rastreamento de migração imagens (A) 20X de contraste de fase de uma série de imagens de lapso de tempo de 11 horas de zero ferida de ponta HUVECs (aka "Migration Assay").. A ferida e direção da migração são indicados no painel t = 0 h. HUVECs são mostrados para atravessar a ferida de ponta e avançar para dentro da ferida até que uma monocamada de células é formada (T = 3,5 h - t = 11 h). (B) Análise do ensaio de migração de imagem lapso de tempo (como se mostra em A), exige primeiro a identificação de um HUVEC ferida de ponta rastreável com base no local de célula (ou seja, células fisicamente na borda da ferida) e perfil de expressão (i .e. , selecione uma célula borda da ferida verde se o experimento envolve a expressão de GFP). Usando a imagem de contraste de fase, identificar o núcleo e nucléolo. Mão acompanhar o nucléolo em imagens com lapso de tempo sucessivas usando a umnotações e medições aplicação em software NIS Elements para determinar a velocidade de migração e distância à origem. Barras de escala = 100 mm (A), 20 mm (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Usando HUVECs na morfologia e Migração Experiências.
processamento de imagem de células vivas da dinâmica de crescimento MT marcado com EB3 dentro HUVECs requer condições de cultura de células adequadas e reprodutíveis, a fim de medir e avaliar alterações no crescimento e morfologia MT HUVEC, de tal forma que eles podem ser atribuídos a uma sugestão ECM sinalização. HUVECs representam um excelente modelo para estudar a forma da célula e a motilidade. Eles são altamente passíveis de transfecção com cDNAs fluorescente marcado, eles exibem morfologias dramáticas em resposta a ambas as pistas de sinalização solúveis e físicos, e eles manter a capacidade de organizar-se em tubos vasculares quando fornecido condições de cultura de células apropriadas 65-70. culturas de células primárias, tais como HUVECs, requerem um tratamento e acompanhamento de passagem número de células cuidado para assegurar que as células são saudáveis ​​e que eles vão se comportar normalmente durante a experimentação. Por exemplo, quando a realização de experiências que investigam a cytoskeletonelada e / ou a morfologia das células, células HUVEC não devem ser utilizados em experiências para além da décima passagem de cultura de células, como células HUVEC tipicamente começam a apresentar morfologias não-uniforme em torno passagem doze a quinze.

A densidade celular é também um regulador crítico de saúde HUVEC e a proliferação. investigações ramificação HUVEC (ver Protocolo de 10,1-10,4, acima) utilizar culturas de células de densidade relativamente baixa, a fim de fornecer as células de espaço físico para interagir com a sua ECM e estender as saliências ramificada. Em contraste, nos estudos de migração ferida de ponta (ver Protocolo 10,5-10,8), células HUVEC são cultura numa monocamada antes do ferimento. Como tal, as células HUVEC ferida de ponta exibir uma morfologia relativamente não-ramificado, levando saliências se estendem da borda, e exibem interacções célula-célula com os seus vizinhos imediatos à medida que migram para dentro da ferida.

Advertências e vantagens do rastreamento MT Dynamics em viver HUVECs.
Spinning microscopia de disco é uma excelente abordagem paratestar hipóteses experimentais que requerem clareza de imagem confocal com tempo de resolução. Com o módulo da câmara e do laser apropriado, esta abordagem é sensível a microscopia de fluorescência de baixa emissão e pode ajudar na fotodegradação reduzida em comparação com outros tipos de microscopia de fluorescência. Mais importante, esta abordagem é também adequada para moderada a imagem de alta resolução de tempo, como é necessário para a geração de medições abrangentes da dinâmica do crescimento MT utilizando a abordagem de marcação EB3, em uma variedade de diferentes tipos de células.

Embora a metodologia de rotulagem EB3 crescente MT-Plus extremidades tem vantagens distintas em relação a outros métodos de marcação fluorescente MTS, que também tem desvantagens únicas. Por exemplo, há uma proporção da matriz MT que não está a crescer activamente, em qualquer momento dado, incluindo a população de Mts desmontagem e a população de Stábile MT não dinâmicos 71-74. EB3 não rotular essas duas populações de MTs ePor conseguinte, a contribuição destas duas populações não seria incluído na análise de dados experimentais. metodologias alternativas para avaliar a matriz MT todo têm-se centrado sobre a expressão da tubulina marcada com fluorescência, que incorpora em todas as populações de MTs e permite a identificação de crescimento, encolhimento e estável MTs. No entanto, devido à densidade relativamente elevada da matriz MT perto do centro da célula e adjacente ao centro do organizador de microtúbulos (MTOC), etiquetagem, a matriz MT toda cria uma desvantagem na realização de análise de imagem de extremidades MT que não estão perto da célula periferia 75-77. Experimentos usando co-rotulagem de duas cores de MTs com a tubulina fluorescentes e EB3 fluorescente em células vivas têm revelado, qualitativamente, que a grande maioria das MTs marcado com tubulina também são 78 marcados com EB3. Além disso, não tem sido um método eficiente de seguimento automatizado de Mts marcadas com fluorescente tubulina. Isto significa que os dados Collecção e as medidas de dinâmica de MT em células expressando tubulina fluorescentes requerem acompanhamento mão do MTs individuais, um processo que é propenso a erros e tedioso. Como resultado, a análise computacional automatizado de EB3 MT marcado tornou-se a metodologia preferida para a medição dinâmica MT, uma vez que pode ser aplicada a MT dinâmica experiências em vários tipos de células e dentro de uma variedade de regimes experimentais 35,79.

