Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rest-specifikke Inkorporering af Noncanonical Aminosyrer i Model Proteiner Brug en Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54273
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Experimental Physics, Saarland University, 2Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3School of Physics and Astronomy, University of Minnesota

Abstract

Den kanoniske sæt af aminosyrer fører til en usædvanlig bred vifte af protein funktionalitet. Ikke desto mindre sæt af rester stadig indebærer begrænsninger af potentielle protein-applikationer. Indarbejdelsen af ​​noncanonical aminosyrer kan forstørre dette anvendelsesområde. Der er to komplementære tilgange til inkorporering af noncanonical aminosyrer. For stedsspecifik inkorporering, i tillæg til de endogene kanoniske translationelle machineries, en ortogonal aminoacyl-tRNA-syntetase-tRNA par skal gives, der ikke interagerer med de kanoniske dem. Derfor er en codon, der ikke er tildelt en kanonisk aminosyre, sædvanligvis en stopkodon, er også påkrævet. Denne genetiske kode ekspansion muliggør inkorporering af et noncanonical aminosyre i et enkelt, givet sted i proteinet. Den her præsenterede arbejde beskriver rest-specifikke inkorporering, hvor den genetiske kode er omfordelt inden for det endogene translationel system. Oversættelsen maskiner enccepts den noncanonical aminosyre som et surrogat til at optage det på canonically foreskrevne steder, dvs. at alle forekomster af en kanonisk aminosyre i proteinet erstattes med noncanonical én. Indarbejdelsen af ​​noncanonical aminosyrer kan ændre proteinstruktur, der forårsager betydeligt modificerede fysiske og kemiske egenskaber. Noncanonical aminosyreanaloger fungerer ofte som cellevækstinhibitorer for ekspressionsværter da de ændrer endogene proteiner, begrænser in vivo proteinproduktion. In vivo inkorporering af toksiske noncanonical aminosyrer i proteiner stadig særdeles udfordrende. Her er en cellefri tilgang til en fuldstændig udskiftning af L-arginin ved noncanonical aminosyren L-canavanine fremlagt. Det omgår de iboende vanskeligheder i vivo-ekspression. Derudover er en protokol til at forberede målproteiner for masse spektralanalyse inkluderet. Det er vist, at L-lysin kan erstattes af L-hydroxy-lysin,dog med lavere effektivitet. I princippet kan enhver noncanonical aminosyreanalog skal iblandes efter præsenterede metode, så længe det endogene in vitro translationssystem genkender det.

Introduction

Den genetiske kode er universel til biosfæren. Den koder for et sæt af 20 kanoniske aminosyrer, som undertiden forlænget ved selenocystein 1 eller pyrrolysin 2. Det er ribosomet der oversætter den genetiske kode ved hjælp af tRNA'er i kæder af aminosyrer, der folder i proteiner. De funktionelle grupper af de kanoniske aminosyrer, i kombination med posttranslationelle modifikationer, bidrage til en usædvanlig bred vifte af proteinfunktion 3,4. I princippet kan funktionelle begrænsninger på grund af det begrænsede sæt af kanoniske aminosyrer overvindes ved inkorporering yderligere, noncanonical aminosyrer (ncAAs), der muliggør nye kemiske og nye funktionaliteter 3,4.

Der er to komplementære tilgange til indarbejdelse af ncAAs: det websted-eller resten-specifikke inkorporering. Den tidligere metode indebærer betydelige tekniske vanskeligheder, da det kanoniske sæt af aminoacyl-tRNA-synthetases (Aars) og tRNA'er skal udvides med en ortogonal Aars-tRNA par, der ikke må interagere med den endogene oversættelse maskiner. Baseret på omhyggelig teknik, denne tilgang inkorporerer ncAAs som enkelte punktmutationer på det ønskede protein sites. Stedspecifik inkorporering af ncAAs er genetisk kodet af et codon, der ikke er tildelt en kanonisk aminosyre (CAA), sædvanligvis en stopkodon 5-9. Denne metode indebærer ændringer i funktion på et givet sted i stedet på tværs af hele protein 10-13.

I modsætning hertil rest-specifikke inkorporering afhængig fejlagtige anerkendelse af den noncanonical aminosyre af den kanoniske oversættelse maskiner. Inkorporeringen opstår på grund af manglende substratspecificitet af Aars. Resten-specifikke inkorporering af ncAAs, bygget på arbejdet i Cohen og kolleger 14, har ført til vigtige applikationer 3,10, blandt dem bio-retvinklede mærkning 15-17 af proteinereller struktur belysning af proteiner i røntgenkrystallografi 18.

Som naturlige Aars generelt foretrækker deres beslægtede aminosyre over et isostrukturelt NCAA, effektiv in vivo rest-specifikke inkorporering normalt kræver en auxotrof udtryk værten ikke er i stand til at syntetisere den kanoniske analog af NCAA. Værtscellerne dyrkes i vækstmedium, der leverer kun en lav koncentration af den analoge CAA. Dens udmattelse i kombination med den fortløbende tilskud med NCAA tvinger udtrykket vært at indarbejde NCAA i modellen protein på flere, canonically ordineret sites. I modsætning til den site-specifikke tilgang, er der normalt har en dyb indvirkning på hele proteinstruktur, hvilket fører til betydeligt ændrede fysiske og kemiske egenskaber af proteiner 19,20. Men de fleste af ncAAs er vækstinhibitorer for ekspressionsværten 3, da de er inkorporeret i mange andre proteins foruden dem af interesse under rekombinant genekspression. Dette begrænser klart in vivo fremgangsmåde. In vivo inkorporering af aminosyrer, der er toksiske eller har stor indflydelse på proteinet struktur forbliver særligt udfordrende. Men disse molekyler er blandt de mest lovende, at ingeniør proteiner med ekstraordinære funktioner.

Et eksempel er giftigt, noncanonical, naturligt forekommende L-canavanine (Can), en analog af L-arginin (Arg). Det påvirker og blokke Arg tilknyttede regulatoriske og katalytiske reaktionsveje, og dens tilstedeværelse i den levende celle kan føre til øjeblikkelig død 3,21-23. Dens inkorporering i proteiner ved arginin positioner kan reducere protein stabilitet 21-23. På grund af den resulterende toksicitet, ekspression af canavanin holdige proteiner i Escherichia coli (E. coli) og andre fælles ekspressionsværter fortsat en udfordring. Af disse grunde komplet in vivo incorporation af Can på alle Arg positioner er hensigtsmæssigt blevet bekræftet kun én gang 24, ved hjælp af en uddybet single-protein produktionssystem. Imidlertid kan er blevet foreslået som et anti-cancer middel 25-27, og som en stimulator for autoimmune sygdomme hos mennesker 28. Desuden er det genstand for forskellige undersøgelser af sin anti-metaboliske, antibakterielle, svampedræbende og antivirale egenskaber 25. Disse egenskaber hæve et krav til effektiv og nem at udføre metoder til at udtrykke Kan holdige proteiner for farmaceutiske, medicinske og funktionelle undersøgelser.

Selv om mange problemer, der er forbundet til in vivo-fremstilling kan omgås ved anvendelse af cellefrie ekspressionssystemer, in vitro restkoncentrationer tilgange er kun dårligt undersøgt. Det cellefrie rest-specifikke inkorporering af en L-tryptophan analog 29 og multipel ncAAs 30, er blevet rapporteret. Disse metoder er baseret på den yderst effekient T7 RNA-polymerase. T7 RNA-polymerase indebærer bakteriofag-lignende transkription, og derved reducere genetisk funktionalitet i forhold til endogen transkription.

Den komplette rest-specifikke inkorporering af Can til en model protein på alle Arg positioner blev for nylig rapporteret 31, ved anvendelse af et cellefrit ekspressionssystem 32. En mindre ændring af det samme system aktiveret stedsspecifik inkorporering af forskellige pyrrolysin analoger til en model protein via stop-codon undertrykkelse 33. Den anvendte cellefrit system 31. - 33 er baseret på en alt E. coli transkription-translationssystem. Ikke desto mindre muliggør proteinekspression så effektivt som i de nuværende bakteriofag systemer (0,5 - 1 mg / ml rekombinant protein) 32, og samtidig bevare meget af det oprindelige transkription-translation modularitet.

I dette arbejde, er en detaljeret protokol tilvejebragt på hvordan residue-specifikke inkorporering af ncAAs kan realiseres, ved hjælp af denne alt E. coli cellefrit system 32. Derudover foreslås yderligere skridt for at forberede de udtrykte proteiner til passende evaluering via HPLC-ESI massespektroskopi. At udvide egenskaberne for denne celle-fri-system, er dette arbejde ikke kun henvise til den offentliggjorte inkorporering af Can 31, men præsenterer også nye data relateret til noncanonical L-lysin analog L-hydroxy-lysin.

Følgende protokol for resten-specifikke inkorporering af ncAAs er en tilpasning af en protokol for nylig offentliggjort i JOVE 34. Sidstnævnte protokol beskriver, hvordan man udfører højeffektive celle-ytringsfrihed med standard aminosyrer. Endvidere viser fremstillingen af ​​det rå cellefrie ekstrakt, aminosyreopløsningen, energien stamopløsningen og energien puffer anvendes i denne fremgangsmåde. Følgende protokol fokuserer på modificerede trin i forhold til den foregående protokol således at resten-specifikke inkorporering af ncAAs. Kalibrerede pipetter, lav-bindende pipettespidser og mikro-centrifugerør anbefales til præparatet. I det følgende er IUPAC forkortelser for aminosyrerne anvendt.

Protocol

Forsigtig! Se venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Flere af de anvendte kemikalier er akut giftige. Personlige værnemidler er påkrævet (Eyeshield, støvmaske, handsker, kittel, fuld længde bukser, lukket-tå sko) samt arbejder i et stinkskab.

1. aminosyreopløsning Fremstilling

  1. Stock løsning forberedelse af NCAA (168 mM)
    BEMÆRK: Stamopløsningen fremstilling af NCAA er beskrevet for Arg-analog som et eksempel. Derfor tilpasser værdierne for andre ncAAs.
    1. Placer en 1,5 ml reagensglas på en mikrovægt. Afvej 46,1 mg Can inde i reaktionsrøret til fremstilling af 1 ml af en 168 mM opløsning. Brug en steril microspatel. For en racemisk blanding af NCAA, fordoble koncentrationen af ​​stamopløsningen.
    2. Tilføj 977 ul sterilt Hedeselskabet 2 O. Grundigt vortex indtil Can er in fuldstændig opløsning.
      BEMÆRK: For en totalløsning volumen på 1 ml, der skal kompenseres den fysiske volumen af ​​den opløste aminosyre. For enhver af aminosyrerne, estimat halvdelen af den faste masse i mg som den tilsvarende stigning volumen i pi (100 mg fast stof vil tage et volumen på 50 pi i opløsningen) 35. De fleste aminosyrer kan opløses ved denne koncentration. Hvis ikke, reducere koncentrationen indtil fuldstændig opløsning.
    3. Direkte bruge NCAA stamopløsningen for udarbejdelsen af aminosyre-løsninger i afsnit 1.2 eller flash fryse det i flydende nitrogen og opbevar det ved -20 ° C. ADVARSEL! Af sikkerhedshensyn bære en Eyeshield og Cryo-handsker til at være beskyttet mod væske kvælstof stænk.
  2. Fremstilling af aminosyreopløsninger
    BEMÆRK: Til fremstilling af aminosyreopløsninger bruge aminosyren sampler giver L-isomerer af de 20 CAAS i separat lageropløsninger (1,5 ml, bufret med HEPES / KOH, <0,1% NaN3, pH 7,5), hver i en koncentration på 168 mM, med undtagelse af L-leucin (140 mM). For en hjemmelavet forberedelse af disse stamopløsninger (buffer med KOH), skal du følge denne protokol 35.
    1. Optø stamopløsninger af de 20 CAAS (aminosyre sampler eller fremstillet i overensstemmelse med 35) og af NCAA (udarbejdet i afsnit 1.1) ved stuetemperatur.
    2. Efter optøning ofte vortex stamopløsningerne at genopløse eventuelle udfældede aminosyrer. Som nogle aminosyrer er sværere at opløse, inkubere dem i en varmeblok ved 37 ° C indtil fuldstændig opløsning. Cys kan ikke opløses fuldstændigt. Anbring alle aminosyrer på is, bortset Asn, Phe og Cys - holde disse ved stuetemperatur for at undgå udfældning.
    3. Brug følgende værdier til at bruge en syvendedel af det komplette sæt.
      BEMÆRK: Scale ned hensigtsmæssigt at arbejde med mindre volumener og at gemme dele af kittet til yderligere forsøg. Opskalering til indeholdendion af ncAAs i modelproteiner i stor skala. For at forhindre hyppige optøning, hvilket sandsynligvis vil reducere stabiliteten af ​​aminosyrer, udportionerer de enkelte aminosyre stamopløsninger i mængder af 200 ul. Dette 200 pi alikvot mængde og alikvote mængder, der anvendes i trin 1.2.4.1 konto for tab som følge af pipettering.
    4. Først forberede en aminosyre hovedblandingskammeret løsning, der vil blive delt i trin 1.2.4.3 at færdiggøre fremstillingen af ​​3 forskelligt sammensat aminosyreopløsninger (afsnit 1.2.5 - 1.2.7). I disse løsninger, koncentrere alle aminosyrer ved 6 mM, bortset Leu (5 mM).
      1. Overførsel 1,4 ml sterilt Hedeselskabet 2 O i et 15 ml centrifugerør. Sæt det på is. Tilføj 175 pi af hver aminosyre stamopløsning. Tilføj ene efter den anden, med undtagelse af stamopløsningen af CAA (f.eks Arg) skal erstattes af NCAA (f.eks Can). Grundigt vortexes efter hver tilsætning og sætte opløsningen tilbage på is.
        NOTE:Leu er på 5 mM i de 3 andet organ aminosyreopløsninger, sammenlignet med 6 mM for de andre aminosyrer. Den reducerede koncentration reducerer ikke udtrykket effektivitet. Opskalering til 6 mM er egnede.
      2. Overfør aminosyre stamopløsninger i følgende rækkefølge for at undgå udfældning: Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, leu, og Cys. Husk at ikke tilføje stamopløsningen af CAA (f.eks Arg), der er analog til NCAA (f.eks Can). Endelig grundigt vortex. Der inkuberes ved 37 ° C for at gøre opløsningen så klar som muligt.
      3. Split denne aminosyre hovedblandingskammeret opløsning i tre lige store volumener af 1,35 ml. Overfør hver af split mængder i 1,5 ml reaktionsrør. Hold dem på is.
    5. Forbered en aminosyreopløsning, som består af alle 20 CAAS ved en koncentration på 6 mM hver, bortset Leu, der er 5 mM. Til den første volumen of 1,35 ml, som følge af den opdelte i trin 1.2.4.3, tilsættes 50 pi af 168 mM stamopløsning af CAA (f.eks Arg), som er analog med NCAA (f.eks Can). Grundigt vortex.
      1. Sæt tilbage på is. Alikvot dette 1,4 ml opløsning i mængder af 16 pi i reaktionsrør. Bemærk, at denne løsning volumen ca. fører til 85 portioner. Mærk disse portioner "+ CAA" (f.eks + Arg).
      2. Flash fryse portioner i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. ADVARSEL! Af sikkerhedshensyn bære en Eyeshield og Cryo-handsker skal beskyttes mod flydende nitrogen stænk.
    6. Forbered en aminosyreopløsning, som består af 19 CAAS bortset CAA (f.eks Arg), som er analog med NCAA (f.eks Can). Tilføje hver aminosyre til en koncentration på 6 mM, bortset Leu (5 mM).
      1. Der tilsættes 50 pi sterilt Hedeselskabet 2 O til det andet volumen på 1,35 ml, som følge af den opdeltei trin 1.2.4.3. Grundigt vortexes og sat tilbage på is. Alikvot dette 1,4 ml opløsning i mængder af 16 pi i reaktionsrør. Bemærk, at denne løsning volumen ca. fører til 85 portioner. Mærk disse portioner "- CAA" (f.eks, - Arg).
      2. Flash fryse portioner i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. ADVARSEL! Af sikkerhedshensyn bære en Eyeshield og Cryo-handsker til at være beskyttet mod kvælstof stænk.
    7. Forbered en aminosyre blanding, der indeholder 19 CAAS og NCAA (f.eks Can), der erstatter den kanoniske ene (fx Arg). Tilføje hver aminosyre til en koncentration på 6 mM, bortset Leu (5 mM). Til den sidste 1,35 ml volumen, som et resultat af opdelingen i trin 1.2.4.3, tilsættes 50 pi af 168 mM stamopløsning af NCAA (f.eks Can). Mærke det "+ NCAA" (f.eks + Can). Grundigt vortexes og sat tilbage på is.
      1. Alikvot dette 1,4 ml opløsning i mængder af 16 & #181; l i reaktionsrør. Bemærk, at denne løsning volumen ca. fører til 85 portioner. Mærk disse portioner "+ NCAA" (f.eks, + Can).
      2. Flash fryse portioner i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. ADVARSEL! Af sikkerhedshensyn bære en Eyeshield og Cryo-handsker til at være beskyttet mod kvælstof stænk.
        BEMÆRK: De 16 pi alikvote mængder, der anvendes i trin 1.2.5.1, 1.2.6.1 og 1.2.7.1 er lidt højere end nødvendigt for at tage højde for tab som følge af pipettering.

2. Energi Buffer Fremstilling

BEMÆRK: Hvert parti af rå ekstrakt er unik og kræver optimerede koncentrationer af Mg- og K-glutamat 34. Den rå ekstrakt aliquot volumen afhænger af proteinkoncentrationen 34. Brug den medfølgende beregning skabelon (Supplemental Material 1) for forskellige værdier. Find yderligere instruktioner i supplerende materiale en figur legende, af forklaringenlingen hvordan at ansætte denne skabelon.

  1. Forberede og opbevares ved -80 ° C 14x energiløsning og rå ekstrakt portioner ifølge den umodificerede protokol 34. Kalibrere rå ekstrakt afhængig af Mg- og K-glutamat koncentrationer for optimeret ekspression effektivitet 34.
    BEMÆRK: Den endelige sammensætning af 14x energi løsning er: 700 mM HEPES (pH 8), 21 mM ATP, 21 mM GTP, 12,6 mM CTP, 12,6 mM UTP, 2,8 mg / ml tRNA, 3,64 mM CoA, 4,62 mM NAD, 10,5 mM cAMP, 0,95 mM folinsyre, 14 mM spermidin, 420 mM 3-PGA.
  2. Tø på is i 100 mM Mg-glutamat stamopløsning, 3 M K-glutamat stamopløsning, 14x energi opløsning og 40% PEG-8000 til fremstilling master mix. Hold dem på is.
  3. Bland 9.18 pi 100 mM Mg-glutamat stamopløsning, 3,06 pi 3 M K-glutamat stamopløsning, 21.86 pi 14x energi opløsning, 15,3 pi 40% PEG-8000 og 1,6 pi sterile Hedeselskabet 2 O i et reaktionsrør. Grundigt vortexes denne mastis mix efter hver tilsætning, og holde det på is.
  4. Alikvot master mix (51 pi) i volumener 16 pi (3 portioner) i reaktionsrør. Ofte vortexes master mix under udportionering. Flash fryse portioner i flydende nitrogen.
    BEMÆRK: 16 pi rumfanget samt master mix volumen er lidt højere end nødvendigt for at tage højde for tab som følge af pipettering.
  5. Brug en si for at indsamle energi buffer rør. Opbevar rørene ved -80 ° C. ADVARSEL! Brug en Eyeshield og Cryo-handsker til at være beskyttet mod kvælstof stænk.

3. Forberedelse og Udførelse af Cell-fri Reaktioner til Rest-specifikke Inkorporering af ncAAs

  1. Først forberede DNA vektor løsning i Hedeselskabet 2 O.
    1. For meget effektiv proteinekspression, bruge ekspressionsvektoren pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 32. Klone genet, der koder for modellen proteinet i denne vektor 36,37 </ Sup>.
      BEMÆRK: Du kan også bruge andre promotorer, der er anerkendt af σ 70 så godt, men bemærk, at udtrykket effektivitet kan reduceres.
    2. Transform 37,38 vektoren i E. coli-stamme KL 740 32 (Yale CGC #: 4382), oprense amplificeret vektor-DNA 37,39 og kvantificere koncentrationen af DNA-opløsningen 40-42. DNA-opløsningen ved -20 ° C Opbevar eller direkte bruge det til celle-fee reaktion forberedelse (trin 3.4.1, 3.4.2 og 3.4.3).
  2. Kalibrere cellefrie ekspression effektivitet, afhængig af den anvendte vektorkonstruktion koncentrationen i henhold til den umodificerede protokol 34. Brug den optimale koncentration, der fører til højeste proteinudbytter for cellefri reaktion forberedelse (trin 3.4.1, 3.4.2 og 3.4.3).
    BEMÆRK: Fremstillingen af ​​cellefrie reaktioner er eksemplificeret ved anvendelse af en 90 nM vektor-DNA-stamopløsning, der fører til en endelig vektor koncentration på 10 nM i det cellefriereaktion og følger de ovennævnte optimale værdier af Mg- og K-glutamat samt ekstraktet rumfanget. Brug beregningen skabelon til forskellige værdier.
  3. Tø på is 3 råekstrakt portioner hver 30 pi volumen (fremstillet ifølge umodificeret protokol 34), 1 aminosyreopløsning aliquot mærket "+ CAA" (f.eks + Arg), 1 aminosyreopløsning aliquot mærket "- CAA" (f.eks - Arg) og 1 aminosyre løsning portion mærket "+ NCAA" (f.eks, + Kan) (fremstillet i afsnit 1.2.5 - 1.2.7), 3 energi buffere portioner (udarbejdet i afsnit 2) og vektor-DNA løsning ( udarbejdet i afsnit 3.1).
    BEMÆRK: Den rå ekstrakt er lettere viskøs, og den kan indeholde luftbobler. Fjerne luftbobler ved centrifugering ved 10.000 x g i 30 sekunder ved 4 ° C. Sætte rå ekstrakt portioner tilbage på is.
  4. Forbered 3 forskelligt sammensatte cellefrie reaktioner (hver 90 pi slutvolumen) ved blanding af rå ekstrakt (33,33%), energipuffer (16,67%), 1 af de 3 forskelligt sammensat aminosyreopløsning portioner (16,67%) og vektor-DNA-opløsning. Eventuelt tilføje flere biomolekyler (DNA, proteiner, tRNA, etc.), men passende reducere omfanget af Hedeselskabet 2 O.
    1. Forbered referencen cellefri reaktion (90 pi), der udtrykker det umodificerede model protein.
      1. Tilsæt 15 pi energi puffer, 15 pi aminosyreopløsningen aliquot mærket "+ CAA" (f.eks + Arg), 10 pi 90 nM vektor-DNA-opløsning og 20 pi sterilt Hedeselskabet 2 O til 30 pi af rå ekstrakt. Bland ved pipettering op og ned og forsigtigt vortex efter tilsætning af hver bestanddel.
      2. Alikvot de 90 pi cellefri reaktion i 15 lige store volumener 6 pi. Overfør hver af de 15 volumener i en separat reagensglas. Luk rørene og sætte dem tilbage på is. Label alle reaktionsrørene som "CFR (+ CAA)" (f.eks, CFR (+ Arg)).
      2. (f.eks Arg) eller noncanonical analog (f.eks Can) tilsættes.
      1. Tilsæt 15 pi energi puffer, 15 pi aminosyreopløsningen aliquot mærket "- CAA" (f.eks, - Arg), 10 pi 90 nM vektor-DNA-opløsning og 20 pi sterilt Hedeselskabet 2 O til 30 pi rå ekstrakt. Bland ved pipettering op og ned og forsigtigt vortex efter tilsætning af hver bestanddel.
      2. Alikvot de 90 pi cellefri reaktion i 15 lige store volumener 6 pi. Overfør hver af de 15 volumener i en separat reagensglas. Luk rørene og sætte dem tilbage på is. Label alle reaktionsrørene som "CFR (-cAA)" (f.eks, CFR (Arg)).
    2. Forbered celle-fri reaktion (90 ul), der formodes at rest-specifikt indarbejde NCAA (f.eks Can) i udtrykte model protein.
      1. Tilsæt 15pi af energi puffer, 15 pi aminosyreopløsningen aliquot mærket "+ NCAA" (f.eks + Can), 10 pi 90 nM DNA-opløsning og 20 pi sterilt Hedeselskabet 2 O til 30 pi rå ekstrakt. Bland ved pipettering op og ned og forsigtigt vortex efter tilsætning af hver bestanddel.
        BEMÆRK: Udtrykket effektivitet kan reduceres i sammenligning med ekspressionen med standard aminosyrer. Hvis det er nødvendigt, blot opskalere cellefri reaktionsvolumen.
      2. Alikvot de 90 pi cellefri reaktion i 15 lige store volumener 6 pi. Overfør hver af de 15 volumener i en separat reagensglas. Luk rørene og sætte dem tilbage på is. For øget reaktionsrumfang derfor prøve, yderligere mængder af 6 pi. Label alle reaktionsrørene som "CFR (+ NCAA)" (f.eks, CFR (+ Can)).
  5. Inkuber alle rør ved 29 ° CO / N.
    BEMÆRK: Kun små reaktionsrumfang muliggøre tilstrækkelige ilt diffusion i reaktion, der er afgørende for højeffektive proteinekspression. Reaction mængder på over 10 pi kræver aktiv iltning gennem agitation 34. For store mængder, opdelt reaktionen i mængder mindre end 15 pi.
  6. Efter celle-frie udtryk, poolen hele identisk komponeret split cellefrie reaktioner af 6 pi. Først, pool alle 15 split cellefrie reaktioner af 6 pi mærket "CFR (+ CAA)" (f.eks, CFR (+ Arg)). Derefter pool alle 15 split cellefrie reaktioner af 6 pi mærket "CFR (-cAA)" (f.eks, CFR (Arg)). Endelig pool alle 15 split cellefrie reaktioner af 6 pi mærket "CFR (+ NCAA)" (f.eks, CFR (+ Can)). For øget reaktionsrumfang derfor samle yderligere mængder af 6 pi.
  7. Check ekspressionsniveauet af modellen protein i alle tre samlet, forskelligt sammensat cellefrie reaktioner ved udførelse denaturerende SDS-PAGE 43,44 (afsnit 4.1).
    BEMÆRK: Brug denne metho d for en foreløbig evaluering af inkorporeringen eksperimentet.
  8. Forbered cellefrie udtrykte model proteiner til en passende analyse via HPLC-ESI massespektroskopi (afsnit 4.4). Først, rense 45 dem (afsnit 4.2). Endelig udveksle bufferen (afsnit 4.3) for at undgå høj baggrundsstøj under massespektroskopi.
    BEMÆRK: Afsnittene 3.4.1, 3.4.2 og 3.4.3 fører til typiske cellefrie reaktionsbetingelser 34: 8,9-9,9 mg / ml protein (fra rå ekstrakt), 4,5-10,5 mM Mg-glutamat, 40-160 mM K-glutamat, 1 mM af hver aminosyre, bortset leucin, 0,83 mM leucin, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP og GTP, 0,9 mM CTP og UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP , 0,068 mM folinsyre, 1 mM spermidin, 30 mM 3-PGA, 2% PEG-8000 og 10 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500. Om ønsket kan udføres en anden procedure af cellefri reaktion præparat, der fører til reaktionsbetingelserne ovenfor.
le "> 4. Indledende Evaluering via SDS-PAGE 43,44 og Forberedelse af Cellefrie Udtrykt Model Proteiner til HPLC-ESI-massespektrometri

  1. SDS-PAGE af de cellefrie reaktioner
    BEMÆRK: Udfør denaturerende SDS-PAGE for en hurtig og foreløbig analyse af de udtrykte proteiner uden yderligere rensning eller udvinding, og udføre følgende trin.
    1. Optø proteinstandarden på is. Sikre, at det består af proteiner med molekylvægte svarende til det udtrykte model protein for dens lokalisering på gelen (trin 4.1.13).
      BEMÆRK: Her anvendes standard giver proteiner over et bredt område af molekylvægte (myosin: 212 kDa, maltose-bindende protein, β-galactosidase: 158 kDa, β-galactosidase: 116 kDa, phosphorylase b: 97 kDa, serumalbumin : 66 kDa, glutaminsyre dehydrogenase: 56 kDa, maltose-bindende protein-: 43 kDa, thioredoxin reduktase: 35 kDa, triosephosphatisomerase: 27 kDa, trypsin inhibitor: 20 kDa, lysozyme: 14 kDa, aprotinin: 7 kDa, insulin A: 3 kDa, B-kæde: 2 kDa).
    2. Da cellefrie reaktioner er let viskøs skyldes koncentrationen højt proteinindhold, fortyndes dem med sterilt dobbeltdestilleret 2 O 5 - 10 gange før SDS-PAGE for at sikre passende gel migration og for at undgå mætning efter farvning. For ikke at spilde for meget prøve, fortyndes 1 ml af cellefri reaktion i 4 pi sterilt Hedeselskabet 2 O. Forbered fortynding i reagensglas, grundigt vortex og kort dreje væsken ned med en mini centrifuge til 2 - 3 sek ved 2.000 x g.
    3. Tilsæt 5 pi 2x loading buffer til 5 pi fortyndet cellefri reaktion. Grundigt vortexes og spin ned med en mini centrifuge til 2 - 3 sek ved 2.000 x g.
      BEMÆRK: Her efter tilsætning, er biomolekylerne opløst i 62,5 mM Tris / Cl -, 10% glycerol, 2% SDS og 0,0025% bromphenolblåt ved pH 6,8, en typisk sammensætning. Brug af andre lastning farvestoffer, der fører til lidt anderledes fortynding cold kan være egnede.
    4. Grundigt vortexes proteinstandarden og overføre 15 pi den ind i et reaktionsrør.
      BEMÆRK: Afhængigt af gel størrelse og for andre protein-standarder, kan den anbefalede mængde afviger fra ovenstående.
    5. Placer reaktionsrørene i en varmeblok. Kontroller, om lågene af rørene er lukket korrekt. Varme ved 95 - 100 ° C i 3 - 5 min. Gør dette for at denaturere proteinerne og for at SDS-indpakning omkring protein backbone.
      BEMÆRK: Visse proteinstandarder må ikke opvarmes, se leverandørens anvisninger.
    6. I mellemtiden overføre løbebufferen ind i gelelektroforese kammeret. Indholdet af 1x løbende buffer er 25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS ved pH 8,3 (med HCI).
    7. Fastgør færdigstøbte 4 - 20% gradient Tris-glycin-SDS-gel (10 cm x 10 cm x 1 mm) til elektroforese kammeret. Fjern kammen og skyl brøndene med en sprøjte fyldt med løbebuffer.
      BEMÆRK: gel-koncentration Strøngly afhænger af størrelsen og arten af ​​det udtrykte model protein. Ovenstående koncentration adskiller E. coli råekstrakt proteiner samt lav molekylvægt model proteiner. Self-cast geler er egnede.
    8. Fjern rørene fra varmeblokken. Spin væsken ned med en mini centrifuge til 2 - 3 sek ved 2.000 x g. Kort vortex og gentag spinning ned til 2 - 3 sek ved 2.000 x g.
    9. Overfør 15 pi protein standard (24 - 48, ug protein) og 10 pi (11 - 22 ug protein) af hver prøve i brøndene og start elektroforese. Her er SDS-PAGE udført ved 125 V og 20 - 40 mA i ca. 90 min, en typisk protokol.
    10. Træk forsigtigt gelen fra kassetten. Overfør det ind fastsættelse (50% methanol, 10% eddikesyre, 40% Hedeselskabet 2 O) i 30 min. ADVARSEL! Methanol er giftigt ved indånding og ved kontakt med huden. Bær beskyttelseshandsker og arbejde under en emhætte.
    11. Overfør gelen i farveopløsning (0,025% Coomassie brilliant blue G-250, 10% eddikesyre, 90% Hedeselskabet 2 O). Farv i 60 min.
    12. Overfør gelen i Affarvningsopløsningen (10% eddikesyre, 90% Hedeselskabet 2 O) i 60 - 120 min.
      BEMÆRK: Fastsættelse, farvning og affarvning stærkt afhænger af størrelsen og arten af ​​den udtrykte protein. Denne protokol finder anvendelse på en lang række proteiner af ret små molekylvægte 46.
    13. Fortrænge gel på en mat gennemsigtighed på en hvid baggrund, der genererer en passende kontrast til de farvede proteinbånd.
  2. Oprensning af His-mærket 45 modelproteiner fra cellefri reaktioner
    BEMÆRK: proteinoprensning, findes flere metoder, der leverer lignende resultater. Denne protokol renser cellefrie udtrykte model proteiner, som har et C-terminalt polyhistidin-tag (His-tag). Det bruger en oprensningskit egnet til proteiner, som expressed i de små reaktions- volumener cellefri proteinekspression. Den er identisk til oprensning af native eller modificerede model proteiner. Således er det generelt beskrevet på basis af en enkelt celle-fri reaktion.
    1. I en passende HPLC-ESI massespektroskopisk analyse, udtrække og oprense modelproteiner fra den cellefrie reaktion og udføre de følgende trin.
      1. Bland lige volumener af 90 - 150 pi His-bindingsbuffer og 90 - 150 pi cellefri reaktion. Pipettere op og ned, efterfulgt af forsigtig vortexbehandling.
        BEMÆRK: Brug hans-bindingsbuffer anbefales. Imidlertid kan cellefri reaktionsmedium være et udgangsmateriale, så længe model protein er opløseligt, pH er mellem 7,5 - 8 imidazol / His koncentration er <10 mM, koncentrationen af ​​stærke reduktionsmidler er <15 mm og ingen metal- chelateringsmidler er til stede. Hvis din blanding volumen overstiger 300 pi, dele det op i lige store mængder og alikvot disputatser mængder i forskellige reaction rør til følgende oprensningstrin.
      2. Forbered kolonnen systemet. Grundigt vortexes stamopløsningen af ​​His-affinitetsgel indtil gelen harpiksen er fuldstændigt opløst. Overfør 250 gi gel harpiks i kolonnen. Brug en 1 ml pipettespids til den viskøse gel harpiks. Kolonnen anbringes i et opsamlingsrør.
      3. Centrifuge søjle / samleværk rør i 5 - 10 sek ved 13.000 - 15.000 x g. Sørg for, at gelen harpiks er helt drænet. Hvis ikke, forlænge centrifugering tid med yderligere 5 - 10 sek, men være opmærksomme, at affinitet gel ikke over-tørret. Derfor forlænge centrifugeringen tid i trin 4.2.1.5, 4.2.1.7 og 4.2.1.9.
        BEMÆRK: Gelen harpiks er helt tømt, hvis det bliver stiv og ingen supernatanten forbliver på toppen.
      4. Overfør 150 - 300 pi af cellefri reaktion / His-bindingsbuffer til søjlen. Hvis blandingen volumen overskrider den anbefalede mængde, opdelt på flere spin-søjler. Resuspender gel harpiks ved frequent aflytning og blid vortexbehandling under en inkubationstid på mindst 2 minutter. For mængder på over 200 pi, inkuberes i yderligere 1 - 2 ud min.
        BEMÆRK: Tilstrækkelig inkubationstid er afgørende for binding af modellen proteiner til gelen harpiks.
      5. Centrifuge søjle / samleværk rør i 5 - 10 sek ved 13.000 - 15.000 x g. Kassér gennemløbet og placere søjlen tilbage i opsamlingsrøret.
      6. Tilføj 250 pi His-vaskebuffer. Resuspender gel harpiks ved at trykke og blid omhvirvling.
      7. Centrifuge søjle / samleværk rør i 5 - 10 sek ved 13.000 - 15.000 x g. Kassér gennemløbet og placere søjlen tilbage i opsamlingsrøret. Gentag trin 4.2.1.6 og centrifuger igen i 5 - 10 sek ved 13.000 - 15.000 x g.
      8. Kolonnen anbringes i en standard 1,5 ml reaktionsglas. Tilføj 150 pi elueringsbuffer og resuspender gelen harpiks ved at trykke og blid omhvirvling. Reducer lydstyrken til 100 pi for højere renset model protein contrationer efter eluering i det næste trin 4.2.1.9.
        BEMÆRK: Den samlede overflod af oprenset model protein kan nedsættes på grund af mulig ufuldstændig eluering af alle gel harpiksbundne proteiner, hvis elueringspufferen volumen reduceres.
      9. Centrifuge-søjle / reaktionsrør i 5 - 10 sek ved 13.000 - 15.000 xg for at fortynde det oprensede protein i elueringspufferen. Hvis delt før, pool alle løsninger i én stamopløsning.
      10. Før udførelsen af buffer udveksling, bestemme proteinkoncentrationen ved hjælp af standard metoder, f.eks, Bradford assay 47,48.
        BEMÆRK: For en passende HPLC-ESI massespektroskopi (afsnit 4.4), skal du bruge optimale proteinkoncentrationer, der normalt omkring 0,5 mg / ml med nødvendige mængder af 20 - 50 pi. Hvis koncentrationen er under 0,2 mg / ml, koncentrat proteinopløsningen efter bufferskift ved anvendelse af en spinning vakuumkoncentrator. I dette tilfælde, kan du læse første afsnit 4.3.8 til passende tilpasse udveksle buffis.
  3. Bufferskift til HPLC-ESI-massespektroskopi
    BEMÆRK: Udskiftning His-mærket elueringsbuffer at undgå høje baggrundsstøj i masse-spektroskopisk analyse på grund af høj koncentration af imidazol (> 150 mM) og andre salte, såsom NaH 2 PO4 (> 300 mM) eller NaCl (> 50 mM) 49. Den følgende puffer udvekslingsprotokol bruger prehydrated gelfiltrering spinkolonne system. Den er identisk henrettet for native eller modificerede model proteiner. Således er det generelt beskrevet på basis af en enkelt celle-fri reaktion. Bemærk, at der er andre nemme at udføre buffer exchange metoder, fx mini-dialyse patroner.
    1. Fremstilling af 100 ml af protein opbevaringsbuffer (50 mM Tris-CI pH 8, 100 mM NaCl og 10% glycerol). Afvejes i en autoklaverbar 100 ml flaske 605,7 mg Tris-base, 584,4 mg NaCl, og der tilsættes 10 ml glycerol. Fyld op til ca. 80 ml og juster pH-værdien til 8 ved endding NaOH. Støt kontrollere pH-værdien med et pH-meter. Endelig fylde op til 100 ml mærket.
      BEMÆRK: Brug denne buffer til at stabilisere en bred vifte af modelproteiner og ikke forstyrre massespektroskopisk analyse, så længe HPLC udføres forud for massespektroskopisk måling. Men afhængigt af beskaffenheden af ​​det udtrykte model protein, bruge andre buffere, der kan være bedre egnet. Hvis dit mål protein er ikke stabilt ved pH 8, justere pH i overensstemmelse hermed. Brug ikke højere koncentrationer glycerol.
    2. Varm op gelfiltrering spin-søjler i mindst 15 min til stuetemperatur.
    3. Resuspender prehydrated gel ved en let banken eller hvirvelblanding og fjerne luftbobler.
    4. Fjern først den nederste hætte, og derefter tage den øverste hætte væk. Kolonnen anbringes i en vask rør (mindst 2 ml). Overfør søjlen / vask rør i centrifugen. Hver søjle har en orientering varemærke. Centrifuger ved 1.000 xg i 2 min for at fjerne gelen opbevaringsbuffer. Discard gennemløbet.
      BEMÆRK: Vær opmærksom på fortsætte i denne rækkefølge. Sørg for, at kolonnen har den samme orientering i alle yderligere centrifugeringstrin.
    5. Tilføj op til 400 pi af protein opbevaringsbuffer. Centrifuger i 2 minutter ved 1.000 x g. Gentag dette helt at indlæse protein opbevaringsbuffer i gel. Derefter tilsættes forsigtigt op til 100 pi af opløsning af det oprensede model protein. Pipette umiddelbart i midten af ​​gelen sengen.
      BEMÆRK: Solution volumener oprensede proteiner, især af modificerede proteiner, kan være højere. Split sådanne løsninger over flere buffer bytningskolonner. Proteiner skal have molekylvægte højere end 5 kDa for denne form for buffer exchange.
    6. Kolonnen anbringes i en samling rør og centrifugeres i 2 minutter ved 1.000 x g.
      BEMÆRK: Dette trin fører til fortynding af det oprensede model protein i proteinet opbevaringsbuffer. Hvis delt før, pool alle løsninger i én stamopløsning.
    7. Flash fryse the proteinopløsning i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C eller direkte analysere det via HPLC-ESI massespektroskopi 50 (afsnit 4.4). ADVARSEL! Brug en Eyeshield og Cryo-handsker til at være beskyttet mod kvælstof stænk.
    8. Udfør følgende trin i protokollen til at koncentrere proteinet løsning med en spinning vakuumkoncentrator der omhyggeligt fordamper den 51 opløsningsmiddel.
      BEMÆRK: Disse trin er nødvendige, hvis proteinkoncentrationen er for lav til HPLC-ESI-massespektroskopi (<0,2 mg / ml). proteinkoncentration opløsningen volumen og model er omtrent den samme før og efter bufferudskiftning. Koncentrationen er beskrevet ved hjælp af følgende eksempel: Efter His-mærke oprensning modellen protein opløst i 100 pi Hans elueringsbuffer (trin 4.2.1.9), og har en koncentration på 0,07 mg / ml (trin 4.2.1.10) .
      1. For at sikre, at proteinkoncentrationen, og opløsningen volumen er efter fordampning vedmindst 0,2 mg / ml og 20 pi henholdsvis fortynde, før bufferudskiftning proteinet opbevaringsbuffer fremstillet i trin 4.3.1 mindst tredobbelt men højst femdobbelte. Ligeledes inddampes i følgende mindst to tredjedele (66.67 pi) eller højst fire femtedel (80 pi).
        BEMÆRK: Fortynding af proteinet opbevaringsbuffer før bufferen udveksling er afgørende at tage hensyn til, at koncentrationsværdier af denne puffer (trin 4.3.1) stadig er realiseret på trods af fordampning. Efter fortynding af proteinet storage buffer, først udføre buffer udveksling (trin 4.3.2 - 4.3.6), før du udfører følgende trin 4.3.8.2 - 4.3.8.4.
      2. Efter bufferudskiftning, sætte de komplette 100 pi model proteinopløsning i et åbent rør i den roterende vakuumkoncentrator.
        BEMÆRK: Modellen protein opløses i den fortyndede protein opbevaringsbuffer. Hælde mod rotation center at undgå væske-tab under rotation. Sikre, at en åben blanket med samme volumen afH2O er symmetrisk placeret til at afbalancere spinding system.
      3. Luk låget af koncentratoren og begynde rotation. For at sikre proteinstabilitet, koncentreres ved stuetemperatur eller ved lave temperaturer op til 30 ° C.
        BEMÆRK: Den anvendte koncentrator accelererer automatisk til 170 xg og fastlægger vakuum. I det følgende er det accelererer til sin maksimale hastighed på 240 x g.
      4. Ofte afbryde koncentrationen proces til undersøgelse af væskevolumen. Stop koncentrationen, når den resterende opløsning volumen er mellem 20 pi og 33 pi.
        BEMÆRK: Derfor tilpasser trin 4.3.8.1 - 4.3.8.4 for andre opløsningsvolumener (trin 4.2.1.9) og andre proteinkoncentrationer (trin 4.2.1.10). Flash fryse koncentrerede proteinopløsning i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C, eller direkte analysere dem via HPLC-ESI-massespektroskopi 50. FORSIGTIGHED! Bær en Eyeshield og Cryo-handsker til at være beskyttet mod kvælstof stænk.
  4. HPLC-ESI massespektrometrisk analyse 50 af modelproteiner
    1. Udfør HPLC-adskillelse af 5 - 15 pi proteinopløsning (fremstillet i afsnit 4.3) på en C5 omvendt fase-søjle (3 um, 100 x 2,1 mm) med en gradient på 20% - 90% acetonitril og 0,1% myresyre over 25 min og efterfølgende ESI-massespektrometri med detektion på en time-of-flight mass analysator i området fra 300 - 3.000 m / z.
      BEMÆRK: Afhængigt af arten af ​​det udtrykte model protein, andre opløsningsmidler eller kolonner, der kunne være bedre egnet.
    2. Deconvolute målt massespektre anvendelse af passende software 52 at beregne nul-charge masser.

Representative Results

Denne protokol guider gennem cellefri rest-specifikke inkorporering af ncAAs i modelproteiner. Den foreslår SDS-PAGE til en foreløbig evaluering af inkorporeringen eksperimentet og yderligere skridt til at forberede modellen proteiner til en passende HPLC-ESI masse spektroskopisk analyse.

Her bliver repræsentative resultater af cellefri rest-specifikke inkorporering af Arg-analog, samt Lys analoge L-hydroxy-lysin (Hyl) fremlagt. De forskellige aminosyreopløsninger, energibufferen, er vektor-DNA'et koder for modelprotein og cellefrie reaktioner fremstillet som beskrevet ovenfor. Henvisningen cellefri reaktion er forsynet med aminosyreopløsningen bestående af de 20 CAAS. For hvert eksperiment er en negativ kontrol cellefrit reaktion følger med aminosyreopløsning, som mangler den kanoniske analog af NCAA pågældende. For hver ca.oach, en cellefri reaktion udtrykker model protein i nærvær af aminosyreopløsningen, hvor CAA er substitueret med den noncanonical analog. His-mærke oprensning, buffer udveksling og HPLC-ESI massespektrometrisk analyse udføres i henhold til den ovenfor beskrevne protokol.

Modellen protein er det C-terminale His-mærket deGFP 32, en trunkeret version af EGFP 53. Dets en skrivelse aminosyresekvens kan findes i (supplerende materiale 2). Denne model protein indeholder 6 Arg og 18 Lys i foretagender. Ekspressionsvektoren er pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500.

I tilfælde af fuldstændig inkorporering af NCAA, kan man antage, at den negative kontrolreaktion ikke udtrykker deGFP, da en af ​​de 20 CAAS mangler. Tværtimod skal deGFP kunne påvises i de to andre reaktioner: den indfødte en i Refeærbødighed cellefri reaktion og det modificerede protein i den cellefrie reaktion, der er forsynet med NCAA.

Figur 1A viser den foreløbige SDS-PAGE evaluering af Can inkorporering eksperimentet. Henvisningen cellefrie reaktion har den højeste deGFP ekspressionsniveau. I cellefri reaktion, der er forsynet med Can, er deGFP udtrykkes ved lidt lavere koncentration. Nr deGFP ekspression kan påvises i den negative kontrol. Denne SDS-PAGE Resultatet er en god indikation for en vellykket inkorporering af Can ind målproteinet deGFP.

For at bevise den hypotese fuldstændig inkorporering af Can ind deGFP begge oprensede model proteiner, visualiseres i figur 1B, analyseres gennem HPLC-ESI massespektroskopi. Figur 1C viser den deconvoluted masse spektre af de rensede deGFP molekyler. Den deconvoluted masse degF P, der udtrykkes i referencen cellefrie reaktion er 26,192.8 Da. For deGFP udtrykkes i Can indeholder celle-fri reaktion en masse på 26202,5 ​​Da vises. De forventede masser for det native deGFP6Arg og den modificerede deGFP6Can med Arg bliver delvis erstattet af Can er 26.193 Da og 26.204 Da. Massen forskel på 1,5 Da for deGFP6Can er inden fejlen af ​​frekvenser udfoldning. Således er den fulde integration af Can ind deGFP på alle 6 Arg positioner bekræftet.

De to toppe af reduceret intensitet svarer til den indfødte deGFP6Arg og modificerede deGFP6Can, der ikke opnår deres modne fluorophor. Fluoroforen autokatalytisk frembragt ved eliminering af et H2O molekyle, efterfulgt af oxidation. Dette fører til en masse steg med 20 Da, hvis denne proces ikke fortsætte.

pg "/>
Figur 1. SDS-PAGE evaluering af Kan inkorporering eksperimentet og HPLC-ESI massespektroskopi af cellefri udtrykt og oprenset deGFP molekyler. (A) Indledende evaluering af Can inkorporering eksperimentet under anvendelse af SDS-PAGE. Fra venstre til højre: Protein standard, henvisning cellefri reaktion, negativ kontrol og cellefrit reaktion leverer Can stedet for Arg. (B) SDS-PAGE efter His-tag rensning og buffer udveksling af de udtrykte deGFP molekyler. Fra venstre til højre: Protein standard, oprenset deGFP fra referencen reaktion, oprenset deGFP fra Can indeholdende reaktion. (C) Bekræftelse af fuld integration af Can ved HPLC-ESI massespektroskopi. De forventede masse af det native deGFP og den modificerede deGFP med Arg delvis erstattet af Can er 26.193 Da og 26.204 Da. Hvert spektrum normaliseres til sin højeste intensitet (tællinger). Toppositioner er angiveti Da. For visualiseringsformål, er gelbanerne ekstraheret fra gelen billeder, sammenføjet, omdannes til grå skala format, er størrelse optimeres og kontrast samt lysstyrke øges. Originale gel baner præsenteres i supplerende materiale 3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2A viser den foreløbige SDS-PAGE evaluering af Hyl inkorporering eksperimentet. I cellefri reaktion, der er forsynet med Hyl, er deGFP udtrykkes. I modsætning til det første forsøg, kan en svag deGFP bånd iagttages i den negative kontrol reaktion. Dette kan skyldes Lys-rester i de cellefrie reaktioner. Dette muliggør en svag deGFP udtryk i den negative kontrol reaktion, hvor hverken Lys eller Hyl tilsættes.

for H PLC-ESI massespektroskopi, de deGFP molekyler af cellefri reaktion forsynet med Hyl oprenses og bufferen udskiftes (figur 2B).

Figur 2
Figur 2. SDS-PAGE evaluering af Hyl inkorporering eksperiment (A) Fra venstre til højre:. Negativ kontrol cellefri reaktion, cellefri reaktion indeholdende Hyl og protein standard. (B) SDS-PAGE efter His-tag rensning og buffer udveksling af de udtrykte deGFP molekyler. Fra venstre mod højre: Oprenset deGFP fra Hyl indeholdende reaktionen og protein standard. For visualiseringsformål, er gelbanerne ekstraheret fra gelen billeder, sammenføjet, omdannes til grå skala format, er størrelse optimeres og kontrast samt lysstyrke øges. Originale gel baner præsenteres i supplerende materiale 3.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 viser deconvoluted massespektret af oprensede deGFP molekyler. Figur 3A bekræfter hypotesen om allerede er til stede Lys-rester i de cellefrie reaktioner. Den dominerende top i spektret svarer til det native deGFP (forventet masse: 26.193 Da). Igen kan detekteres deGFP molekyler af et 20 Da højere masse, der ikke udvikler deres fluorofor. De Lys-rester er fortrinsvis fyldt på tRNA Lys ved lysyl-tRNA-syntetase, der fører til et højt ekspressionsniveau af de native deGFP18Lys.

Massen forskel mellem Hyl og Lys er 16 Da. På grund af tilstedeværelsen af ​​Hyl, der er i konkurrence med de Lys-rester alle mulige deGFP arter er genereret (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (figur 3B). Ganske vist toppen af deGFP1Hyl + 17Lys overlapper toppen af indfødte deGFP der ikke producere sin fluorophor (figur 3A) og massen af nogle toppe afviger mere end 2 Da fra det forventede masse. Disse masse forskelle kan tilskrives høj støj på grund af lave mængder af deGFP arter. Imidlertid er Hyl inkorporeres generelt af cellefrit system. Yderligere forbedringer skal gøres for at afskaffe Lys-rester i de cellefrie reaktioner.

Figur 3
. Figur 3. HPLC-ESI massespektroskopi af de oprensede deGFP molekyler af cellefri reaktion indeholdende Hyl (A) De native deGFP18Lys overvejende detekteret (forventede masse: med fluorofor 26.193 Da, uden modne fluorofor 26.213 Da). (B)Forstørrelse viser, at der af alle mulige deGFP arter (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Forventede masser er 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). Spektret er normaliseret til sin højeste intensitet (tællinger). Peak positioner er angivet i Da. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 1

Supplerende materiale 1. Beregning skabelon. I afsnit 2 er udarbejdelsen af den energi buffer mester mix eksemplificeret ved hjælp af rå ekstrakt portioner af 30 pi og optimal Mg- og K-glutamat koncentrationer af henholdsvis 3 mM og 30 mM. Dette eksempel fører til en master mix volumen, der giver 3 energi buffer portioner. I section 3, er udarbejdelsen af cellen uden reaktion eksemplificeret ved hjælp af en 90 nM DNA stamopløsning, der fører til en optimal vektor-DNA-koncentration på 10 nM i cellen uden reaktion. Klik her for at downloade denne fil.

I en passende sporbarhed, er brugen af ​​beregning skabelon eksemplificeret ved indsættelse af disse typiske værdier, der afviger fra ovenstående eksempel: Rå ekstrakt Volume: 28 pi, optimal Mg-glutamat: 2 mM, optimal K-glutamat: 40 mM, antal af ønskede puffersystemer portioner: 100, koncentration optimal vektor i cellefri reaktion: 8 nM, DNA-vektor stamopløsning: 150 nM.

Først indtaste 28 pi som råekstrakt volumen i den orange felt af den første skabelon sektion. Indtast derefter ind i den anden skabelon sektion 2 mM end 40 mM så optimale Mg- og K-glutamat koncentrationer i de orange felter. Under hensyntagen til den optimale Mg- og K-koncentrationer, sammensætningen af ​​en 15 pi energi buffer, samt en tilsvarende, skaleret op 16 pi alikvot beregnes. Nedenfor derfor indtaste 100 som ønsket antal energi buffer portioner (16 pl). Skabelonen tilpasser mængderne af de forskellige buffer komponenter til 1700 pi mester mix som følger: 204 pi af 100 mM Mg-glutamat stamopløsning, 136 pi 3 M K-glutamat stamopløsning, 728.73 pi 14x energiløsning, 510 pi 40% PEG-8000 og 121,27 pi sterilt Hedeselskabet 2 O. Endelig i tredje skabelon sektionen, indtast 8 nM og 150 nM som koncentration optimal vektor i cellen-fri reaktion og henholdsvis vektor-DNA-stamopløsning koncentration. Skabelonen tilpasser mængderne af de forskellige komponenter, der skal føjes til de 28 pi rå ekstrakt at færdiggøre udarbejdelsen af ​​en 90 picellefri reaktion som følger: 15 pi energi puffer, 15 pi en af de 3 andet organ aminosyreopløsninger, 4,80 pi vektor-DNA-opløsning (150 nM) og 27.20 pi sterilt Hedeselskabet 2 O.

Figur 2
Supplerende Materiale 2. Et brev aminosyresekvens af modellen protein deGFP. Denne model protein indeholder 6 Arg og 18 Lys positioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Supplerende materiale 3. Fuld længde og umodificerede gelbaner der svarer til gelen billeder præsenteret figur 1 og 2. gelbanerne præsenteret i hvert enkelt s ubfigure ekstraheres fra den samme SDS-polyacrylamidgel. I figur 1 og 2 disse baner blev sat sammen med henblik på fremvisning. Molekylvægte for de standard protein bands er angivet ved siden af ​​tallene. (A.1) Ukuperede gel baner af figur 1A. Fra venstre til højre: Protein standard, henvisning cellefri reaktion, negativ kontrol og cellefrit reaktion leverer Can stedet for Arg. (A.2) Ukuperede gelbaner af figur 1B. Fra venstre til højre: Protein standard, oprenset deGFP fra referencen reaktion, oprenset deGFP fra Can indeholdende reaktion. (B.1) Ukuperede gelbaner af figur 2A. Fra venstre mod højre: Negativ kontrol cellefri reaktion, cellefri reaktion indeholdende Hyl og protein standard. (B.2) Ukuperede gel baner af figur 2B. Fra venstre mod højre: Oprenset deGFP fra Hyl indeholdende reaktionen og protein standard.d / 54.273 / 54273supfig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

An-nem at bruge celle-frit ekspressionssystem som en levedygtig strategi til rest-specifikt indarbejde ncAAs i proteiner, præsenteres. Til dette formål er det rå ekstrakt suppleret med vektor-DNA der koder for proteinet af interesse, energibufferen og de tilsvarende aminosyrer. Bemærk, at den rå ekstrakt aliquot volumen afhænger af den rå ekstrakt proteinkoncentrationen 34. Den cellefrie ekspression effektivitet optimeres afhængigt af vektor-DNA-konstruktion koncentration. Mængden af ​​energi bufferkomponenter variere som funktion af optimerede Mg- og K-glutamat koncentrationer for at give høje udbytter af det cellefrie udtrykt model protein.

Der kan opnås en foreløbig evaluering af inkorporeringen eksperimentet ved at udføre SDS-PAGE af det urensede cellefri reaktionsmedium. For en mere detaljeret analyse, er HPLC-ESI massespektroskopi foreslået som et middel til at kontrollere for fuldstændig, rest-specifikke INCORperforering af NCAA. Som forberedelse til den sidstnævnte, er spin-kolonne-systemer bruges til at aktivere His-tag rensning og buffer udveksling med de små mængder, som vi bruger i denne protokol.

Herunder HPLC-ESI-massespektroskopi, kan hele protokollen foretages indenfor 2 dage. Det omfatter ikke særligt kritiske trin. Men koncentration optimeringer af Mg- og K-glutamat samt af vektor-DNA er afgørende for at udtrykke høje udbytter af modelprotein,. Brugen af ​​højeffektive ekspressionsvektor pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 anbefales kraftigt. Eluering af His-mærkede proteiner er normalt på grund af høj koncentration af imidazol (> 150 mM) og andre salte, såsom NaH 2 PO4 (> 300 mM) eller NaCl (> 50 mM), der genererer høj baggrundsstøj i massespektroskopisk analyse 49 . Udveksling af sådanne elueringspuffere med en passende protein opbevaring buffer stabiliserer model protei og drastisk reducerer baggrundsstøj under masse spektroskopisk analyse.

Som følge heraf kan erstatter Arg ved alle seks positioner i modelprotein. I ekspressionssystemet, kan påvises nogen Arg-rester. Dette simplificerer rest-specifikke inkorporering af Arg-analoger sammenlignet med andre ekspressionssystemer, der kræver yderligere udtynding strategier 29,30. Den præsenterede celle-fri tilgang omgår de iboende begrænsninger in vivo metoder, der skyldes Can toksicitet, eller den stærke afhængighed af mRNA sekvens i enkelt protein produktionsstrategier 24,31. I modsætning til den anvendte in vitro system, at in vivo spaltning af Can homoserin og hydroxyguanidine sker 31.

Imidlertid bibeholder en tilstrækkelig mængde af Lys til at konkurrere med analoger, såsom Hyl, det cellefrie system. HPLC-ESI massespektroskopisk analyse viser, at modellen protein indeholder både den Canonical samt noncanonical analogen i forskellige forhold. Resten-specifikke inkorporering af Lys er muligt i almindelighed, men for komplet udskiftning, yderligere udtynding strategier, eller specielt konstruerede Aars og tRNA optimeret til anerkendelse af ncAAs skal udvikles.

Vi opnåede fremragende udbytter af cellefrie udtrykte, modificerede model proteiner ved tilsætning af NCAA i samme koncentration som de kanoniske dem. Inkorporeringseffektiviteten afhænger af arten af ​​NCAA skal indarbejdes. Selv højere udbytter måske stadig kunne realiseres ved at optimere koncentrationen af ​​NCAA.

De præsenterede resultater viser anvendeligheden af ​​den anvendte system til resten-specifikke inkorporering af ncAAs så længe de er accepteret af den kanoniske endogene translationel system. For resten-specifikke inkorporering af specifikke ncAAs, til et yderligere behov kontrollere, om resterne af den analoge CAA disturb udtrykket systemet.

Cellefri transskription-translationssystemer kan konstrueres fra forskellige organismer til at reagere på forskellige krav 54. Den helt E. coli transkription-oversættelse machineries af her præsenterede cellefrit system muliggøre brugen af bakteriofag og E. coli initiativtagere, og de ​​kan virke parallelt eller efter hinanden i kaskader 55. Den generelle anvendelighed og brugervenlighed gør metoden en potent værktøj til yderligere forskning i aminosyre toksicitet og terapeutisk anvendelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20% precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5,000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8%) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99% VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1 mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5 ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1 L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4 L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 1 L bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or equivalent shaker able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or equivalent 5,000 x g rotor for the centrifuge above, able to centrifuge 1 L bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or equivalent heating block able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C.
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2,500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or equivalent vortex.
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or equivalent ice flaker machine.
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or equivalent incubator able to heat samples at 29 °C.
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or equivalent electrophoresis chamber able to perform vertical gel electrophoresis with the above precast gels or other gels used.
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or equivalent power supply able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1,000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or equivalent microplate reader able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Böck, A., et al. Selenocysteine: the 21st amino acid. Mol. Microbiol. 5 (3), 515-520 (1991).
  2. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine Encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding Specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  3. Budisa, N. Prolegomena to Future Experimental Efforts on Genetic Code Engineering by Expanding Its Amino Acid Repertoire. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, 6426-6463 (2004).
  4. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the Genetic Code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  5. Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014).
  6. Neumann, H. Rewiring translation - Genetic code expansion and its applications. FEBS Lett. 586 (15), 2057-2064 (2012).
  7. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  8. Goerke, A. R., Swartz, J. R. High-Level Cell-Free Synthesis Yields of Proteins Containing Site-Specific Non-Natural Amino Acids. Biotechnol. Bioeng. 102 (2), 400-416 (2009).
  9. Albayrak, C., Swartz, J. R. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 41 (11), 5949-5963 (2013).
  10. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  11. Xiu, X., Puskar, N. L., Shanata, J. A. P., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Nicotine binding to brain receptors requires a strong cation-pi interaction. Nature. 458 (7237), 534-537 (2009).
  12. Grünewald, J., et al. Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (11), 4337-4342 (2009).
  13. Nikić, I., Lemke, E. A. Genetic code expansion enabled site-specific dual-color protein labeling: superresolution microscopy and beyond. Curr. Opin. Chem. Bio. 28, 164-173 (2015).
  14. Munier, R., Cohen, G. N. Incorporation d'analogues structuraux d'aminoacides dans les protéines bactériennes. Biochim. Biophys. Acta. 21 (3), 592-593 (1956).
  15. Lepthien, S., Merkel, L., Budisa, N. In Vivo Double and Triple Labeling of Proteins Using Synthetic Amino Acids. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (32), 5446-5450 (2010).
  16. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  17. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat. Neurosci. 13 (7), 897-905 (2011).
  18. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  19. Hoesl, M. G., et al. Lipase Congeners Designed by Genetic Code Engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  20. Bae, J. H., et al. Expansion of the Genetic Code Enables Design of a Novel "Gold" Class of Green Fluorescent Proteins. J. Mol. Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  21. Schachtele, C. F., Rogers, P. Canavanine death in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 14 (2), 474-489 (1965).
  22. Rosenthal, G. A. The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine. Q. Rev. Biol. 52 (2), 155-178 (1977).
  23. Rosenthal, G. A., Dahlman, D. L. Incorporation of L-Canavanine into Proteins and the Expression of Its Antimetabolic Effects. J. Agric. Food Chem. 39 (5), 987-990 (1991).
  24. Ishida, Y., Park, J. H., Mao, L., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Replacement of All Arginine Residues with Canavanine in MazF-bs mRNA Interferase Changes Its Specificity. J. Biol. Chem. 288 (11), 7564-7571 (2013).
  25. Thomas, D. A., Rosenthal, G. A., Gold, D. V., Dickey, K. Growth Inhibition of a Rat Colon Tumor by L-Canavanine. Cancer Res. 46 (6), 2898-2903 (1986).
  26. Bence, A. K., Worthen, D. R., Adams, V. R., Crooks, P. A. The antiproliferative and immunotoxic effects of L-canavanine and L-canaline. Anticancer Drugs. 13 (3), 313-320 (2002).
  27. Bence, A. K., Crooks, P. A. The Mechanism of L-Canavanine Cytotoxicity: Arginyl tRNA Synthetase as a Novel Target for Anticancer Drug Discovery. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 18 (5), 383-394 (2003).
  28. Akaogi, J., et al. Role of non-protein amino acid L-canavanine in autoimmunity. Autoimmun. Rev. 5 (6), 429-435 (2006).
  29. Singh-Blom, A., Hughes, R. A., Ellington, A. D. An amino acid depleted cell-free protein synthesis system for the incorporation of non-canonical amino acid analogs into proteins. J. Biotechnol. 178, 12-22 (2014).
  30. Oh, S. -J., Lee, K. -H., Kim, H. -C., Catherine, C., Yun, H., Kim, D. -M. Translational Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids in a Cell-free Protein Synthesis System. Bioprocess. Eng. 19 (3), 426-432 (2014).
  31. Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Cell-free expression with the toxic amino acid canavanine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25 (17), 3658-3660 (2015).
  32. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4 (8), (2010).
  33. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol. Bioeng. 112 (8), 1663-1672 (2015).
  34. Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762 (2013).
  35. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  36. JoVE Science Education Database. Molecular Cloning. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2015).
  37. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  38. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  39. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  40. Moreno, L. A., Cox, K. L. Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye. J. Vis. Exp. (45), e2465 (2010).
  41. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2699 (2010).
  42. Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699 (2011).
  43. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  44. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2015).
  45. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  46. Schägger, H., Aquila, H., Von Jagow, G. Coomassie blue-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for direct visualization of polypeptides during electrophoresis. Anal. Biochem. 173 (1), 201-205 (1988).
  47. Bradford, M. M. A Rapid Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  48. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), e1918 (2010).
  49. Hurst, R., Kobs, G., Johnson, T. Mass Spectrometric Analysis of MagneHis Purified Proteins. Promega Corporation Web site. , http://www.promega.de/resources/pubhub/enotes/mass-spectrometric-analysis-of-magnehis-purified-proteins/ (2003).
  50. Banerjee, S., Mazumdar, S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. Int. J. Anal. Chem. 2012, 1-40 (2012).
  51. Fujiwara, K., Nomura, S. M. Condensation of an additive-free cell extract to mimic the conditions of live cells. PLoS One. 8 (1), e54155 (2013).
  52. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  53. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S. R., Huang, C. C. Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence. J. Biol. Chem. 272 (45), 28545-28549 (1997).
  54. Gagoski, D., Polinkovsky, M. E., Mureev, S., Kunert, A., Johnston, W., Gambin, Y., Alexandrov, K. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol. Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  55. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1 (1), 29-41 (2012).

Tags

Molekylærbiologi Cell-Free Expression Noncanonical Amino Acid Analog Rest-Specific Indarbejdelse L-Arginin Analog L-canavanin Bioengineering Syntetisk biologi, naturlig aminosyre
Rest-specifikke Inkorporering af Noncanonical Aminosyrer i Model Proteiner Brug en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cellefri transskription-translationssystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Worst, E. G., Exner, M. P., De… More

Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. J. Vis. Exp. (114), e54273, doi:10.3791/54273 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter