Introduction
골격과 심장 근육의 수축 RyR에 의해 매개 근질 세망 칼슘 2 + 릴리스에 의해 트리거됩니다. 4 개의 동일한 서브 유닛으로 구성 기능 채널 세 포유 동물 RyR 이성체가있다. 각 서브 유닛 RyR 큰 세포질 규제 N 말단 부분 및 고 컨덕턴스 칼슘 기공을 형성하는 막 관통 도메인을 포함하는 작은 C 말단 부위로 구성된다. 이상 인트라 간 서브 유닛 상호 작용은 RyR 채널 기능 장애의 기초 및 신경 근육 및 심장 질환 1 초래한다. RyR 구조에 관련된 특정 도메인의 식별 및 특성 : 함수 관계는 RyR의 병태 생리의 이해 때문에 매우 중요하다.
전통적인 생화학 단백질 - 단백질 상호 작용을 기술들은 박테리아에서 생산 된 정제 된 단백질의 상당한 양을 필요로한다. 이것은 RyR 매우 큰 막 (P)의 경우에는 가능하지그 재조합 파편이 박테리아 발현 및 정제에 쉽게 의무가없는 반면 rotein는 ~ 5000 개의 아미노산으로 구성. 따라서, 진핵 숙주 세포를 포함하는 다른 발현 시스템들은 포유 동물 세포막 단백질이 요구된다. 우리는 이전에 집합 N 말단 테트라은 세 포유 동물 RyR가 2,3 이소 폼에 걸쳐 보존하는 구조적 기능이 있음을 입증하는 Y2H, 공동 IP 및 가교 시험 법을 사용하고있다. 중요한 것은, 우리는 부정맥 심장 질환과 관련된 하나의 점 돌연변이는 N 말단 자체 협회 및 장애 RyR 채널 4의 결과를 방해 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 RyR 세포질 C- 말단 꼬리 5뿐만 아니라 동종 세포 내 칼슘 방출 채널의 N 말단, 이노시톨 1,4,5- trisphosphate 수용체 (2)의 올리고머 화 연구에 이러한 기술을 적용하고있다.
Y2H 분석에서, interacti사이에 두 개의 단백질 (X 및 Y)는 기능적인 전사 인자 (GAL4) 리포터 유전자 6-9의 계속되는 활성의 재구성에 의해 측정된다. DNA 결합 도메인 (DNA-BD)를 / 단백질 X 융합 (미끼) 및 활성화 도메인 (AD) / 단백질 Y : 두 개의 다른 클로닝 벡터는 GAL4의 두 개의 물리적으로 분리 독립 도메인이 두 시험 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용되는 융합 (대상). Y2H은 단백질이 GAL4 DNA-BD와 같은 단백질의 AD 융합체를 생성하여 그 자체와 상호 작용하는지 여부를 테스트 할 수있다. 유전자 Y2H 균주합니다 (GAL80 단백질이 GAL4의 리프레입니다) 결핍 GAL4 및 GAL80을하는 수정뿐만 아니라 TRP1과 결핍는 Leu2로 (각각 미끼 먹이 플라스미드에 대한 영양 선택을 제공하기 위해). 효모 핵 재조합 DNA-BD와 AD 펩티드는 그들의 융합체 'X 통해 하이브리드 GAL4 전사 인자 생산 물리적으로 근접하게된다 : Y의 INTeraction. 이 방법은 리포터 유전자 (β-갈 락토시다 제 (β-갈)에 대한 LacZ를 인코딩) 및 발색 (AN 히스티딘 생합성에 필요한 효소를 HIS3 인코딩) prototrophic의 병렬 전사 활성화를 통해 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 신속 유전자 검사를 할 수 있습니다. Y2H의 주요 장점은 심지어 약하거나 과도 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 생체 내 분석법이 있다는 것이다. 또한, 검출은 미끼 및 대상 단백질의 정제 또는 특정 항체의 생성을위한 필요없이 간단한 (미디어 부족 히스티딘에서) 성장을 선택의 사용 또는 비색의 (β-갈) 분석을 포함한다. 또한 Y2H 또한 라이브러리 단백질의 cDNA의 직접 액세스를 제공하는 베이트 단백질의 신규 결합 파트너에 대한 임의의 알려지지 클론 (GAL4의 AD에 융합 된 cDNA 라이브러리 클론)의 컬렉션을 스크리닝하는데 사용될 수있다.
Y2H 관측을 확장하려면, independENT 생화학 기법이 사용될 수있다. 공동 IP 면역 및 결합 가교 검정 복합 시료 혼합물 단백질 연관을 검출하도록 사용되는 방법, 예를 들면., 전체 세포 용 해물 (10)이다. 그들의 주요 장점은 재조합 단백질의 사용을 필요로하는 다른 방법과 달리, 기본 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한보고한다는 것이다. 재조합 단백질은 일반적으로 그들의 정확한 형태 및 번역 후 변형을 가질 가능성이있는 포유 동물 세포주뿐만 아니라, 세포 내 자국어로 표현을 사용할 수있다. CO-IP 및 가교 시험 관내 분석은 균질 세포의 활용에 있기 때문에 그러나, 두 파트너 단백질이 그대로 전지 (11)에서 공동화되어 있는지 여부를 확인할 필요가있다. 우리는 일상적으로 일시적으로 칼슘 포스페이트 침전 법 2를 사용하는 포유 동물 세포막 및 세포질 단백질을 발현하는 포유류 HEK293 세포의 형질 감염을 사용-4,12-14는 여기에 상세하게 설명했다. 이것은 효과적으로 균체 내에 플라스미드 DNA를 전달하는 저렴한 방법이지만 특정 사용한 세포주 및 세포 합류뿐만 아니라 플라스미드 DNA 11, 15의 순도에 의존한다.
공동 IP 분석은 추정 작용 파트너 10,16의 CO 정화를 가능하게 비 - 변성 조건하에 세포 용 해물로부터 관심 천연 또는 재조합 단백질의 분리를 포함한다. 두 개의 상이한 에피토프 다른 두 융합체를 생성함으로써 단백질 자체와 상호 작용하는지 여부를 테스트하는 것이 이용 될 수있는 두 개의 독립 항체의 사용, 단백질 X의 분리를위한 immunoprecipitating 항체 및 단백질 파트너 Y.의 검출을위한 면역 항체를 필요 태그 (예., HA 및 cMyc). immunoprecipitating 항체 단백질-A에서의 Fc 영역을 결합 (단백질 G, 항체가 발생 된 동물의 종에 따라 OR)되는아가로 오스 (또는 세 파로스)를 수지에 접합된다. 단백질 X는 항체에 의해 침전되어 단백질 수지 파쇄 균질화 셀 즉 세제 가용 분획과 인큐베이션 다음. 단백질 면역 복합체는 SDS 완충액을 함유이어서 SDS-PAGE로 분석 한 결과, 단백질의 존재 Y (17)를 검출하기 위해 항체를 사용하여 면역 블 용출된다. 공동 IP 과도한 비 - 특이 적 결합을 방지하기 위해 세제 수용성 단백질로 수행되어야한다. Y 쌍 10,16,18 : 세제 및 농도의 선택뿐만 아니라, 세척 횟수, 각 X에 대해 최적화되어야한다.