Ligando MT Crescimento Dynamics para HUVEC Morfologia e Migração.
Do ponto de vista de um pesquisador do citoesqueleto, uma adaptação extremamente útil na análise de rastreamento plusTipTracker automatizado é a capacidade de medir e avaliar ambas as alterações celulares e regionais inteiros na dinâmica de crescimento MT. A exigência de uma célula para se tornar polarizada é um pré-requisito essencial para migração de células direcional. Como tal, os sinais de sinalização polarizados têm sido conhecidos como fatores determinantes fundamentais para a migração de células direcional 30,31,51,54,56,80,81 2,82-87. Além disso, em resposta às interações físicas com a ECM (por exemplo, conformidade e mechanosensing dimensionalidade), HUVECs modular a sua dinâmica MT regulando localmente mapas para promover o crescimento MT dentro alongando saliências ramificados, e isso serve para orientar a migração HUVEC na direção do cue 5,31,88. Assim, a polarização em resposta às sugestões de sinalização extracelulares destaca a necessidade de uma avaliação experimental de alterações localizadas na dinâmica do citoesqueleto.

processamento de imagem de células vivas simultânea de dinâmica MT de crescimento (utilizando a abordagem EB3) e a migração de células HUVEC é extremamente difícil de realizar, porque MT crescer numa escala de tempo de segundos, ao passo que as alterações na morfologia celular e migração direccional ocorre numa escala de tempo de horas. No entanto, ambos os processos estão intimamente Linked. Além disso, imagiologia contínua, rápida de EB3 marcado com fluorescência na segunda escala de tempo conduz a fotodegradação do sinal EB3. As tentativas para superar este problema através da realização de séries de imagens com falta de EB3 (séries aquisição 1-2 min) a cada 30 minutos foram bem sucedidos, mas só poderia ser realizado em um pequeno número de ECs que teve expressão ideal de EB3 e que não exibir adverso para efeitos de iluminação laser foi repetida 5.

Uma abordagem alternativa que permite interpretações de como a dinâmica de crescimento MT contribuir para alterações na morfologia celular e migração é a Região plusTipTracker de Interesse (ROI) da ferramenta 35 (ver Protocol 6.6). Esta metodologia permite o crescimento de células MT toda faixas para ser sub-dividido em regiões definidas pelo utilizador, a partir do qual MT faixas de crescimento podem em seguida ser extraídos e analisados. Por exemplo, comparações de "ramificado" versus regiões "não-ramificados" da célula revelaram que MTs crescer mais spequenos e mais persistente no interior das regiões ramificadas em relação à periferia da célula não-ramificado 5. Em polarizada ferida de ponta HUVECs, as comparações dos principais borda e de fuga dinâmica de crescimento borda MT revelou que induzida por MCAK desmontagem MT é inibida especificamente dentro do bordo de ataque, mas não a bordo de fuga. avaliação de ataque e de fuga dinâmica de crescimento borda MT em HUVECs expressando Rac1 e / ou mutantes de fosforilação de MCAK Regional revelou ainda que a ativação induzida por Rac1 da Aurora-A cinase especificamente e localmente inibe a atividade MCAK dentro da ponta para conduzir HUVEC polarização e migração direcional 31. Assim, a combinação de monitoramento automatizado da dinâmica de crescimento MT e avaliação regional da dinâmica de crescimento MT dentro das saliências ramificados e / ou o bordo de ataque da ferida de ponta HUVECs nos permitiu ligar dinâmica de crescimento MT à morfologia HUVEC e migração.

Os protocolos descritos são designed para fornecer uma metodologia geralmente simples e altamente repetível para a cultura HUVEC e investigação experimental. No entanto, muitos dos pormenores de protocolos são complexos e morosos, o que, por sua vez, proporciona uma oportunidade para erros ou dificuldades em conduzir a metodologia experimental. Embora tenha sido tentado resolver problemas potenciais ao longo do protocolo, aqui é fornecida solução de problemas adicionais, detalhado de potenciais problemas que são menos comuns ou de outra forma abreviada como notas dentro dos protocolos de metodologia.

