Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genetische en biochemische benaderingen voor Published: July 27, 2016 doi: 10.3791/54271
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wales Heart Research Institute, Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences

Introduction

Skeletachtige en hartspier contractie wordt geactiveerd door sarcoplasmatisch reticulum Ca 2+ vrijlating bemiddeld door RyR. Er zijn drie zoogdierlijke RyR isovormen met functionele kanaal bestaat uit vier identieke subeenheden. Elk RyR subeenheid bestaat uit een grote cytoplasmatische regulerende N-terminaal deel en een kleine C-eindstandige gedeelte dat de transmembraandomeinen die een hoge geleidbaarheid Ca2 + poriën vormen. Abnormale intra- en inter-subunit interacties ten grondslag liggen RyR dysfunctie en resulteren in neuromusculaire en hartstoornissen 1. De identificatie en karakterisering van specifieke domeinen betrokken bij RyR structuur: functie relatie is daarom van cruciaal belang voor het begrijpen van RyR pathofysiologie.

Traditionele biochemische eiwit-eiwit interactie technieken vereisen aanzienlijke hoeveelheden gezuiverd eiwit, vaak geproduceerd in bacteriën. Dit is niet mogelijk bij de RyR, een zeer groot membraan pProtein samengesteld ~ 5000 aminozuren, terwijl de recombinante fragmenten lastig om bacterieel expressiesysteem en zuivering. Aldus worden alternatieve expressiesystemen waarbij eukaryote gastheercellen nodig voor zoogdierlijke integrale membraaneiwitten. We hebben eerder werkzaam Y2H, co-IP als verknoping assays gezamenlijk zien dat N-terminus tetramerisatie is een structureel kenmerk dat wordt bewaard in de drie zoogdierlijke RyR isovormen 2,3. Belangrijk, hebben we gevonden dat een enkele puntmutatie geassocieerd met aritmogene hartziekte verstoort N-terminus zelfassociatie en resulteert in een disfunctioneel RyR kanaal 4. We hebben ook gebruikt deze technieken oligomerisatie studies van de RyR cytoplasmische C-terminale staart 5 en de N-terminus van de homologe intracellulaire Ca2 + releasekanaal, inositol 1,4,5 trisfosfaatreceptor 2.

In de Y2H assay, de interactiop twee eiwitten (X en Y) wordt gemeten door de reconstitutie van een functionele transcriptiefactor (GAL4) en de daaropvolgende activering van reportergenen 6-9. Twee verschillende kloneringsvectoren worden gebruikt voor fusies van de twee geteste eiwitten met de twee fysiek gescheiden onafhankelijke domeinen van GAL4 genereren: DNA-bindingsdomein (DNA-BD) / eiwit X-fusie (lokaas) en activatiedomein (AD) / eiwit Y fusion (doel). De Y2H kan worden gebruikt om te testen of een eiwit interageert met zichzelf door het genereren GAL4 DNA-BD en AD fusies van hetzelfde eiwit. Genetisch gemodificeerde Y2H stammen GAL4 en GAL80 deficiënte (GAL80 het eiwit een repressor van GAL4), en TRP1 en LEU2 deficiënte (om de voedingswaarde selectie voor lokaas en prooi plasmiden, respectievelijk). In de gist kern, worden de recombinant DNA-BD en AD peptiden in dichte fysieke nabijheid gebracht om een ​​hybride GAL4 transcriptiefactor produceren slechts door middel van hun fusies 'X: Y interaction. Deze benadering maakt een snelle genetische screening op eiwit-eiwit interacties te detecteren via de parallelle transcriptionele activering van prototrofe (HIS3 codering voor een enzym dat noodzakelijk is voor biosynthese histidine) en chromogene (LacZ codeert voor β-galactosidase (β-Gal)) reportergenen. Het belangrijkste voordeel van de Y2H is dat het een in vivo test die zelfs zwakke of voorbijgaande proteïne-proteïne interacties detecteert. Bovendien detectie omvat het eenvoudige gebruik van groeiselectie (in medium zonder histidine) of een colorimetrische (β-Gal) test zonder de noodzaak van zuivering van het aas en doeleiwitten of het genereren van specifieke antilichamen. Bovendien kan de Y2H worden gebruikt om een ​​verzameling van willekeurige onbekende klonen (cDNA klonen gefuseerd aan GAL4 AD) voor nieuwe bindingspartners van lokaas eiwitten, ook met directe toegang tot de cDNA-bibliotheek van het eiwit te screenen.

Om de Y2H waarnemingen uit te breiden, independent biochemische technieken kunnen worden toegepast. Co-IP als verknoping assays combinatie met immunoblotting zijn methoden voor eiwit associaties detecteren in complexe monsters, bijv., Gehele cellysaten 10. Hun voornaamste voordeel daarvan verslag eiwit-eiwit interacties van natief weefsel, in tegenstelling tot andere werkwijzen die het gebruik van recombinante eiwitten nodig. Recombinante eiwitten kunnen ook worden gebruikt, typisch uitgedrukt in een zoogdiercellijn, waar waarschijnlijk de juiste conformatie en post-translationele modificaties hebben, en subcellulaire lokalisatie. Aangezien co-IP en verknoping in vitro assays gebruikmakend van gehomogeniseerde cellen, is het noodzakelijk om te bevestigen of beide eiwitpartners zijn samen gelocaliseerd in de intacte cel 11. We routinematig gebruik transfectie van zoogdiercellen HEK293 cellen tijdelijk tot expressie zoogdier integrale membraan en cytosolische eiwitten met behulp van de calciumfosfaat precipitatie methode 2-4,12-14, Hier beschreven. Dit is een goedkope manier om het plasmide-DNA in cellen efficiënt te leveren, maar het is afhankelijk van de specifieke gebruikte cellijn en celconfluentie, alsook de zuiverheid van het plasmide-DNA 11,15.

De co-IP bepaling omvat het isoleren van de natieve of recombinant eiwit van interesse uit cellysaten onder niet-denaturerende omstandigheden die de co-zuivering van vermeende interactiepartners 10,16. Het vereist het gebruik van twee onafhankelijke antilichamen, de immunoprecipitatie antilichaam voor isolatie van eiwitten X, en immunoblotting antilichaam voor detectie van eiwit partner Y kan worden gebruikt om te testen of een eiwit interageert met zichzelf door het genereren van twee verschillende fusies met twee verschillende epitoop labels (bv., HA en cMYC). De immunoprecipitatie antilichaam wordt gebonden door zijn Fc-gebied op Proteïne-A (of Proteïne-G, afhankelijk van de diersoort waarbij het antilichaam werd opgewekt), dieis geconjugeerd aan agarose (of sepharose) hars. X eiwit wordt geprecipiteerd door het antilichaam: eiwit-A hars na incubatie met het cellysaat, namelijk de detergent oplosbare fractie van gehomogeniseerde cellen. Eiwit immuno-complexen worden geëlueerd met SDS-bevattende buffer en vervolgens geanalyseerd met SDS-PAGE en immunoblotting met een antilichaam tegen de aanwezigheid van eiwit Y 17 detecteren. Co-OT met detergens-oplosbare proteïnen worden uitgevoerd om overmatige niet-specifieke binding te voorkomen. De keuze van het wasmiddel en de concentratie, evenals het aantal wassingen, worden geoptimaliseerd voor elke X: Y pair 10,16,18.