가교 올리고머는 단백질 복합체의 화학량 론을 결정하기 위해 사용된다. 이것은 인접한 상호 protomers 간의 공유 결합을 생성하는 화학 반응에 기초하고, 따라서, SDS-PAGE 분리 중에 단백질의 올리고머 상태의 보존을 가능하게한다. 다수의 가교 reage이 있습니다단백질, 일반적으로 주 아민, 카르 복실 또는 티올 그룹에 서로 다른 반응 그룹을 대상으로 다양한 길이 및 화학 국세청. 여기서, 우리는 글루 타르 알데히드의 사용을 설명 (OHC (CH 2) 3 CHO), 리신 잔기 (19, 20)에 존재하는 유리 아미노 그룹과 반응 양단에 두 개의 알데히드기를 가진 호모 이관 능성 가교제. 가교 결합은 부가 형성에 기인하는 농도 - 또는 시간 의존적으로 이어진다. 글루 타르 알데히드의 반응은 히드라진 (H 2 NNH 2) 단백질 시료 후 SDS-PAGE 분석 및 올리고머 화 상태를 평가하기 위해 17로 면역 블되어 정지된다. 우리는 올리고머를 유도하지 않는 가교를 참고하지만 단순히 기존의 단백질 복합체 사이의 안정된 다리를 작성해야합니다. 가교 실험을 수행 중요한 고려 가교제의 농도와 반응 시간 (19, 20)의 선택을 포함한다.
Protocol
1. 효모 두 하이브리드
- 효모 변환
- 다음 미디어와 버퍼를 준비합니다
- 20g / L 펩톤, 10g / L의 효모 추출물, w 2 % / V 포도당 (고압 증기 멸균 후에 추가) 및 20g / L의 한천을 혼합하여 효모 전체 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 (YPD) 매체를 준비합니다 (판에만 해당) ; 고압 증기 멸균에 의해 살균과 실험의 날에 신선한 사용합니다.
- 6.7 g / 효모 질소베이스의 L, 1.6 g / L 드롭 아웃 보충 부족 류신과 트립토판, 2 % w를 혼합하여 (모두 미끼 및 대상 플라스미드에 선택적 압력을 유지하기 위해 부족 류신과 트립토판) 효모 최소 합성 정의 (SD) 매체 준비 / V 포도당 (판 만)을 (고압 증기 멸균 후에 추가) 및 20g / L 한천; 고압 증기 멸균에 의해 살균과 실험의 날에 신선한 사용합니다.
- w는 50 %를 준비 / PEG (폴리에틸렌 글리콜) 3350 V; RT에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 소독.
- 100 mM 트리스 / 10 mM의 EDTA (10 배 TE)를 준비, 조정7.5 pH는 RT에서 0.2 ㎛의 필터를 통해 살균 및 저장.
- 1 M 리튬 아세테이트 (LiAc들을 배)을 제조; , CH 3 COOH와 7.5 pH를 조정 RT에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 소독.
- YPD 접시에 냉동 글리세롤 주식의 작은 금액을 질주하여 Y2H 균주 (예, Y190)를 부활. 효모 식민지 직경 ~ 2mm에 도달 할 때까지 30 ° C에서 품어 (일반적으로 3-5일, 효모 균주에 따라 다름).
- 식민지 - (직경 3mm 2) 하나의 큰과 (1.5 ML 튜브에서) YPD 0.5 ml에 접종한다. 소용돌이는 적극적으로 2 ~ 분간은 덩어리를 분산합니다.
- 50 ㎖ YPD 배지를 함유하는 500 mL의 플라스크에 세포 현탁액을 전송. 정지상 도달하는 효모에서 250 rpm으로 진탕하면서 18 시간 - 16 30 ℃에서 인큐베이션.
- 전사 4 - (1 L 삼각 플라스크에) YPD 200 ㎖로 하룻밤 배양을 5 ml의 600 nm의 (OD 600에서 광 밀도를 생성하는 측정0.2의 분광 광도계)를 사용하여 - 0.3 (200 ml를하면) 20 변환에 대한 충분한 것입니다.
- 0.6 (보통 - 2 - 3 시간) 세포 중순 로그 단계, 즉, OD 600 = 0.5가 될 때까지 250 rpm으로 진탕 30 ° C에서 품어.
- 원심 분리하여 수확 효모 RT에서 5 분 1,500 XG에 (50 ml의 튜브). , 상층 액을 버리고 함께 멸균 H 2 O와 풀 5ml에 각 펠렛을 재현 탁.
- 다시 원심 분리기 RT에서 5 분 1,500 XG에와하면 상층 액을 버린다. 새로 제조, 멸균 1X LiAc들을 / TE 1 ㎖에 재현 탁 효모 펠렛.
참고 : 준비 1 시간 이내에 관할 효모 세포를 사용합니다. - 200 단일 변환에 대한 플라스미드 DNA의 NG, 0.5 추가 (1.5 ml의 튜브) 플라스미드 샘플을 준비 - 공동 변환에 대한 각각의 플라스미드 DNA 1 μg의, 그리고 청어 고환의 100 μg의 캐리어 DNA를 (20 분간 끓여에 냉각 )를 사용하는 얼음 직전.
참고 : 양성 대조군, 예를 들면 포함, 효모.공동 변환 pVA3 및 pTD1 (SV40 큰 T 항원과 GAL4의 AD 융합 인코딩) (GAL4 DNA-BD의 p53의 단백질과 융합 인코딩)와 함께. - 대한 새로 제조, 관할 효모 현탁액 (단계 1.1.8) 100 ㎕ 및 1 배 LiAc들을 / PEG 용액 600 μL (주 8 ml의 PEG 3350, 재고 TE 1 ㎖, 주식 LiAc들을 1 ㎖) 및 와류 추가 ~ 30 초. 200 rpm으로 진탕하면서 30 분 동안 30 ℃에서 인큐베이션.
- 디메틸 설폭 사이드 (10 % v / V를 최종 농도)의 80 μl를 추가하고 부드러운 반전으로 잘 섞는다. 3 분 - 42 ° C의 물을 욕조에 15 분 동안 열 충격은 매 2를 혼합하면서.
- 효모를 복구하기 위해 RT에서 15 초 동안 14,000 XG에서 2 분 원심 분리 얼음에 세포 현탁액을 진정.
- 적절한 최소한의 SD 매체 접시에 재현 탁 세포 1X TE 100 ㎕의 펠렛 및 플레이트 선택적 성장 (중간 모두 미끼와 대상 플라스미드에 선택적 압력을 유지하기 위해 류신과 트립토판이 부족).
- 최대 사이드 다운 (30)에서 번호판을 품어(- 오일 보통 4) 식민지 직경 ~ 2mm가 될 때까지 C를 °. 플레이트는 2 4 ° C에 저장할 수 있습니다 - 삼주; 더 이상 저장을 위해 -80 ° C에서 글리세롤 주식과 상점을 확인합니다.