Relacionado com lamelas de revestimento com substratos de poliacrilamida (Protocolo de 2,2), um problema comum que se levanta é a natureza complexa da activação de lamelas de vidro, o acoplamento de poliacrilamida para o vidro, a activação de poliacrilamida, e depois acoplamento ECM para a poliacrilamida. Um passo particularmente difícil e potencialmente problemática é a cultura de células HUVEC sobre o gel de f ibronectina / poliacrilamida após a exposição do poliAlamelas revestidas com crylamide a 2 mM de sulfo-SANPAH (passo 2.2.2.6, supra). É crítico para o sucesso da cultura de células HUVEC sobre estes substratos que sulfo-SANPAH ser completamente removido do sistema experimental que se segue conjugação ECM. Isto pode ser melhor conseguida por lavagem com ddH2O e incubando as lamelas em ddH2O num agitador durante a noite. Se as células cultivadas sobre as ECMs poliacrilamida não sobrevivem, ou se a viabilidade é menor do que o esperado, o aumento e a lavagem repetida da sulfo-SANPAH após conjugação a fibronectina (passo 2.2.2.9) é recomendado para potencialmente aliviar este problema.

Relacionadas com Protocol 3 (transfecção cDNA e da cultura HUVEC em uma lamela), uma grande influência para o sucesso do processo de eletroporação é a manipulação das HUVECs tanto durante tripsinização das células para removê-los do frasco de plástico, e após a conclusão da a electroporação (passos 3,3-3,4, supra). É crítico para cuidarmonitorar completamente o HUVEC enquanto em tripsina, e não deve exceder o tempo necessário para que as células "round-up" na superfície do balão (normalmente 1-2 minutos). tempo excessivo em tripsina é uma das principais causas de morte de HUVEC, que normalmente não é realizada até que as células são plaqueadas em lamelas revestidas com fibronectina (passo 3.4) e, em seguida, deixar de anexar ao substrato.

De importância semelhante, HUVECs (ea maioria dos tipos de células primário) não se saem bem quando suspenso por longos períodos no buffer de eletroporação. Durante as experiências em maior escala, por exemplo, onde o utilizador tem cinco ou mais condições que requerem a electroporação, é preferível manter as células sedimentadas em tubos individuais (um tubo por transfecção) e misturá-los, uma-a-uma-vez , no tampão de electroporação imediatamente antes da electroporação. Esta aproximação minimiza o tempo de incubação em tampão de electroporação e sobrevivência HUVEC maximizada. Além disso, o salvamento imediato em meios de cultura completos é também Critical Após a electroporação. atrasos de resgate de mais uma sequência eletroporação minuto ou pode resultar em quase morte completa HUVEC e, portanto, deve ser evitado.

Relacionado ensaio de migração de células (Protocolo 9), a técnica de cultura de HUVEC a extremamente alta densidade depende de uma modificação crítica (descrito no passo 9.2) da metodologia de cultura celular tradicional HUVEC (descrito no Protocolo 3) que requer a secagem da lamela fibronectina revestido , a fim de permitir que a cultura de HUVEC a uma área muito pequena da lamela. Muitas vezes, se a lamela não é completamente seca ou se o revestimento antes de a lamela com fibronectina (passos 2.1 ou 2.2) não foi eficaz, as células contendo meios de comunicação que é colocada sobre a lamela irá perder a sua tensão superficial e expandir-se para o arestas da lamela, reduzindo assim a densidade de células na lamela. Um método para resolver este problema potencial é para aspirar a mídia da lamela e, em seguida,colocar a lamela (ainda na sua placa de 35 mm) para a parte de trás do armário de segurança biológica durante 5-10 min. Esta adaptação pode ajudar a permitir que o fluxo de ar dentro do armário para ajudar na secagem do prato. Se qualquer líquido visível permanece sobre a lamela depois de secagem ao ar, aspirar os pontos líquidos e novamente deixar secar ao ar durante 5-10 minutos adicionais na cabine de segurança biológica. É importante notar que não há nenhuma maneira de evitar completamente este problema potencial, mas torna-se menos de um problema com a prática repetida do protocolo. É também uma recomendação solução de problemas que, na preparação para o ensaio de lamelas migração de células (ou de qualquer ensaio, em geral), para preparar lamelas adicionais e tem HUVECs extras pronto-a-go em caso de problemas ao longo do caminho.