Verknoping wordt toegepast om de stoichiometrie van het oligomeer eiwitcomplex bepalen. Het is gebaseerd op een chemische reactie om covalente bindingen tussen aangrenzende interactie protomeren maken, en daarom maakt behoud van oligomere status van het eiwit tijdens SDS-PAGE gescheiden. Er zijn tal van cross-linken reagen van verschillende lengte en chemie targeting verschillende reactieve groepen op eiwitten, gewoonlijk primaire aminen, carbon- of thiolgroepen. Hier beschrijven we het gebruik van glutaaraldehyde (OHC (CH 2) 3 CHO), een homo-bifunctionele verknoper met twee aldehydegroepen aan beide uiteinden die reageren met vrije amino- groepen in lysineresten 19,20. Verknoping gevolgd in een concentratie- en tijdsafhankelijke wijze waardoor adductvorming. Glutaaraldehyde reactie gestopt met hydrazine (H 2 NNH 2) en eiwit monsters worden vervolgens geanalyseerd met SDS-PAGE en immunoblotting 17 hun oligomerisatie toestand evalueren. We moeten er rekening mee dat de cross-linking heeft oligomerisatie opwekken maar slechts leidt tot stabiele bruggen tussen reeds bestaande eiwitcomplexen. Belangrijke overwegingen bij het ​​uitvoeren van vernettingsexperimenten omvatten de keuze verknopingsmiddel, zijn concentratie en reactietijd 19,20.