참고 : 17 면역 블로 그 미끼 및 대상 단백질이 효모에서 발현되어 있는지 확인하고 (1.3 절에 기술 된 바와 같이 β-갈 분석에 의해) 별도로 효모에서 발현 때 자율적 리포터 유전자의 활성화를하지 않아도.
- 다음 미디어와 버퍼를 준비합니다
- 식민지 리프트 필터 종이 β-갈 분석
- 다음 버퍼를 준비합니다
- 100 밀리미터 나 2 HPO 4를 포함하는 Z 버퍼를 준비 40 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 10 밀리미터의 KCl, 1 mM의 황산; 7.4 pH를 조정합니다. 실온에서 고압 증기 멸균 및 저장에 의해 소독.
- 용해 X 갤런 완충액을 제조 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 β-D-갈 락토 -20 ℃에서 어둠 속에서, N, N 디메틸 포름 아미드 저장소 20 ㎎ / ㎖로. Z 버퍼 / X-걸 솔루션을 준비합니다. 버퍼를 확인Z 버퍼에 0.27 % v / V를에 0.33 ㎎ / ㎖ 및 β-머 캅토 에탄올에서 X-갈 혼합하여 사용하기 전에. 샘플 당 2.5 ml를 사용합니다.
- 추가 셀룰로오스 종이 필터 내부의 청소 100mm 플레이트와 장소에 갓 준비 Z 버퍼 / X-갈 용액 2.5 ml의.
- 효모 식민지를 분석 할 수와 판의 표면에 새 필터 종이를 놓습니다. 부드럽게 집게와 함께 접시에 여과지를 문질러 부착 식민지 ~ 5 분 동안 둡니다.
참고 :. 병렬 양성 대조군, 즉, 효모 pVA3 및 pTD1와 공동으로이 형질 전환을 처리합니다. - (; 항상 두꺼운 장갑과 고글을 착용 액체 질소 취급시주의해야한다) 여과지를 들어 올리고 30 초 동안 액체 질소의 수영장에 (포셉)를 잠수함. ~ 2 분 동안 실온에서 냉동 필터 종이 해동을 할 수 있습니다.
- 100 밀리 접시 안에 미리 적신 여과지 위에 여과지 (최대 콜로니 쪽)을 놓고, 30 ℃에서 배양한다.
- 주기적으로 확인블루 식민지의 모양에 대한 (매 ~ 30 분). 효모 Y190 공동 변환 양성 대조군 플라스미드 (pVA3 + pTD1)과 60 분 (게시되지 않은 관찰) 내에서 파란색으로 바뀝니다.
참고 : 약한 미끼 : 대상의 상호 작용 (장기 배양 거짓 긍정적 인 결과를 제공 할 수 있습니다 (> 8 시간)을 방지) 긍정적 인 푸른 신호를 생성하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면, 즉 갓 공동 변형 식민지를 사용, 4, 30 ° C에서 성장 -. 오일 ~ 직경 2mm입니다.
- 다음 버퍼를 준비합니다
- 액체 문화 β-갈 분석
- 다음 버퍼를 준비합니다
- 100 밀리미터 나 2 HPO 4를 포함하는 Z 버퍼를 준비 40 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 10 밀리미터의 KCl, 1 mM의 황산; 7.4로 pH를 조정 RT에서 고압 증기 멸균 및 저장에 의해 소독.
1 M 나 2 CO 3; RT에 저장합니다. - Z 버퍼 / β-머 캅토 에탄올을 준비합니다. 0.27 %의 V에서 β-머 캅토 에탄올을 첨가하여 사용하는 버퍼 전에 확인 /Z 버퍼의 V; 샘플 당 700 μl를 사용합니다. Z 버퍼 / ONPG 용액을 준비합니다. 이전 버퍼가 Z 버퍼에 v / V를 0.27 %에서 4 ㎎ / ㎖ 및 β-머 캅토 에탄올에 ONPG (오 니트로 페닐-β-D-갈 락토)를 혼합하여 사용할 수 있도록; 샘플 당 160 μl를 사용합니다.
- 100 밀리미터 나 2 HPO 4를 포함하는 Z 버퍼를 준비 40 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 10 밀리미터의 KCl, 1 mM의 황산; 7.4로 pH를 조정 RT에서 고압 증기 멸균 및 저장에 의해 소독.
- 250 rpm으로 진탕 18 시간 - (모두 미끼 및 대상 플라스미드에 선택적 압력을 유지하기 위해 부족 류신과 트립토판), 16 30 ° C에서 품어 최소한의 SD 배지 5 ㎖를 접종하는 하나의 식민지를 사용합니다.
참고 : 분석 다섯 별도의 식민지가 같은 미끼 및 대상 플라스미드로 형질 전환 공동. - 0.3 - OD 600 = 0.2를 생산하는 신선한 SD 배지 10 ㎖로 하룻밤 문화의 부족을 전송합니다. 세포 중순 로그 상 (- 0.6 OD 600 = 0.5)가 될 때까지 250 rpm으로 진탕 30 ° C에서 품어.
- RT에서 2 분 동안 14,000 XG에 1.5 ML 튜브와 원심 분리기로 효모 문화의 0.5 ml에 전송합니다. 세륨을 수확 할 때 정확한 OD 600을 기록LLS. Z 버퍼의 100 ㎕에 재현 탁 펠릿; 이 5 배 집중 계수가 발생합니다.
- 다음 37 ° C의 물을 욕조에 3 분 해동하는 액체 질소에 넣어 튜브 ~ 1 분 (항상 두꺼운 장갑과 고글을 착용 액체 질소 취급시주의해야한다). 세포가 열려 깨진되도록이 동결 해동주기를 두 번 더 반복합니다.
- Z 버퍼 100 ㎕와 함께 빈 튜브를 설정합니다.
- Z 버퍼 / β 머 캅토 에탄올 700 ㎕의 샘플 및 빈 튜브에 Z 버퍼 / ONPG의 160 μl를 추가; 30 ° C 배양기에서 타이머와 장소를 시작합니다.
- 노란색 개발을 위해 주기적으로 확인합니다. 색상 개발을 중지하고 분 경과 시간을 기록하는 1 M 나 2 CO 3의 400 μl를 추가합니다. 효모 Y190 공동 변환 양성 대조군 플라스미드 (pVA3 + pTD1)로 60 분 이내에 노란색으로 바뀝니다 ..
참고 : 약한 미끼 : 대상의 상호 작용이 가장 재에 대한 긍정적 인 노란색 신호를 생성하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다sults은 갓 공동 형질 콜로니를 사용하여 예 4 30 ℃에서 성장 -. 오일 ~ 2mm 직경. - 세포 파편 펠렛 깨끗한 큐벳에 뜨는을 전송하기 위해 RT에서 5 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기.
- 분광 광도계를 사용하여, (- 1.0 0.02 사이 여야 값) 블랭크에 대하여 샘플 (420) 내지 (420)에서의 흡광도를 측정한다.
- 다음 식에있어서, 오르토 니트로 셀 당 분당 D 갈락토오스 ONPG에 1 μmol을 가수 분해 양으로 정의 1 유닛, β 갈 락토시다 단위 계산 :
= β - 갈 락토시다 유닛
여기서 t (분) 배양의 경과 시간; . CF : 단계 1.4.8, 예로부터 집중 계수, CF = 5; OD (600) : 세포를 수확 할 때.
- 다음 버퍼를 준비합니다
= β - 갈 락토시다 유닛 포유 동물 세포 라인 2. 단백질 발현
- 다음 미디어와 버퍼를 준비합니다
- 4.5 g / L의 글루코스, 10 % V / V 소 태아 혈청 및 2 mM L- 글루타민으로 DMEM을 혼합하여 성장 배지를 준비; 4 ℃에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 소독.
- 280 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을을 혼합하여 2 배 헤 페스 - 완충 식염수 (2 × HBS)를 준비가 1.5mm 나 2 HPO 4, 12 mM의 글루코오스, 50 mM의 헤 페스; , 7.05로 pH를 조정 -20 ° C에서 0.2 ㎛의 필터를 통해 멸균 저장소. -20 ° C에서 0.2 μm의 필터와 저장소를 통해 2.5 M 염화칼슘 2. 소독을 준비합니다.
- 형질 전 어느 날, 씨 - 1의 순서로 100mm 페트리 접시에 2 × 10 6 HEK293 세포 60-70 %의 합류는 다음 날이 될 수 있습니다. 5 % CO 2와 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 18 시간 - 16 문화.
- 형질의 날, 신선한 성장 배지 10 ㎖로 기존의 매체 및 사료 세포를 제거합니다.
노트: 그들은 세포 사멸을 증가시킬 수 있기 때문에 항생제 형질 중에 배지에서 생략된다.- 600 μl의 총 부피의 2.5 M CaCl2를 60 μL (공동 형질 감염, 두 플라스미드의 동일한 몰비에 대한) 플라스미드 DNA의 24 μg의 희석 1.5 ML 튜브 내부 (멸균 탈 H 2 O로 만든); 와류 믹스합니다.
참고 :. 높은 형질 전환 효율을 위해, 플라스미드 DNA가 가장 높은 순도, 즉이어야하는 애비 (260) / 애비 (280) 비율 = ~ 1.8 있습니다.- 지속적으로 그리고 적극적으로 텍싱하여 혼합하면서 2 배 HBS 600 μl를 포함하는 50 ㎖ 튜브에 현명한 플라스미드 DNA / 칼슘 솔루션 드롭을 추가합니다. 칼슘 포스페이트 / 플라스미드 DNA 복합체를 형성 할 수 있도록 RT에서 20 분 동안 인큐베이션.
- 그리고 20 분 인큐베이션, 와류 잠시 후 100mm 배양 접시의 표면 전체 영역을 커버하는 셀에 현명한 용액 방울을 추가한다.
- 5 % CO에서 37 ° C에서 세포를 부화
- RT에서 3 분 1,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 24 시간 후 형질을 수확하고 상층 액을 버린다. 필요할 때까지 세포 펠렛은 -80 ° C에서 저장 될 수있다.
참고 : - 72 시간 포스트 형질 발현은 일반적으로 24 봉우리.- 다음 미디어와 버퍼를 준비합니다
- 다음 버퍼를 준비합니다
- 150 mM의 염화나트륨, 20 mM 트리스을 혼합하여 공동 IP 균질화 버퍼를 준비; 7.4 pH를 조정하고 4 ℃에서 저장한다.
- 5 mM의 헤 페스, 0.3 M 수 크로스를 혼합하여 균질화 완충액 크로스 가교 조제; 7.4 pH를 조정하고 (모든 입자를 제거하기 위해 사용하기 전에 필터) 4 ° C에 저장합니다. 사용 전에 프로테아제 억제제와 보완.
- 1.5 ML 튜브 내부 - (600 미크론 425) 및 균질화 버퍼의 500 μl를 씻어 유리 구슬 250 μl를 추가합니다. 간단한 원심 분리에 의해 펠렛의 유리 구슬펄스 (5 초 동안 1,000 XG)과 뜨는을 제거합니다. 다시 한번이 세척 단계를 반복합니다.
- 재현 탁 된 세포를 빙냉 균질화 완충액 500 μL (스텝 2.1.8)에서 펠릿과 유리 비드를 함유하는 튜브에 세포 현탁액을 전송.
- 1 ML의 주사기에 부착 된 미세 바늘을 통해 20 유로 (23 G, 0.6 X 30mm)에 의해 얼음에 세포를 균질화. 튜브 마개가 바늘 피어스 그것을 통해 폐쇄 및 유리 비드를 통해 격렬히 세포 현탁액으로 분산.
- 4 ° C에서 10 분 동안 1,500 XG에 원심 분리기는 핵 및 손상되지 않은 세포를 제거하고 펠렛을 삭제합니다. 이후 핵 부분을 나타내는 뜨는을 저장하고 직접하는 공동 IP 또는 크로스 연결 적절를 진행합니다.
3. 시험관 내 생화학 적 방법
- 공동 면역 침전
- 다음 버퍼를 준비합니다
- (S)에 기재된 공동 IP 균질화 완충액을 준비ection 2.2.1.1. 20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, 0.5 %를 혼합하여 IP 버퍼를 준비한다 (w / v)의 CHAPS, 2 mM의 디티 오 트레이 톨 (선택적, 디티 오 트레이 톨 인해 공기 산화에 형성 할 수있는 단백질 응집체를 줄이기 위해 포함될 수있다); 7.4 pH를 조정하고 4 ℃에서 저장한다.
- CO-IP 균질화 완충액 브이 CHAPS / w 2 % 준비; 4 ℃에서 저장한다.
- 60 mM 트리스 / SDS V, 10 % V / 브이 글리세롤, 5 mM의 EDTA, 0.01 % 파란색 V의 브로 모 페놀 / w, 2 % V / V의 β-머 캅토 에탄올 (옵션) w 2 %를 혼합하여 단백질 로딩 버퍼를 준비; RT에서 6.8 pH와 저장소를 조정합니다.
- 합류 100mm 배양 접시에서 세포를 균질화 (~ 8 × 106 세포 혈구를 이용하여 계산 HEK293, 경우) 2.2 절에 기술 된 바와 같이.
- 일정한 혼합 4 ° C에서 ≥2 시간 동안 후 핵 서브 셀룰러 0.5 % CHAPS와 비율 (2 %의 주식을 사용) 및 배양을 용해. 4 ° C에서 10 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기 불용성 materi를 펠렛알와 펠렛을 폐기합니다. 뜨는 불리는 세포 용 해물을 저장합니다.