Com estas considerações de resolução de problemas em mente, também é importante destacar a utilidade dos protocolos discutidos e suas implicações na investigação em biologia celular futuro. A aplicabilidade ao polyacrabordagem carboxílico é amplo, e inclui não apenas estudos bidimensionais de engajamento célula-ECM (descrito acima), mas também investigações tridimensionais 5. Esta aplicação é fundamental para aumentar a nossa compreensão de como HUVECs regular a forma e migração celular em ambientes fisiológicos e deve fornecer aos investigadores uma compreensão básica de como as mudanças morfológicas são coordenadas com as alterações do citoesqueleto. Embora os protocolos descritos aqui estão focados nas medições da dinâmica do crescimento MT, a maioria dos protocolos pode e deve ser adaptado para medir qualquer número de outros aspectos microscopicamente mensuráveis ​​de interacções célula-ECM. Com relação à dinâmica MT, há inúmeros mapas, incluindo pelo menos 14 famílias de kinesins 89, cada um com um papel potencial na contribuição para HUVEC polaridade e migração dirigida, e tudo o que pode ser investigadas utilizando os protocolos apresentados.

futuras investigações deve umlso ser alvo de envolvimento célula-ECM no normal versus estados doentes. HUVEC protocolos aqui apresentados são aplicáveis ​​para investigações de processos homeostáticos vasculares normais, bem como para estados de doença, incluindo doença cardíaca, a retinopatia, o crescimento de tumores e metástases, para citar alguns. Conjugando visivelmente transparentes ECM e poliacrilamida substratos de conformidade receptivo com os estudos microscópicos permitirá estudos de noivado célula-ECM tais que a angiogênese vascular endotelial pode ser monitorada com alta resolução espacial e temporal. Estes tipos de abordagens experimentais já começaram a revelar diferenças importantes na forma da célula endotelial, polaridade, a migração e os efeitos de proteínas que regulam estes processos 5,31,90. Os futuros esforços devem visar a identificação como a combinação de conformidade ECM e mechanosensing dimensionalidade pode servir para localmente proteínas de controle que têm como alvo e regulam a dinâmica do citoesqueleto.

Acknowledgments

Um agradecimento especial ao Dr. Clare M. Waterman para orientação e discussões, Michelle Baird e Mike Davidson para fornecer muitas das construções de cDNA fluorescentes utilizadas nestes estudos, e Kathryn Applegate e Gaudenz Danuser para o desenvolvimento de software de análise de plusTipTracker MT. Este trabalho foi apoiado, em parte, por uma concessão para KAM from the Heart, Lung Blood Institute (NHLBI) e os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Nacional. (Grant: 4K22HL113069).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aurora A Inhibitor I Selleck Chemicals S1451
2% Bis solution Bio-Rad 1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilane Sigma-Aldrich A3648
40% acrylamide Bio-Rad 1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module Agilent Technologies 99462
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter Chroma Technology Corp. ET455/50m
ET525/36m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET525/36m
ET605/70m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET605/70m
ET700/75m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction V RPI Products A30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device camera Andor Technology 77026010
Cy3 donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250
Dyelight 649 goat anti-rat Jackson ImmunoResearch 112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) Lonza CC-4143
Fetal bovine serum 25 ml
Bovine brain extract 2.0 ml
Gentamycin sulfate 0.5 ml
Epidermal growth factor 0.5 ml
Hydrocortisone 0.5 ml
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)  10.0 ml
EGTA Sigma-Aldrich E3884-100G
Electronic shutter Sutter instrument 77016099
Fibronectin EMD Millipore FC010
Glutaraldehyde Thermo Fisher Scientific S80026
HALT Protease inhibitor Thermo Fisher Scientific PI-78425
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HRP goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-036-062
HRP goat anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 162-0174
Lanolin Thermo Fisher Scientific 8006-54-0
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643-500G
Microscope Nikon TiE MEA53100
Motorized stage ASI Technologies MS-2000
Mounting medium Dako CS70330-2
Mouse anti-Aurora A Abcam ab130156
Mouse anti-GAPDH Abcam ab9484
Mouse anti-MCAK Abcam ab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A) Cell Signaling Technology 3873S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NIS Elements software Nikon MQS310000
Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 Contains the electroporation buffer
Paraffin Thermo Fisher Scientific P31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) MP Biomedicals 91670249
Petroleum jelly Dow Corning 2021854-1113
Pipes Sigma-Aldrich P6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFP Abcam ab290
Rabbit anti–pT288–Aurora A Abcam ab18318
Rat anti–α-tubulin AbD Serotec MCA78G
Sodium borohydride Thermo Fisher Scientific 678-10
Spinning disk  Andor Technology Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH Thermo Fisher Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP151-500
Trypsin Corning MT25053CI
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337

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