Protocol

1. Gist twee-hybride

  1. gist Transformatie
    1. Bereid de volgende media en buffers:
      1. Bereid gist volledige gistextract-pepton-dextrose (YPD) medium door mengen van 20 g / l pepton, 10 g / l gistextract, 2% w / v glucose (toegevoegd na autoclavering) en 20 g / l agar (voor platen) met ; steriliseer in de autoclaaf en het gebruik van vers op de dag van het experiment.
      2. Bereid gist minimaal synthetisch gedefinieerd (SD) medium (ontbreekt leucine en tryptofaan selectieve druk op beide aas en doel plasmiden te houden) door mengen van 6,7 g / l giststikstofbase, 1,6 g / l wegfilteren supplement ontbreekt leucine en tryptofaan, 2% w / v glucose (toegevoegd na autoclavering) en 20 g / l agar (voor platen alleen); steriliseer in de autoclaaf en het gebruik van vers op de dag van het experiment.
      3. Bereid 50% w / v PEG (polyethyleenglycol) 3350; steriliseer door een 0,2 urn filter en opslag bij kamertemperatuur.
      4. Bereid 100 mM Tris / 10 mM EDTA (10x TE), aan te passende pH op 7,5, steriliseer door een 0,2 urn filter en opslag bij kamertemperatuur.
      5. Bereid 1 M lithium acetaat (10x LiAc); breng de pH op 7,5 met CH3COOH, steriliseer door een 0,2 urn filter en opslag bij kamertemperatuur.
    2. Revive de Y2H stam (bijv Y190) door uitstrijken een kleine hoeveelheid van de bevroren glycerol voorraad op een YPD plaat. Incubeer bij 30 ° C tot gistkolonies bereikt ~ 2 mm in diameter (gewoonlijk 3-5 dagen, afhankelijk van de giststam).
    3. Inoculeer 0,5 ml YPD (in een 1,5 ml tube) met een enkele, grote (2-3 mm in diameter) kolonie. Vortex krachtig gedurende ~ 2 minuten om eventuele klonten verspreiden.
    4. Transfer celsuspensie in een kolf van 500 ml met 50 ml YPD medium. Incubeer bij 30 ° C gedurende 16-18 uur onder schudden bij 250 rpm gist stationaire fase bereikt.
    5. Transfer 4-5 ml van de overnacht cultuur in 200 ml YPD (in een 1 L erlenmeyer) tot een optische dichtheid bij 600 nm te produceren (OD 600, gemetenonder toepassing van een spectrofotometer) van 0,2-0,3 (200 ml is voldoende voor 20 transformaties).
    6. Incubeer bij 30 ° C onder schudden bij 250 rpm tot cellen in mid-log fase, dwz OD 600 = 0,5-0,6 (gewoonlijk 2-3 uur).
    7. Gist oogst door centrifugatie (in 50 ml buizen) en 1500 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, resuspendeer elke pellet in 5 ml steriele H 2 O en zwembad samen.
    8. Re-centrifuge bij 1500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant. Resuspendeer gist pellet in 1 ml vers bereid, steriel 1x LiAc / TE.
      OPMERKING: Gebruik bevoegde gistcellen binnen 1 uur van voorbereiding.
    9. Bereid plasmide monsters (in 1,5 ml buizen) door toevoeging van 200 ng plasmide-DNA voor interne transformaties of 0,5-1 ug van elk plasmide DNA voor co-transformaties, en 100 ug haring testes carrier DNA (gekookt gedurende 20 min en afgekoeld op ijs juist voor gebruik).
      OPMERKING: Neem een positieve controle, bijvoorbeeld gist.Co-getransformeerd met pVA3 (coderend voor het GAL4 DNA-BD fusie met p53 eiwit) en pTD1 (codering voor GAL4 AD fusie met SV40 grote T antigen).
    10. Voeg 100 ul van de vers bereide, competent gistsuspensie (stap 1.1.8) en 600 ul van 1x LiAc / PEG-oplossing (8 ml van de PEG 3350, 1 ml van de TE, 1 ml voorraad LiAc) en vortex voor ~ 30 sec. Incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten onder schudden bij 200 rpm.
    11. Voeg 80 pl dimethylsulfoxide (10% v / v eindconcentratie) en meng door voorzichtig omkeren. Heat shock gedurende 15 min in een 42 ° C waterbad onder mengen elke 2-3 min.
    12. Chill celsuspensie op ijs gedurende 2 minuten en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 15 sec bij KT om gist te herstellen.
    13. Resuspendeer de cel pellet in 100 ul 1x TE en plaat op geschikte minimale SD medium platen voor selectieve groei (medium zonder leucine en tryptofaan aan selectieve druk op zowel aas en target plasmiden te houden).
    14. Incubeer de platen up-side-down op 30° C totdat kolonies ~ 2 mm (gewoonlijk 4-5 dagen). Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 2-3 weken; voor langere opslag te maken glycerol voorraden en bewaar bij -80 ° C.
      OPMERKING: Controleer of aas en doeleiwitten worden tot expressie gebracht in gist door immunoblotting 17, en dat ze niet autonoom reportergen activatie wanneer afzonderlijk tot expressie gebracht in gist (door β-Gal assay zoals beschreven in paragraaf 1.3).
  2. Kolonie-lift Filter Paper β-Gal Assay
    1. Bereid de volgende buffers:
      1. Bereid Z buffer die 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2PO 4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO 4; breng de pH op 7,4. Steriliseren in autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur.
      2. Bereid X-gal buffer door oplossen van 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside aan 20 mg / ml in N, N-dimethylformamide en bewaar in het donker bij -20 ° C. Bereid Z buffer / X-Gal oplossing. maak buffervoor gebruik door het mengen van X-gal aan 0,33 mg / ml en β-mercaptoethanol bij 0,27% v / v in Z-buffer. Gebruik 2,5 ml per monster.
    2. Voeg 2,5 ml vers bereide Z buffer / X-Gal oplossing in een schone 100 mm plaat en plaats in een cellulose filter papier.
    3. Plaats een nieuw filterpapier op het oppervlak van de plaat met de gist kolonies te testen. Wrijf het filter papier op de plaat met een tang en laat ~ 5 min voor kolonies te bevestigen.
      NB: Verwerk de positieve controle in parallel, dat wil zeggen, gist co-getransformeerd met pVA3 en pTD1..
    4. Til het filter papier en onderdompelen (met een pincet) in een pool van vloeibare stikstof gedurende 30 seconden (vloeibare stikstof moet met zorg worden behandeld; Draag altijd dikke handschoenen en een veiligheidsbril). Laat de bevroren filterpapier dooi bij kamertemperatuur gedurende ~ 2 min.
    5. Breng het filter (kolonie kant naar boven) bovenop de geweekte filterpapier in de 100 mm plaat en incubeer bij 30 ° C.
    6. controleer regelmatig(Elk ~ 30 min) voor het verschijnen van blauwe kolonies. Gist Y190 co-getransformeerd met de positieve controle plasmiden (pVA3 + pTD1) zal blauw binnen 60 min (niet gepubliceerde waarnemingen) draaien.
      LET OP: Zwak aas: target interacties kan enkele uren duren om een ​​positief signaal te produceren blauw (vermijd langdurige incubatie (> 8 uur), die vals-positieve resultaten kunnen geven). Voor het beste resultaat, gebruik vers mede-getransformeerde kolonies, dat wil zeggen, gegroeid bij 30 ° C gedurende 4 -. 5 dagen, ~ 2 mm in diameter.
  3. Liquid Culture β-Gal Assay
    1. Bereid de volgende buffers:
      1. Bereid Z buffer die 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2PO 4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO 4; breng de pH op 7,4, steriliseer in de autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur.
        1 M Na 2 CO 3; bewaar bij kamertemperatuur.
      2. Bereid Z buffer / β-mercaptoethanol. Voeg buffer voor gebruik door het toevoegen van β-mercaptoethanol at% 0,27 v /v Z buffer; Gebruik 700 ul per monster. Bereid Z buffer / ONPG oplossing. Voeg buffer voor gebruik door het mengen van ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galactopyranoside) en 4 mg / ml en β-mercaptoethanol bij 0,27% v / v in Z-buffer; Gebruik 160 ul per monster.
    2. Gebruik een kolonie 5 ml minimaal SD inoculeren (leucine en tryptofaan ontbrak selectieve druk op beide aas en doel plasmiden te houden) en incubeer bij 30 ° C gedurende 16-18 uur onder schudden bij 250 rpm.
      LET OP: Assay vijf afzonderlijke kolonies co-getransformeerd met hetzelfde aas en target plasmiden.
    3. Transfer genoeg van de overnacht cultuur in 10 ml vers SD-medium tot een OD 600 = 0,2 produceren - 0,3. Incubeer bij 30 ° C onder schudden bij 250 rpm tot de cellen in mid-log fase (OD 600 = 0,5-0,6).
    4. Transfer 0,5 ml gistcultuur in een 1,5 ml buis en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Noteer de exacte OD 600 bij het ​​oogsten van de ceLLS. Resuspendeer pellet in 100 ui buffer Z; Dit resulteert in een 5-voudige concentratiefactor.
    5. Plaats de buis in vloeibare stikstof voor ~ 1 min (vloeibare stikstof moet met zorg worden behandeld; Draag altijd dikke handschoenen en een veiligheidsbril) en vervolgens in een 37 ° C waterbad gedurende 3 minuten te ontdooien. Herhaal deze vries-dooi cyclus tweemaal te verzekeren cellen opengebroken.
    6. Stel een lege buis met 100 ui buffer Z.
    7. Voeg 700 ul van buffer Z / β-mercaptoethanol en 160 pl buffer Z / ONPG het monster en blanco buizen; start de timer en plaats in een 30 ° C incubator.
    8. Controleer regelmatig voor de gele kleur te ontwikkelen. Voeg 400 ul van 1 M Na 2 CO 3 kleurontwikkeling te stoppen en de verstreken tijd te registreren in minuten. Gist Y190 co-getransformeerd met de positieve controle plasmiden (pVA3 + pTD1) wordt geel binnen 60 min ..
      OPMERKING: Zwak aas: target interacties kan enkele uren duren om een ​​positief signaal geel Voor de beste re producerensultaten Gebruik vers co-getransformeerde kolonies, dwz, gekweekt bij 30 ° C gedurende 4 -. 5 dagen, ~ 2 mm in diameter.
    9. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur celresten pellet en breng het supernatans in een schone cuvet.
    10. Gebruik van een spectrofotometer meet de absorptie bij 420 nm (420 A) van de monsters ten opzichte van de blanco (waarden moet tussen 0,02-1,0).
    11. Bereken β-galactosidase eenheden, waarbij 1 eenheid gedefinieerd als de hoeveelheid die 1 umol hydrolyseert ONPG tot o-nitrofenol en D-galactose per minuut per cel, volgens de volgende formule:
      vergelijking 1 = Β-galactosidase eenheden
      Waar: t: verstreken tijd van de incubatie (in minuten); . cf: de concentratiefactor uit stap 1.4.8, dwz cf = 5; OD 600: wanneer de cellen werden geoogst.