주 : 세제 불용성 물질의 제거의 포함은 비특이적 결합을 최소화하기 위해 절대적으로 필요하다. . 중간체 세제, 예컨대, CHAPS 또는 트리톤 X-100, 0.2의 농도 - 1 %, 가장 일반적으로 사용된다. - 6 ㎎ / ㎖ 단백질 A 또는 단백질 G 아가로 오스 (또는 파로스) 비드 (IgG에 결합 용량에 따라) 두 개의 1.5 ml의 튜브를 준비하고 ~ 20 μl를 추가합니다. IP 버퍼의 200 μl를 씻으시오.
참고 : immunoprecipitating 항체를 제기하는 데 사용되는 동물 종에 따라 적절한 IG 결합 수지를 선택합니다. 단백질 G는 단백질-A에 비해 IG 서브 타입의 넓은 범위를 결합한다. - 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 구슬을 복구 할 수 있습니다. 한 번 더 IP 버퍼와 반복 세척 한 다음 IP 버퍼 200 μL에 비즈를 재현 탁.
- 에합니다 (immunoprecipitating 항체 또는 비 면역 IgG를 1 μg의 (5 NG / μL)를 추가두 개의 분리 된 단백질 A / G 들어있는 튜브에 부정적인 제어) 역할을한다. 일정한 혼합 4 ° C에서 ≥2 시간 동안 품어.
참고 : 항상 immunoprecipitating 항체와 같은 동물 종에서 제기 비 면역의 IgG의 사용과 음성 대조군을 처리합니다. - 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 구슬을 복구 조심스럽게 피펫으로 상층 액을 버린다.
- 항체 및 단백질 A / G 구슬 두 튜브의 각으로 (단계 3.1.3에서) 세포 용 해물의 200 μl를 전송합니다. 항원 - 항체 결합을 허용하는 일정한 혼합하여 4 ° C에서 ≥2 시간 동안 품어.
- 구슬 복구 및 IP 버퍼의 200 μl를 씻어; 혼합으로 4 ° C에서 10 분 동안 배양한다. (특정 및 비 특이 적 결합을 모두 줄일 여러 세척을 방지) 구슬을 복구하고 두 번 더 씻는다. 조심스럽게 피펫으로 상층 액을 버린다.
- immunoprecipit 용출 단백질 로딩 버퍼의 30 μl를 추가ated 단백질. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 원심 분리기, 구슬을 무시하고 용출 공동 IP 샘플을 포함 뜨는을 저장합니다.
- 성공적인 단백질 X 침전을 확인하기 위해, 분취 량을 포함 단백질 X. 특이 항체 17 발현 수준에서 분석하는 SDS-PAGE 겔상에서 공동 IP 샘플 소량 (1/10 번째 3 μL)을로드 세포 용 해물은 샘플의 단백질 X의 발현을 확인합니다.
- 별도의 SDS-PAGE 겔상에서 공동 IP 샘플의 나머지 (9/10 번째, 27 μL)를로드 공침 단백질 Y의 존재를 테스트하는 단백질 Y. 특이 항체 17 발현 수준으로 분석 할 샘플 Y 단백질 발현을 확인하기 위해 세포 용 해물의 분취 량을 포함한다.
- 다음 버퍼를 준비합니다
- 화학적 가교 결합
- 다음 버퍼를 준비합니다
- 섹션 2.2.1.1에 기재된 균질화 완충액 가교.
- 5 배 쪽을 준비rotein 로딩 버퍼 300 mM 트리스 / SDS V, 50 % V / 브이 글리세롤, 25 mM의 EDTA, 0.05 % 파란색 V의 브로 모 페놀 / w, 10 % V / V의 β-머 캅토 에탄올 (옵션) w 10 %를 혼합하여; RT에서 6.8 pH 및 저장을 조절; 사용하기 전에 50 ° C에서 따뜻한.
- 합류 100mm 배양 접시에서 세포를 균질화 (~ 8 × 106 세포 혈구를 이용하여 계산 HEK293, 경우) 2.2 절에 기술 된 바와 같이.
참고 : 자당은 (0.3M에서)는 삼투압 버퍼를 만드는 데 사용됩니다. 염, 예를 들면, 120-150 mM의 염화나트륨의 KCl 또는 관심 올리고머 단백질 복합체에 따라 대신에 사용될 수있다. - 단백질 집계를 펠렛과 뜨는을 저장 4 ° C에서 10 분 동안 20,000 XG에서 후 핵 이하 세포질 부분을 원심 분리기. 별도의 0.5 ml의 튜브에 (일반적으로 단백질 ~ 20 μg의) 20 μl를 각의 팔 분취 량을 가져 가라.
- 모든 샘플에 0.0025 % V / V의 글루 타르 알데히드를 추가하고 타이머를 시작합니다. 여덟 샘플 각각 glutarald 반응하자실온에서 ehyde : 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 분.
참고 : 글루 타르 알데히드 무료 아민과 반응이 알데히드 그룹을 보유하고 있습니다. 그들은 글루 타르 알데히드 반응을 해소하기 때문에 pH 완충제 또는 기본 아미노 그룹과 다른 물질을 사용하지 마십시오. - 2 % v / V를 히드라진과 지정된 시간에 글루 타르 알데히드 반응을 중지하고 단백질을 변성 5 배 단백질 로딩 버퍼의 5 μl를 추가합니다.
- SDS-PAGE 및 면역 (17)에 진행합니다.
- 다음 버퍼를 준비합니다
Representative Results
Y2H 시스템에서, 미끼 : 먹이 상호 작용은 초기에 부족한 배지에서 효모의 성장 선택 (트립토판, 류신 등) 히스티딘에 따라 시험 할 때, 그 후 β-갈 효소 활성 분석 (그림 1)에 의해 평가. 먹이 단백질 상호 작용 : 중간 부족 히스티딘에서 배양 효모는 미끼의 강도에 따라 느린 성장 속도를 가지고있다. β-갈 분석은 효모에서 수행된다 후자의 항복 정량 결과, 중 고체 지지체에 (판 한천) 또는 액체 문화에서 성장 (배지에서 배양는 트립토판과 류신이 부족). 우리는 성공적 RyR2 도메인 내의 도메인의 상호 작용뿐만 아니라 신규 단백질 파트너 2-4,12,21,22를 식별 Y2H을 사용했다. 예를 들어, 우리는 N 말단 단편과의 상호 작용에 대한 RyR2 펩티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 중첩 구조의 일련의 스크린 (AD4L : RyR2 잔기 1-906 GAL4 AD의 융합). (906) GAL4 융합 - AD4L 자체로, 즉 BT4L 1 (RyR2 잔류를 구성하는 상호 작용하는 것을 보여주는, AD4L 쌍 (그림 2A) : 3 식민지 리프트 필터 종이 β-갈 분석은 선명한 블루 컬러 만 BT4L에 대한 효모 식민지를 생산 DNA-BD). 효모 다른 구조와 공동으로이 변환 된 반면, AD4L 쌍의 극단적 인 C 말단 도메인 (BT8)와 보조 약한 연결을 제안 흰색과 미끼 따라서 부정적인 남아 : 창백한 푸른 식민지는 BT8 검출 된 먹이 단백질 상호 작용. 액체 β-갈 분석 (그림 2B)에 의해 얻어진 정량 결과, 강력한 BT4L 표시 :는 p53의 단백질 (pVA3)와 SV40 큰 T 항원 (pTD1) 사이의 알려진 협회 강도 AD4L 상호 작용 상당을 BT8 반면 : AD4L 상호 작용 상당히 약한 (<10 % 제어에 비해)했다.
우리는 정기적으로 공동 IP 실험 (그림 3) F를 수행독립적 인 생화학 적 분석 등의 포유 동물 세포 라인 (HEK293)에 일시적 발현을 따르게하는 것은 Y2H 결과 2-4,12-14,21-24을 강화합니다. RyR2 N 말단의 자기 상호 작용을 확인하기 RyR2 잔기 인코딩 두 개의 플라스미드 1-906가 어느 cMyc 또는 HA 펩티드 에피토프 (각각 BT4L 및 AD4L) 태그, 인산 칼슘 침전 법을 이용하여 HEK293 세포로 공동 형질 감염시켰다 3. 균질화 된 세포의 후 핵 분획 세제 CHAPS 가용화시키고, 불용성 물질은 세포 용 해물을 생성하기 위해 원심 분리에 의해 제거 하였다. 환원제 디티 오 트레이 톨로 처리 된 세포 용 해물은 다음 HA-태그 AD4L을 면역 침전 AB를 HA 단백질-A 세파 로즈 비드와 함께 배양 하였다. 버퍼 SDS가 함유 용출 공동 IP 샘플, Ab의 HA와 Ab의 cMyc, 연구와 면역 블에 의해 두 개의 별도의 SDS-PAGE 젤 (1/10 일 9/10 일 분할)에로드 분석 하였다espectively. Ab의 HA에 의해 AD4L의 성공적인 직접 IP (~ 100 kDa의)이 아닌 비 - 면역 토끼 IgG에 (도 4a)를 사용하여 음성 대조군으로, 면역에 의해 확인되었다. 중요한 cMyc 태깅 BT4L (~ 100 kDa의)이 아니라 면역 AD4L (도 4b)의 부재 네거티브 컨트롤 만 구간 HA IP 회수 하였다.
Y2H 공동 IP 분석법 RyR2 N 말단 자기 상호 작용 일관된 증거를 제공하지만, 그것은 단지 량체 이상의 복합체를 형성하는, 즉 여부 N- 말단 도메인의 올리고머 화 상태에 알리지 않았다. 이 복합체 해리 것을 주목해야만을 포함 소단위 단백질 - 단백질 상호 작용을 폐지 때문에 SDS-의 SDS-PAGE 및 열 유도 단백질 변성에 의해 검출 될 것이다. 이것을 극복하기 위해, 우리는 화학적으로 안정 기존 PROTEI을 conjoins 가교 (도 5)를 사용하여그 분자량 후 SDS-PAGE 크기 분리 2-5에 의해 검사 될 수 N 올리고머. 예를 들어, 환원제 디티 오 트레이 톨로 처리 cMyc-BT4L를 발현하는 HEK293 세포의 파쇄 액은 글루 타르 알데하이드 및 순이 cMyc (도 6)을 이용하여 SDS-PAGE 및 면역 블 롯팅 분석. RyR2 N 말단 테트라 형성 셋을 나타내는 단량체 (~ 100 kDa의) 시간 의존적으로 검출 하였다 ~ 400 kDa의 높은 분자량의 단백질 밴드 이외에. 특히, 테트라 최소한의 이량 체 관찰 삼량 밴드, 지배적 인 올리고머 종이었다. 15 % 구배 SDS-PAGE 겔 3 - 겉보기 분자 질량을 결정하기 위해, BT4L 올리고머 (4)를 통해 분리 하였다. 우리는 (30)의 범위와 단백질 표준을 사용하여 분자량 / 겔 위상차 표준 곡선 제작 - 460 kDa 이상을, 우리는 358 kDa의 15로 올리고머 계산 (N = 4). 이 겉보기 분자량이 배치 된 BT4L 량체와 일치기본 RyR2 채널 내에서 네 개의 서브 유닛의 배치에서 예상대로 오히려 선형 형태보다 폐쇄 순환 방식.
그림 1. Y2H 순서도. 효모, 공동 형질 전환 미끼 및 대상 플라스미드와 함께, 매체 부족한 히스티딘의 성장으로 선택 및 / 또는 β-갈 효소 활성에 대해 분석한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2는 Y2H RyR2 N 말단 도메인 자기 상호 작용을 의미한다. (A)에 대한 회로도 Y2H 시스템 시험 인간 RyR2 중첩 단백질의 단편 (미끼) 계열 묘사 RyR2 N 말단 AD4L (먹이) 구조와의 상호 작용. 식민지 리프트 필터 종이 β-갈 분석에 의해 얻어진 성적 결과는 "+"배수 또는으로 표시됩니다 "-"부정적인 상호 작용을 양성 대조군에 대해 정규화 (B) 양이 액체 β-갈 분석을 (pVA3은 GAL4 DNA-BD에 대한 인코딩합니다. p53의 단백질과 융합, pTD1)는 SV40 큰 T 항원과 GAL4의 AD 융합을위한 인코딩합니다. 3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 공동 IP 순서도. 포유 동물 세포의 공동 형질 플라스미드의 X 및 Y로는 균질 세제 - 가용화 SDS-PAGE 및 면역 하였다 공동 IP 분석에 사용 된 세포 용 해물을 생성한다.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 공동 IP는 포유 동물 세포에서 RyR2 N 말단 도메인 자체의 상호 작용을 나타냅니다. HEK293 세포 (BT4L) cMyc - 태그 및 HA가-태그 (AD4L) RyR2 N 말단 도메인의 과도 공동 식 (대한 공동 형질 감염시켰다 잔류 물 1-906). 음성 대조군으로서, 공동 IP 분석은 비 면역 된 토끼의 IgG로 수행 된 반면 AD4L는, CHAPS 및 디티 오 - 가용화 처리 HEK293 파쇄물 순이 HA로 면역 침전시켰다. 면역 침전 된 단백질을 5 분 동안 85 ° C로 가열 1/10 번째 또는 IP 시료 9/10 번째 로케이션 별도 6 % SDS-PAGE 젤을 통해 3 시간 동안 20mA에서 해결되었다. polyviny 상에 2 시간 동안 80 V에 따라 단백질 전송Ab의 HA (A) 또는 순이 cMyc 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 접합 된 항 - 마우스 IgG이어서 각각 (B), (1 : 10,000 희석) 및 향상된 화학 발광 검출 : lidene 디 플루오 라이드 멤브레인은 면역 블 분석 (1000 희석 1)를 사용하여 행했다 (1 분 노출). 세포 용 해물의 분취 량은 IP 샘플 처리 체적의 1/50 번째는 또한 분자량 표준을 제공하기 위해 포함되었다. 3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
X 플라스미드로 형질도 5 가교 순서도. 포유 동물 세포는 SDS-PA,이어서 균질화 및 가교 결합 분석에서의 글루 타르 알데히드와의 반응을 실시GE와 면역입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 크로스 링크는 RyR2 N 말단 도메인 테트라 머 형성을 나타냅니다 HEK293 세포 cMyc-태그 (BT4L) RyR2 N 말단 도메인의 일시적 발현 (잔류 물 1-906)에 대한 형질 감염시켰다.. 환원제 디티 오 트레이 톨로 처리 세포 파쇄는 표시된 시간 점을 글루 타르 알데히드와 함께 배양 하였다. 샘플을 5 분 동안 85 ℃에서 가열하고 3 시간 동안 20mA에서 SDS-PAGE (6 % 겔)에 의해 해결되었다. 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 접합 된 항 - 마우스 IgG (1,이어서 (1000 희석 1) 순이 cMyc을 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 막 상에 2 시간, 80 V에서 단백질 이동에 따라, 면역 블 분석을 이용하여 수행 하였다 :10,000 희석) 및 향상된 화학 발광 검출 (1 분 노출). 단량체 (M : ~ 100 kDa의) 및 테트라 (T) 형태가 화살표로 표시됩니다. 3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
단백질 호모 올리고머의 형성은 전사 인자, 효소, 이온 채널과 수용체 (25), (26)의 활성을 조절하는 중요한 생물학적 과정이다. 중요한 것은, 단백질 올리고머는 신경 퇴행 및 부정맥 심장 질환 4,27을 포함한 병리학 적 의미를 가지고있다. 이 문서에 설명 된 방법은 단백질 자체 협회 및 올리고머를 매개 도메인 - 도메인 상호 작용을 식별하는 데 사용됩니다. 다음, 우리는 각 프로토콜 내에서 중요한 단계를 가리, 우리는 중요한 고려 사항, 제한 사항 및 문제 해결에 대해 설명합니다.
Y2H 시스템은 잠재적 상호 작용 단백질로 인해 상대적으로 높은 처리량 스크리닝 파트너, 사용의 용이성 및 높은 재현성 결과 화면 먼저 채용 될 수있다. Y2H 절차는 표준 (판 또는 통) 인큐베이터 룸 봉쇄 설비와 미생물 실험실에서 수행된다. FR의 사용β-갈 분석에서 최상의 결과를 위해, 갓 (구 오일까지) 효모 식민지를 성장 (단계 1.2.3)를 사용한다 반면 eshly 준비 유능한 세포 (단계 1.1.8), 고효율 효모 변환을위한 중요합니다. GAL4 및 / 또는 추가 / 대체 리포터 유전자 이외의 다른 전사 인자를 기반으로 시스템을 사용할 수 있습니다, 따라서 미끼 먹이 플라스미드은 해당 Y2H의 변형과 일치해야합니다.
몇몇 균주가 HIS3 리포터 유전자 7,8 중 항시 발현을 해소하기 위하여, 3- 아미노 -1,2,4- 트리아 졸 상기 HIS3 단백질의 경쟁적 억제제의 존재 하에서 배양한다. 미끼 및 대상 융합 단백질의 발현은 17 면역 블에 의해 확인해야합니다. 케이스 미끼 / 먹이 융합 단백질이 효모에 독성이 낮은 허용 단백질 수준 미끼 / 먹이식이 다른 프로모터에 의해 구동되는 다른 벡터의 클로닝에 의해 달성 될 수있다. 또한, t를 위해 필수적모자 미끼 / 먹이 융합 단백질은 자율 리포터 유전자 활동을 표시하지 않습니다. 자율 리포터 유전자가 활성화, 또는 이들 단백질에 대한 테스트 GAL4 DNA-BD와 AD 융합체를 바꾸면 담당 영역을 제거하는 구조를 수정하여 구조 될 수있다. 그들은 세포 내 막 구획에서 미스 폴딩 또는 융합 단백질의 mislocalization을 유도 할 수 있기 때문에 또한, 횡단 도메인은 더 나은 미끼 / 먹이 구조에서 생략됩니다. 실제로, Y2H 시스템의 주요 단점은 미끼 및 대상 단백질-위양성 또는 위음성 상호 작용 6-9의 결과, 특정 번역 후 변형이 부족한 거리에 자신의 생리 세포 내 위치에서 잠재적으로 효모 핵에 지역화 된 것입니다 .
이종 포유 동물 발현 시스템은 형태, 번역 후 변형 및 세포 내 편재 용어 포유 동물 세포막 단백질의 연구에 더 적합하다.가장 널리 사용되는 세포의 형질 전환 방법 중 하나는 주로 때문에 최소의 장비, 인산 칼슘 침전하고 시약은 11, 15을 요구했다. 다른 방법, 즉, 전기 천공, 리포좀과 양이온 성 지질 중합체는, 세포주에 따라 높은 형질 전환 효율이 수득되며 사용한 구성 할 수있다. 일반적으로, 형질 감염 효율에 영향을 미치는 주요 요인은 플라스미드 DNA의 품질과 셀 건강 / 생존이다. 높은 순도 (260 나노 미터의 / 280 ㎚ 흡광도 비가 1.8)과 적극적으로 분열하는 세포의 플라스미드 DNA를 사용할 때 최상의 결과가 달성된다. 외래 DNA를 수행하는 능력은 매체 (11)에 노출 된 세포의 표면 영역과 관련되어 있기 때문에, 70 % 합류 (단계 2.1.2) - 세포 따라서 더 60보다 형질한다. 또한, 형질 전환 (단계 2.1.3) 동안 배지에서 항생제의 포함은 증가 세포 사멸 (15)로 인해 권장되지 않습니다.
에프인산 칼슘 배속 HBS 용액 (단계 2.1.1)의 특별한주의 제조하고 (정확하게 7.05) pH 조정 석출 및 플라스미드 DNA / 칼슘 / 격렬하게 혼합한다 (단계 2.1.5)에 의하여 인산 착물을 적절히 형성하거나 고효율 형질 전환을위한 중요한 단계. 일반적으로, 24 내에서 일시적인 형질 피크에 의해 단백질 발현 - 72 시간.
세포가 수확되면, 이후의 절차는 단백질 분해 효소 활동을 최소화하기 위해 4 ° C에서 수행되어야하며, 프로테아제 억제제를 첨가하는 것이 좋습니다. 세포 균질화는 염색체 DNA 용액의 점도를 증가시키고, 비특이적 결합을 향상시킬 수 있기 때문에 핵을 제거하기 위해 원심 분리 단계에 이어한다. 따라서, 삼투압 버퍼의 기계적 수단에 의한 균질화는 보통 (0.3 M) 또는 수크로오스 (150 mM)을 염화나트륨으로 바람직하다. 일반적으로, 수 크로즈 계 버퍼 단백질 안정성을 향상시키고 잠재적 비원 단백질 응집을 감소시키기 위해 알려져 있지만, P에 의한단백질 표면에 조 수화 정전 단백질 - 단백질 상호 작용을 선호한다. 반대로 염계 버퍼 따라서 소수성 상호 작용을 기반 (28)을 향해 바이어스를 갖는 단백질의 표면 상에 대전 된 아미노산 사이드 그룹의 순 전하에 영향을 미친다.
공동 IP 특히 천연 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 평가하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 생화학 분석이다. 주요 단점은 IP에서 사용 10,16,18를 면역 블에 대한 검증 매우 특이 항체에 대한 요구 사항입니다. 따라서, 재조합 단백질은 종종 펩티드 에피토프와 태그, 예., 인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (YPYDVPDYA) 또는 인간 cMyc (EQKLISEEDL)를하는 높은 친화도 특이 항체가 시판되고있다. 원한다면, 항체 immunoprecipitating 화학적 공침 PR 가릴 수있는 면역 단계에서의 용출 및 검출을 방지하기 위해 단백질-A 수지 상에 접합 될 수있다otein (16); 이를 위해, 우리는 성공적 화학적 가교제 3,3'- 디티 오비스 (sulfosuccinimidylpropionate) (24)를 사용했다. 이는 적절한 세제는 IP 버퍼에 포함 균질화 세포의 불용성 물질은 비 - 특이 적 결합 (단계 3.1.3)를 최소화하기 위해 원심 분리에 의해 제거되는 것이 필수적이다. 실질적으로 결합 비특이적을 줄일 강한 세제 및 / 또는 높은 농도뿐만 아니라 X 폐지 할 수있다 : 선택과 세제의 농도는 중요한 고려 사항이다 약한 상호 작용이 관찰 될 수있다 Y 단백질 상호 작용, 낮은 농도 또는 온화한 세제 반면를 수 있지만, 과도한 비특이적 결합을 초래한다. . 1 % 농도 - 중간 강도 세제는 예를 들면, 트리톤 X-100 0.5이 바람직하다. 또한, 비 - 특이 적 결합 중성 단백질을 줄이기 위해 (예를 들어, 100 μg의 / ㎖의 소 혈청 알부민)은 IP 버퍼를 포함 할 수 있고, 및 / 또는 세포 용 해물은-cleare 미리 수혼자 단백질-A 수지와 사전 배양과 라. 세척의 수는 X에 최적화되어야한다 Y 쌍 테스트, IP 버퍼 (단계 3.1.9)와 일반적으로 3 10 분 세척을. 임의의 경우에, immunoprecipitating 항체 비 - 면역 IgG를 가진 공동 IP 샘플은 항상 음성 대조군 (단계 3.1.6)를 게재 병렬로 처리한다.
화학적 가교의 주된 이점은 단백질 호모 올리고머의 화학 양론 조성에 통지한다는 것이다. 그것은 어떤 특수한 장비를 필요로하지 않으며이 상호 작용 단백질 19, 20 사이의 열적 및 화학적으로 안정하고 가교를 생성하기 때문에 글루 타르 알데히드는 일반적으로 사용되는 가교제이다. 들이 화학 반응을 종결하기 때문에 유리 아미노 그룹을 갖는 화합물을 분석 완충액 (단계 3.2.1)에서 생략되어야한다. 글루 타르 알데히드 농도 및 반응 시간 (단계 3.2.4)가 관심 올리고머 단백질 복합체에 대해 최적화되어야한다. 이 기술, especi의 주요 단점전체 세포 제제에서 수행 아군 때 생물학적 중요성 부족 인공 단백질 응집체를 생성 할 수있는 화학 반응의 비 특이성이다.
생체 내에서 대체 (예., 형광 공명 에너지 전달, 이중 분자 형광 또는 발광 보완) 및 시험 관내 기법 (예., 크기 배제 크로마토 그래피, 분석 초 원심 분리, 등온 적정 열량)은 단백질 자체 협회 평가 특성화 사용할 올리고머 화학 양론 29, 30의. 각 방법은 그 자체의 장점 및 단점을 가지며, 이는 단백질 정제 / 안정성 장비 / 시약의 가용성에 따라, 특정 단백질의 연구에 더 적합 할 수있다. 세부 사항, 즉 Y2H 공동 IP 및 가교 여기에 기술 된 세 개의 상보 적 방법은, RyR2 호모 oligome 대한 강력한 증거를 제공하기 위해 조합하여 사용되어왔다격리 및 살아있는 세포 내에서 R 형성.
Disclosures
저자는 선언 아무 상관이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 SZ (FS / 08 / 063과 FS가 / 15 / 3만1천4백94분의 30)에 영국 심장 재단 연구비에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PART 1 yeast two-hybrid | |||
| Plate incubator | Hereaus | B6120 | Used at 30 °C |
| Orbital shaker incubator | New Brunswick Scientific | INNOVA 4300 | Used at 30 °C with shaking at 230 - 250 rpm |
| Spectrophotometer | Perkin Elmer | Lambda Bio+ | To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay |
| Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit | Takara Clontech | K1604-1 | Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2 and yeast strain Y190 |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y0626 | To prepare minimal SD growh medium |
| Dropout supplement lacking leucine and tryptophan | Sigma-Aldrich | Y0750 | To prepare minimal SD growh medium |
| Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine | Sigma-Aldrich | Y2001 | To prepare minimal SD growh medium |
| Herring testes carrier DNA | Takara Clontech | 630440 | For yeast transformation |
| Whatman filter paper Grade 5 | Sigma-Aldrich | WHA1005070 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
| X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | B4252 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
| ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | N1127 | for use in liquid b-Gal assay |
| PART 2. Protein expression in a mammalian cell line | |||
| HEK293 cell line | ATCC | ATCC® CRL-1573™ | |
| Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) | SANYO | MCO-18AIC | To culture mammalian cells |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) | Invitrogen (ThermoFisher) | 41966 | To prepare growth medium for mammalian cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen (ThermoFisher) | 10500 | To prepare growth medium for mammalian cells |
| Glass beads | Sigma-Aldrich | G8772 | To homogenise cells |
| Needle 23 G (0.6 x 30 mm) | BD Microlance | 300700 | To homogenise cells |
| Protease inhibitor cocktail (Complete) | Roche | 11873508001 | To prevent proteolysis |
| PART 3. In vitro biochemical methods | |||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) | Bio-Rad | 1658000EDU | For polyacrylamide gel electrophoresis |
| Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) | Bio-Rad | 1703940 | For electrophoretic transfer |
| Compact X-ray film processor | Xograph | X4 | For use in immunoblotting |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | For use in chemical cross-linking |
| Protein-A sepharose beads | GE Healthcare Life Sciences | 17-5280-01 | For use in co-IP assay |
| Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-805 | For use in co-IP assay |
| Non-immune rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | For use in co-IP assay |
| Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | For use in immunoblotting |
| Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) | Covance | MMS-101P | For use in immunoblotting |
| Anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | For use in immunoblotting |
| Hyperfilm ECL | GE Healthcare Life Sciences | 28906836 | For use in immunoblotting |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce (ThermoFisher) | 32106 | For use in immunoblotting |
References
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