2. eiwitexpressie in een zoogdiercellijn

  2. Bereid de volgende media en buffers:
    1. Bereid groeimedium door mengen DMEM met 4,5 g / l glucose, 10% v / v foetaal runderserum en 2 mM L-glutamine; steriliseer door een 0,2 um filter en bewaar bij 4 ° C.
    2. Bereid 2x Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS 2x) door mengen van 280 mM NaCl, 10 mM KCI, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 12 mM glucose, 50 mM Hepes; op pH 7,05, steriliseer door een 0,2 um filter en bewaar bij -20 ° C. Bereid 2,5 M CaCl 2. Sterilisatie door een 0,2 um filter en bewaar bij -20 ° C.
  3. Eén dag voor transfectie, zaad 1-2 x 10 6 HEK293 cellen in een 100 mm petrischaal om 60-70% confluent de volgende dag. Kweek gedurende 16-18 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
  4. Op de dag van de transfectie, verwijder de oude medium en diervoeders cellen met 10 ml vers groeimedium.
    NOTITIEAntibiotica worden weggelaten uit het kweekmedium tijdens transfectie omdat celdood verhogen.
  5. Verdun 24 ug plasmide DNA (voor co-transfecties gelijke molaire verhouding van de twee plasmiden) en 60 pl 2,5 M CaCl2 in 600 ui totaal volume (gemaakt met steriel gedeïoniseerd H 2 O) in een 1,5 ml buis; vortex te mengen.
    Opmerking. Voor de hoogste transfectie efficiëntie moet plasmide-DNA van de hoogste zuiverheid, dat wil zeggen, een Abs 260/280-verhouding Abs = ~ 1,8.
  6. Voeg het plasmide DNA / calcium oplossing druppelsgewijs in een 50 ml buis met 600 ui 2x HBS onder voortdurend en krachtig mengen door vortexen. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van calciumfosfaat / plasmide-DNA-complexen mogelijk maken.
  7. Na 20 min incubatie vortex kort wijze voeg de oplossing vallen op de cellen om het gehele oppervlak van de 100 mm petrischaal dekken.
  8. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO
  9. Oogst de cellen 24 uur na transfectie door centrifugatie bij 1000 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur Verwijder de bovenstaande vloeistof. Celpellets worden opgeslagen bij -80 ° C totdat het nodig is.
    LET OP: Expression pieken meestal 24-72 uur na transfectie.
  • Cell homogenisering
    1. Bereid de volgende buffers:
      1. Bereid Co-IP homogenisatie buffer door het mengen van 150 mM NaCl, 20 mM Tris; breng de pH op 7,4 en bewaar bij 4 ° C.
      2. Bereid Verknoping homogenisatiebuffer door 5 mM Hepes, 0,3 M sucrose; breng de pH op 7,4 en bewaar bij 4 ° C (filter voor gebruik om alle deeltjes te verwijderen). Aangevuld met proteaseremmers voor gebruik.
    2. Voeg 250 ul van glasparels (425-600 micrometer) in een 1,5 ml buis en wassen met 500 pl homogenisatiebuffer. Pellet glasparels door een korte centrifugerenpuls (1000 g gedurende 5 sec) en verwijder het supernatant. Herhaal deze wasstap eens te meer.
    3. Resuspendeer celpellet (uit stap 2.1.8) in 500 pl ijskoude homogenisatiebuffer en breng de celsuspensie in de glasparels bevattende buis.
    4. Homogeniseer cellen op ijs door 20 doorgangen door een fijne naald (23 G, 0,6 x 30 mm) bevestigd aan een 1 ml spuit. Met de buis kap gesloten, doorboren met de naald en verspreiden celsuspensie krachtig door de glazen kralen.
    5. Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om kernen en niet gebroken cellen te verwijderen en gooi de pellet. Sla de supernatant die de post-nucleaire fractie en ga direct naar co-IP of cross-linking naargelang het geval.

    • 3. In vitro biochemische methoden

    1. Co-immunoprecipitatie
      1. Bereid de volgende buffers:
        1. Bereid Co-IP homogenisatiebuffer zoals beschreven in seel 2.2.1.1. Bereid IP buffer door het mengen van 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% (w / v) CHAPS, 2 mM dithiothreïtol (optioneel, dithiothreitol kunnen eiwit aggregaten die kunnen gevormd door luchtoxidatie dalen); breng de pH op 7,4 en bewaar bij 4 ° C.
        2. Bereid 2% w / v CHAPS in co-IP homogenisatiebuffer; bewaren bij 4 ° C.
        3. Bereid Eiwit-laadbuffer door het mengen van 60 mM Tris, 2% w / v SDS, 10% v / v glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% w / v broomfenolblauw, 2% v / v β-mercaptoethanol (optioneel); breng de pH op 6,8 en bewaar bij kamertemperatuur.
      2. Homogeniseren van de cellen van een confluente 100 mm petrischaal (~ 8 x 10 6 cellen of HEK293, geteld met behulp van een hemocytometer) zoals beschreven in paragraaf 2.2.
      3. Oplosbaar de post-nucleaire subcellulaire fractie met 0,5% CHAPS (met de 2% voorraad) en incubatie gedurende ≥2 uur bij 4 ° C onder constant mengen. Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om de onoplosbare materialen te pelleterenal en gooi de pellet. Sla het bovenstaande genoemd cellysaat.
        OPMERKING: De opname van een detergens en het verwijderen van het onoplosbare materiaal absoluut noodzakelijk te minimaliseren aspecifieke binding. . Tussenproduct wasmiddelen, bijvoorbeeld CHAPS of Triton X-100 in een concentratie van 0,2-1%, zijn de meest gebruikte.
      4. Bereid twee afzonderlijke 1,5 ml buisjes en voeg 20 ul ~ (afhankelijk IgG bindingsvermogen) van 6 mg / ml proteïne-A of proteïne-G agarose (of sepharose) korrels. Wassen met 200 pl IP buffer.
        OPMERKING: Kies de juiste Ig-bindend hars afhankelijk van de diersoort die de immunoprecipitatie antilichaam verhogen. Proteïne-G bindt een breder Ig subtypen vergelijking met proteïne-A.
      5. Herstel kralen door centrifugering bij 1500 g gedurende 2 min bij 4 ° C. Herhaal wassen opnieuw met IP buffer, daarna resuspendeer kralen in 200 ul IP buffer.
      6. Voeg 1 ug (5 ng / pl) van de immunoprecipitatie antilichaam of niet-immune IgG (naardienen als negatieve controle) in de twee verschillende proteïne-A / G bevattende buizen. Incubeer gedurende ≥2 uur bij 4 ° C onder constant mengen.
        OPMERKING: Altijd verwerken negatieve controle met het gebruik van niet-immune IgG opgewekt in dezelfde diersoort als de immunoprecipitatie antilichaam.
      7. Herstel kralen door centrifugering bij 1500 g gedurende 2 min bij 4 ° C en voorzichtig het supernatant door pipetteren ontdoen.
      8. Transfer 200 ul cellysaat (uit stap 3.1.3) in elk van de twee buizen met antilichaam en Proteïne-A / G kralen. Incubeer gedurende ≥2 uur bij 4 ° C onder constant mengen om voor antigeen-antilichaambinding.
      9. Herstellen kralen en wassen met 200 ui buffer IP; Incubeer 10 min bij 4 ° C onder mengen. Herstellen kralen en was tweemaal (vaak meerdere wasbeurten die zowel specifieke en niet-specifieke binding te verminderen). gooi voorzichtig het supernatant door pipetteren.
      10. Voeg 30 ul proteïne-laadbuffer elueren immunoprecipitated eiwitten. Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C, verwijder de kralen en bewaar de bovenstaande vloeistof die het geëlueerde co-IP monster.
      11. Om succesvol eiwit X precipitatie verifiëren, laadt een kleine hoeveelheid (1/10, 3 ul) van de co-IP monster op een SDS-PAGE gel te worden geanalyseerd door immunoblotting met 17 antilichaam specifiek voor proteïne X. Neem een monster van de cellysaat eiwit X expressie te controleren in je steekproef.
      12. Om te testen op de aanwezigheid van co-geprecipiteerd eiwit Y, laadt de rest (9/10 th, 27 pl) van de co-IP monster op een aparte SDS-PAGE-gel worden geanalyseerd door immunoblotting met antilichaam specifiek 17 voor eiwit Y. omvatten een monster van het cellysaat eiwit Y verificatie van expressie in de steekproef.
    2. Chemische verknoping
      1. Bereid de volgende buffers:
        1. Verknoping homogenisatiebuffer zoals beschreven in paragraaf 2.2.1.1.
        2. Bereid 5x pProtein-laadbuffer door het mengen van 300 mM Tris, 10% w / v SDS, 50% v / v glycerol, 25 mM EDTA, 0,05% w / v broomfenolblauw, 10% v / v β-mercaptoethanol (optioneel); breng de pH op 6,8 en bewaar bij kamertemperatuur; verwarm bij 50 ° C vóór gebruik.
      2. Homogeniseren van de cellen van een confluente 100 mm petrischaal (~ 8 x 10 6 cellen of HEK293, geteld met behulp van een hemocytometer) zoals beschreven in paragraaf 2.2.
        OPMERKING: Sucrose (at 0,3M) wordt gebruikt om een ​​iso-osmotische buffer te creëren. Zout, bijvoorbeeld 120-150 mM NaCl of KCl kan worden gebruikt, maar afhankelijk van het oligomeer eiwitcomplex plaats.
      3. Centrifugeer de post-nucleaire subcellulaire fractie bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet proteïneaggregaten en bewaar het supernatant. Neem acht monsters van 20 pl elk (meestal ~ 20 ug eiwit) in afzonderlijke 0,5 ml buizen.
      4. Voeg 0,0025% v / v glutaaraldehyde alle monsters en start de timer. Laat elk van de acht monsters reageren met glutaraldehyde bij KT: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min.
        LET OP: Glutaraldehyd heeft twee aldehydegroepen die reageren met vrije aminen. Gebruik geen pH buffers of andere stoffen met primaire aminogroepen omdat glutaaraldehyd reactie zal doven.
      5. Stop glutaaraldehyde reactie op de aangegeven tijd met 2% v / v hydrazine en voeg 5 pl 5x eiwit-laadbuffer eiwitten denatureren.
      6. Ga verder met SDS-PAGE en immunoblotting 17.

    Representative Results

    In het Y2H systeem, het aas wordt prooi interactie aanvankelijk getest door gistgroei selectie in medium zonder (tryptofaan, leucine en) histidine vervolgens β-Gal enzymatische activiteit assays (figuur 1) geëvalueerd. Gist gekweekt in medium zonder histidine heeft trage groei die afhangt van de sterkte van het aas: prooi eiwit interactie. De β-Gal assay wordt uitgevoerd in gist uitgevoerd (gekweekt in medium zonder enige tryptofaan en leucine) hetzij groeien op vaste drager (agarplaten) of in vloeibare kweek, waarbij de laatste opbrengst kwantitatieve resultaten. We hebben met succes gebruik gemaakt van de Y2H aan domein-domein interacties binnen de RyR2 alsook nieuwe eiwit partners 2-4,12,21,22 identificeren. Zo gescreend wij een reeks overlappende constructen die de gehele lengte van de RyR2 peptidesequentie voor interactie met een N-eindstandig fragment (AD4L: RyR2 residuen 1-906 gefuseerd met GAL4 AD). 3 Kolonie-lift filterpapier β-Gal assays produceerde levendige blauwe-gekleurde gist kolonies alleen voor de BT4L: AD4L pair (Figuur 2A), waaruit blijkt dat AD4L interageert met zichzelf, namelijk de BT4L construct (RyR2 residuen 1-906 versmolten met GAL4 DNA-BD). Lichtblauwe kolonies werden gedetecteerd voor de BT8: AD4L pair suggereert een secundaire zwakkere associatie met de extreme C-terminale domein (BT8), terwijl gist co-getransformeerd met een andere constructie bleef wit en daarom negatief voor aas: prooi eiwit interactie. Kwantitatieve resultaten verkregen door vloeibare β-Gal assays (figuur 2B), aangegeven robuust BT4L: AD4L interactie gelijk in sterkte aan de bekende associatie tussen het p53 eiwit (pVA3) en SV40 grote T antigen (pTD1), terwijl de BT8: AD4L interactie was aanzienlijk zwakker (<10% in vergelijking met controle).

    We routinematig uit te voeren co-IP-experimenten (figuur 3) fadat tijdelijke expressie in een zoogdiercellijn (HEK293), als onafhankelijk biochemische assay voor het Y2H bevindingen 2-4,12-14,21-24 versterken. Om RyR2 N-terminus zelf-interactie verifiëren twee verschillende plasmiden die coderen voor RyR2 residuen 1-906 gelabeld met hetzij de cMYC of HA peptide-epitoop (BT4L en AD4L, respectievelijk), gecotransfecteerd in HEK293 cellen onder toepassing van de calciumfosfaatprecipitatiewerkwijze 3. De post-nucleaire fractie van gehomogeniseerde cellen werd gesolubiliseerd met het detergens CHAPS en het onoplosbare materiaal werd verwijderd door centrifugatie om het cellysaat te produceren. Het cellysaat behandeld met het reductiemiddel dithiothreïtol, werd vervolgens geïncubeerd met HA Ab en Proteïne-A sepharose korrels HA-gelabeld AD4L immunoprecipitatie. Co-IP monsters geëlueerd met SDS-bevattende buffer, werden op twee verschillende SDS-PAGE gels (1/10 en 9/10 ste split) en geanalyseerd door immunoblotting met Ab en HA Ab cMYC, respectively. Succesvolle direct IP van AD4L (~ 100 kDa) van HA Ab werd geverifieerd door immunoblotting, maar niet in de negatieve controle met niet-immuun konijn IgG (Figuur 4A). Belangrijker cMYC-tag BT4L (~ 100 kDa) werd gewonnen alleen in de HA Ab IP, en niet in de negatieve controle in de afwezigheid van immunogeprecipiteerd AD4L (figuur 4B).

    Y2H en co-IP assays bedoeld consistent bewijs voor RyR2 N-terminus zelf-interactie, maar ze niet informeren over de oligomerisatie toestand van het N-terminale domein, namelijk of vormt slechts dimeren of hoger complexen. Opgemerkt zij dat complexen dissociëren en alleen de subeenheden omvat wordt gedetecteerd door SDS-PAGE door SDS- en warmte-geïnduceerde eiwit denaturatie intrekking van eiwit-eiwit interacties. Om dit te voorkomen, gebruiken we verknoping (figuur 5) die chemisch stabiel en verbindt bestaand Protein oligomeren, waarvan de moleculaire massa kan vervolgens worden onderzocht door SDS-PAGE size scheiding 2-5. Bijvoorbeeld, HEK293 cel homogenaat expressie cMYC-BT4L, behandeld met het reductiemiddel dithiothreïtol omgezet met glutaaraldehyde en geanalyseerd door SDS-PAGE en immunoblotting met behulp Ab cMYC (figuur 6). Naast het monomeer (~ 100 kDa), een hoge molecuulmassa eiwitband van ~ 400 kDa werd gedetecteerd in een tijdsafhankelijke wijze aangeeft RyR2 N-terminus tetrameer formatie 3. Opmerkelijk tetrameer het overheersende oligomere species met minimale dimeer en trimeer banden waargenomen. Zijn schijnbaar molecuulgewicht te bepalen werd de BT4L oligomeer gescheiden door middel van 4-15% gradiënt SDS-PAGE gels 3. Wij produceerden de molecuulmassa / gelretardatie standaardkromme middels eiwitstandaarden met een bereik van 30-460 kDa, en berekenden we het oligomeer tot 358 kDa zijn 15 (n = 4). Dit schijnbare molecuulgewicht is in overeenstemming met een BT4L tetrameer aangebracht in eengesloten cirkelmode plaats achter elkaar geplaatst, zoals verwacht van de opstelling van de vier subeenheden binnen de natieve RyR2 kanaal.

    Figuur 1
    Figuur 1. Y2H Flowchart. Gist, co-getransformeerd met aas en target plasmiden, is geselecteerd voor groei in medium zonder histidine en / of getest op β-Gal enzymatische activiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 2
    Figuur 2. Y2H stelt RyR2 N-terminus Domain Self-interactie. (A) Schematische beeltenis van de (aas) series van de menselijke RyR2 overlappende eiwitfragmenten getest in het Y2H systeem voor interactie met de RyR2 N-terminale AD4L (roof) construct. Kwalitatieve resultaten verkregen door kolonie-lift filtreerpapier β-Gal testen worden vermeld in "+" multiples of "-" negatieve interactie (B) Kwantitatieve vloeistof β-Gal assays genormaliseerd tegen de positieve controle (pVA3 codeert voor het GAL4 DNA-BD. fusie met p53 eiwit; pTD1 codeert voor GAL4 AD fusie met SV40 grote T antigen). Gewijzigd ten opzichte van 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 3
    Figuur 3. Co-IP Stroomdiagram. Zoogdiercellen, gecotransfecteerd met plasmiden X en Y, gehomogeniseerd en detergens oplosbaar gemaakt om het cellysaat gebruikt in de co-IP assay, gevolgd door SDS-PAGE en immunoblotting produceren.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 4
    Figuur 4. Co-IP geeft RyR2 N-terminus domein Self-interactie in zoogdiercellen. HEK293-cellen werden geco-transfecteerd voor transiënte co-expressie van cMYC-gemerkte (BT4L) en HA-gemerkte (AD4L) RyR2 N-uiteinde domein ( resten 1-906). AD4L werd immunogeprecipiteerd met HA Ab van CHAPS-gesolubiliseerde en dithiothreitol behandelde lysaat HEK293, dat als negatieve controle, co-IP assays met niet-immune konijnen IgG werden uitgevoerd. Immunologisch neergeslagen eiwitten werden verwarmd bij 85 ° C gedurende 5 min en opgelost bij 20 mA gedurende 3 uur via afzonderlijke 6% SDS-PAGE-gelen geladen met 1/10 of 9/10 ste van IP monsters. Na eiwit overdracht op 80 V gedurende 2 uur op polyvinylidene difluoride membraan werd immunoblotting analyse uitgevoerd onder toepassing van (1: 1000 verdunning) Ab HA (A) of Ab cMYC (B), gevolgd door mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-muis IgG (1: 10.000 verdunning) en versterkte chemiluminescentie detectie (1 min blootstelling). Een monster van cellysaat, 1/50 ste van de hoeveelheid verwerkte IP monsters werd ook opgenomen om massastandaard als moleculaire dienen. Gewijzigd ten opzichte van 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 5
    Figuur 5. Stroomschema Verknoping. Zoogdiercellen getransfecteerd met plasmide X, gehomogeniseerd en onderworpen aan reactie met glutaaraldehyde in de verknopende assay, gevolgd door SDS-PAGE en immunoblotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    figuur 6
    Figuur 6. Verknoping Geeft RyR2 N-terminus domein tetrameer Vorming HEK293 cellen werden voor transiënte expressie van cMYC-gemerkte (BT4L) RyR2 N-terminus domein (resten 1-906).. Celhomogenaat, behandeld met het reductiemiddel dithiothreitol, geïncubeerd met glutaaraldehyde gedurende de aangegeven tijdstippen. Monsters werden verwarmd tot 85 ° C gedurende 5 min en opgelost door SDS-PAGE (6% gel) bij 20 mA gedurende 3 uur. Na overdracht proteïne bij 80 V gedurende 2 uur op polyvinylideendifluoridemembraan, werd immunoblotting analyse uitgevoerd onder toepassing van (1: 1000 verdunning) Ab cMYC, gevolgd door mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-muis IgG (1:10.000 verdunning) en versterkte chemiluminescentie detectie (1 min blootstelling). Monomeer (M: ~ 100 kDa) en tetramere (T) vormen zijn aangegeven met de pijlen. Gewijzigd ten opzichte van 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Discussion

    De vorming van eiwit homo-oligomeren is een fundamenteel biologisch proces dat de activiteit van transcriptiefactoren, enzymen, ionkanalen en receptoren 25,26 regelt. Belangrijker eiwit oligomerisatie ook pathologische gevolgen zoals neurodegeneratie en aritmogene hartziekte 4,27. De in dit artikel beschreven methoden worden gebruikt voor het domein-domein interacties bemiddelen eiwit zelf-associatie en oligomerisatie te identificeren. Hieronder, wijzen we op kritische stappen binnen elk protocol, en bespreken we belangrijke overwegingen, beperkingen en het oplossen van problemen.

    Het systeem kan Y2H eerste screenen op potentiële interagerende proteïne partners vanwege zijn relatief hoge throughput screening, gebruiksgemak en zeer reproduceerbare resultaten worden toegepast. Y2H procedures worden uitgevoerd in een microbiologisch laboratorium uitgevoerd met standaard (plaat of shaker) incubators en ruimte opvangvoorzieningen. Het gebruik van freshly bereid competente cellen (stap 1.1.8) is van cruciaal belang voor een hoog rendement gist transformatie, terwijl voor de beste resultaten in β-Gal assays, vers geteelde gist kolonies (tot 5 dagen oud) moeten worden gebruikt (stap 1.2.3). Systemen op basis van andere dan GAL4 en / of aanvullende / alternatieve reportergenen transcriptiefactoren zijn, en dus aas en prooi plasmiden moeten worden afgestemd op de juiste Y2H stam.

    Sommige stammen moeten gekweekt in aanwezigheid van 3-amino-1,2,4-triazool, een competitieve remmer van het HIS3 eiwit, om elke constitutieve expressie van het HIS3-reportergen 7,8 blussen. Expressie van aas en doel fusie-eiwitten moeten worden geverifieerd door immunoblotting 17. Indien aas / prooi fusie-eiwitten zijn toxisch voor gist, kunnen lagere toelaatbare eiwitniveaus worden bereikt door kloneren in verschillende vectoren waarin aas / prooi expressie wordt aangedreven door een andere promoter. Voorts is het essentieel om te waarborgen that aas / prooi fusie-eiwitten niet autonome reporter gen-activiteit weer te geven. Autonome reportergen activatie kan worden gered door wijziging van de construct aan de verantwoordelijke gebied te verwijderen, of door het omwisselen van de GAL4 DNA-BD en AD fusies voor de twee geteste eiwitten. Bovendien worden transmembraandomeinen beter weggelaten aas / prooi constructen omdat ze foutief vouwen of mislocalisatie van fusieproteïnen in intracellulaire membraancompartimenten induceren. Inderdaad, het belangrijkste nadeel van het systeem is dat Y2H het aas en doeleiwitten zijn gelokaliseerd in de nucleus gist buiten hun fysiologische subcellulaire locatie en potentieel ontbreekt specifieke posttranslationele modificaties, waardoor vals-positieve of vals-negatieve interacties 6-9 .

    Zoogdierlijke heterologe expressiesystemen zijn beter geschikt voor de studie van zoogdieren integrale membraaneiwitten qua conformatie, post-translationele modificaties en subcellulaire lokalisatie.Een van de meest gebruikte methoden celtransfectie de calciumfosfaatprecipitatie, voornamelijk vanwege de minimale apparatuur en reagentia nodig 11,15. Alternatieve methoden, namelijk elektroporatie, liposomen, kationische lipiden en polymeren kunnen hogere transfectie-efficiëntie afhankelijk van de cellijn werd verkregen en de bouw gebruikt. In het algemeen, de primaire factoren die de transfectie-efficiëntie plasmide-DNA kwaliteit en mobiele gezondheid / betrouwbaarheid. De beste resultaten worden bereikt wanneer plasmide-DNA van de hoogste zuiverheid (260 nm / 280 nm absorptie verhouding van ~ 1,8) en actief delende cellen worden gebruikt. De cellen moeten daarom worden getransfecteerd met niet meer dan 60 - 70% confluentie (stap 2.1.2), omdat de mogelijkheid op te nemen vreemd DNA heeft betrekking op het oppervlak van de cel blootgesteld aan het medium 11. Bovendien is integratie van antibiotica in het kweekmedium tijdens transfectie (stap 2.1.3) afgeraden vanwege de toegenomen celdood 15.

    Fof calciumfosfaatprecipitatie in het bijzonder, een zorgvuldige voorbereiding en pH-aanpassing (om 7.05 precies) van de 2x HBS-oplossing (stap 2.1.1), en een goede vorming van het plasmide DNA / calcium / fosfaat-complexen door krachtig mengen (stap 2.1.5) zijn kritische stappen voor een hoge efficiëntie transfectie. Gewoonlijk eiwitexpressie door kortstondige transfectie pieken binnen 24-72 uur.

    Zodra cellen worden geoogst, volgende procedures worden uitgevoerd bij 4 ° C tot protease-activiteit te minimaliseren, en toevoeging van proteaseremmers aanbevolen. Cel homogenisatie moet worden gevolgd door een centrifugatie stap om kernen te verwijderen omdat chromosomaal DNA oplossingsviscositeit kan verhogen en aspecifieke binding. Aldus wordt homogenisatie door mechanische middelen in een iso-osmotische buffer voorkeur meestal (0,3 M) of sucrose (150 mM) NaCl. In het algemeen zijn sucrose gebaseerde buffers bekend eiwit stabiliteit en verminderen mogelijke niet-natief eiwit aggregatie, maar door preferentiële hydratatie op het eiwitoppervlak, worden elektrostatische eiwit-eiwit interacties begunstigd. Omgekeerd, zout gebaseerde buffers invloed op de netto lading van geladen aminozuurzijketens groepen op het eiwit oppervlak, dus met een voorkeur voor meer hydrofobe interacties op basis 28.

    Co-IP is de meest gebruikte biochemische assay voor eiwit-eiwit interacties te evalueren bijzonder van natief weefsel. Het belangrijkste nadeel is de behoefte aan zeer specifieke antilichamen gevalideerd voor gebruik in IP en immunoblotting 10,16,18. Derhalve worden recombinante eiwitten vaak gecodeerd met peptide-epitoop, bv., Influenza hemagglutinine (YPYDVPDYA) of humaan cMYC (EQKLISEEDL), waarvoor hoge affiniteit specifieke antilichamen zijn commercieel verkrijgbaar. Desgewenst kan de immunoprecipitatie antilichaam chemisch worden geconjugeerd op de Eiwit-A hars om de elutie en detectie tijdens immunoblotting fase die kunnen verhullen gecoprecipiteerd pr voorkomenotein 16; Daartoe hebben we met succes de chemische verknopingsmiddel 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. Het is noodzakelijk dat een geschikt reinigingsmiddel is bij de IP buffer en het onoplosbare materiaal van gehomogeniseerde cellen verwijderd door centrifugeren om niet-specifieke binding (stap 3.1.3) te verminderen. De keuze en concentratie van detergens zijn belangrijke overwegingen: meer detergentia en / of hogere concentraties aanzienlijk verminderen niet-specifieke binding, maar kan ook X opheffen: Y eiwit interactie, terwijl lagere concentraties of mildere detergentia toestaan ​​dat een zwakke interactie waar te nemen maar kunnen leiden tot excessieve niet-specifieke binding. Tussenliggende sterkte wasmiddelen de voorkeur, bijvoorbeeld, Triton X-100 0.5 -. 1% concentratie. Om verder te verlagen niet specifieke binding, een neutrale eiwit (bijvoorbeeld runderserumalbumine bij 100 ug / ml) kunnen in de IP buffer, en / of het cellysaat kan vooraf Cleared met voorafgaande incubatie met eiwit-A hars alleen. Het aantal wasbeurten worden geoptimaliseerd voor de X: Y paar testte, gewoonlijk drie 10-min wassen met IP buffer (stap 3.1.9). In ieder geval, een co-IP monster met niet-immune IgG als immunoprecipitatie antilichaam moet altijd parallel verwerkt als negatieve controle (stap 3.1.6) dienen.

    Het belangrijkste voordeel van chemische verknoping die informeert over de stoichiometrische samenstelling van de homo-oligomeer eiwit. Glutaaraldehyde is een veelgebruikte vernetter omdat het vereist geen speciale apparatuur en genereert thermisch en chemisch stabiele verknopingen tussen interagerende eiwitten 19,20. Verbindingen met vrije aminogroepen worden weggelaten assay buffer (stap 3.2.1) omdat de chemische reactie zal doven. Glutaaraldehyde concentratie en reactietijd (stap 3.2.4) worden geoptimaliseerd voor het oligomeer eiwitcomplex plaats. Het grootste nadeel van deze techniek, especibondgenoot wanneer deze wordt uitgevoerd op de gehele cel voorbereidingen, is de niet-specificiteit van de chemische reactie die kunstmatige eiwit aggregaten die biologische betekenis ontberen kan opleveren.

    Alternatief in vivo (bijv. Fluorescentie-energieoverdracht, bi-moleculaire fluorescentie of luminescentie complementatie) en in vitro technieken (bijv., Grootte-uitsluitingschromatografie, analytische ultracentrifugatie isothermische titratie calorimetrie) zijn te karakteriseren eiwit zelf-associatie en beoordeling oligomerisatiegraad stoichiometrie 29,30. Elke methode heeft zijn eigen voor- en nadelen, en het is misschien beter voor de studie van een specifiek eiwit afhankelijk eiwitreiniging / stabiliteit en uitrusting / reagentia beschikbaar zijn. De drie complementaire werkwijzen hier beschreven, namelijk Y2H, co-IP en verknoping, zijn gebruikt in combinatie dwingend bewijs voor RyR2 homo-oligomevorming r in afzondering en binnen een levende cel.

    Disclosures

    De auteurs hebben niets te verklaren.

    Acknowledgments

    Dit werk werd ondersteund door de British Heart Foundation Fellowships voor SZ (FS / 08/063 en FS / 15/30/31494).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    PART 1 yeast two-hybrid
    Plate incubator Hereaus B6120 Used at 30 °C
    Orbital shaker incubator New Brunswick Scientific INNOVA 4300 Used at 30 °C with shaking at 230 - 250 rpm
    Spectrophotometer Perkin Elmer Lambda Bio+ To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay
    Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit Takara Clontech K1604-1 Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2  and yeast strain Y190 
    Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y0626 To prepare minimal SD growh medium 
    Dropout supplement lacking leucine and tryptophan Sigma-Aldrich Y0750 To prepare minimal SD growh medium 
    Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine Sigma-Aldrich Y2001 To prepare minimal SD growh medium 
    Herring testes carrier DNA  Takara Clontech 630440 For yeast transformation
    Whatman filter paper Grade 5  Sigma-Aldrich WHA1005070 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
    X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich B4252 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
    ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich N1127 for use in liquid b-Gal assay
    PART 2. Protein expression in a mammalian cell line
    HEK293 cell line ATCC ATCC® CRL-1573™
    Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) SANYO MCO-18AIC To culture mammalian cells
    DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) Invitrogen (ThermoFisher) 41966 To prepare growth medium for mammalian cells
    Fetal Bovine Serum Invitrogen (ThermoFisher) 10500 To prepare growth medium for mammalian cells
    Glass beads Sigma-Aldrich G8772 To homogenise cells
    Needle 23 G (0.6 x 30 mm) BD Microlance 300700 To homogenise cells
    Protease inhibitor cocktail (Complete)  Roche 11873508001 To prevent proteolysis
    PART 3. In vitro biochemical methods 
    Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) Bio-Rad 1658000EDU  For polyacrylamide gel electrophoresis
    Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) Bio-Rad 1703940 For electrophoretic transfer
    Compact X-ray film processor Xograph X4 For use in immunoblotting
    Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 For use in chemical cross-linking
    Protein-A sepharose beads  GE Healthcare Life Sciences 17-5280-01  For use in co-IP assay
    Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-805 For use in co-IP assay
    Non-immune rabbit IgG Santa Cruz Biotechnology  sc-2027 For use in co-IP assay
    Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology  sc-40 For use in immunoblotting
    Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) Covance MMS-101P For use in immunoblotting
    Anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005 For use in immunoblotting
    Hyperfilm ECL GE Healthcare Life Sciences 28906836 For use in immunoblotting
    ECL Western Blotting Substrate Pierce (ThermoFisher) 32106 For use in immunoblotting

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Structural and functional interactions within ryanodine receptor. Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).
    2. Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels. Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).
    3. Zissimopoulos, S., et al. N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).
    4. Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors. Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).
    5. Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail. Biochem J. 376, 795-799 (2003).
    6. Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).
    7. Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits. Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).
    8. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
    9. Yang, M., Wu, Z., Fields, S. Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system. Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).
    10. Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. Curr Protoc Immunol. , (2007).
    11. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. , (2003).
    12. Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein. FEBS letters. , (2013).
    13. Zissimopoulos, S., Lai, F. Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain. J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).
    14. Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease. Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).
    15. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
    16. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).
    17. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
    18. Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes. Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).
    19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).
    20. Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis. Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).
    21. Zissimopoulos, S., Lai, F. Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6. Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).
    22. Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin. J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).
    23. Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein. J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).
    24. Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart. J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).
    25. Ali, M. H., Imperiali, B. Protein oligomerization: how and why. Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).
    26. Hashimoto, K., Panchenko, A. R. Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).
    27. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).
    28. Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation. Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).
    29. Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. The detection and quantitation of protein oligomerization. Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).
    30. Kaczor, A. A., Selent, J. Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods. Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).

    Tags

    Molecular Biology chemische verknoping co-immnoprecipitation zoogdiercel transfectie oligomerisatie ryanodinereceptor zelfassociatie yeast two-hybrid
    Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Stanczyk, P. J., Lai, F. A.,… More

    Stanczyk, P. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study. J. Vis. Exp. (113), e54271, doi:10.3791/54271 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter